專利名稱：一種cd133高表達鼠肝腫瘤細胞系及制備方法
技術領域：
本發明涉及一種腫瘤細胞治療領域，具體涉及一種高表達CD133的鼠肝腫瘤細胞系及其制備方法。
背景技術：
近年來，越來越多的研究表明，在腫瘤細胞中存在一部分占極少比例的干細胞群， 被稱為腫瘤干細胞(cancer stem cells, CSCs)，這群細胞在腫瘤治療抗性、復發和惡性轉移中起關鍵作用。腫瘤干細胞具有與普通干細胞相似的無限增殖、自我更新等能力；表達干細胞的標志，如⑶133、EpCAM、ra44、OT90、raM、CXCR4、ALDHl等；表達調節干性相關因子，如NotCh、aiiil、0Ct4、Nanog等。腫瘤干細胞雖然數量稀少，但是卻具有高致瘤性并維持腫瘤生長與轉移。原代分離的腫瘤細胞中，僅表達干細胞標志的少數細胞能夠啟動腫瘤的發生、發展。因此，靶向清除CSCs應該是今后有效治療腫瘤的最佳策略。為此，需要一個較好的研究CSCs的工具，以研究腫瘤發生及發展的機理并開發靶向CSCs的藥物。肝癌是目前人類比較常見的腫瘤之一，其發病率在全世界范圍內排第六位，而其死亡率則排在第三位。我國是肝癌的高發區，而且近年其發病率呈上升趨勢。因此建立可靠有效的研究肝癌發生及發展的機制、開發有效靶向肝癌干細胞的治療藥物的肝癌研究工具成為當前急需解決的問題。目前，肝癌模型的建立主要有化學藥物誘導、基因改造以及小鼠體內接種肝癌細胞等方法。化學藥物誘導形成肝腫瘤的方法存在實驗周期長、個體差異性大以及相關基因不明晰等問題；特定基因改造后的小鼠也可產生肝癌，雖然這種模型的分子機制明確，但是存在建立或引進動物品系困難以及實驗周期長等缺點；在小鼠體內接種肝癌細胞是一種操作簡單易行的方法，但是缺少細胞發生轉化繼而形成腫瘤的完整癌變過程。Zender L等人通過在胚胎肝前體細胞中導入癌基因信號使其可形成肝癌，這種動物模型具有相對完整的細胞轉化及腫瘤形成的過程、且實驗周期短等特點，有利于對肝癌相關基因或信號通路的研究。但是這種導入癌基因信號的胚胎肝前體細胞中所含表達干細胞標志物CD133的腫瘤干細胞數量稀少，對于有效研究CSCs在肝癌發生及發展過程中的作用存在較大的局限性?？v觀國內外，目前缺少良好的研究肝癌干細胞在肝癌發生及發展過程中的作用的實驗平臺。

發明內容
本發明所要解決的技術問題之一是針對目前腫瘤細胞系中表達干細胞標志物 ⑶133的腫瘤干細胞數量稀少的問題，提供一種高表達⑶133的鼠肝腫瘤細胞系LPC-H12， 該腫瘤細胞系已于2010年12月8日保藏于中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號為CCTCC No. C2010115，生物材料樣品名稱小鼠肝腫瘤細胞LPC-H12，保藏單位地址中國.武漢.武漢大學。本發明所要解決的技術問題之二是提供一種高表達CD133的鼠肝腫瘤細胞系的制備方法
作為本發明所要解決的技術問題之一，一種高表達CD133的鼠肝腫瘤細胞系 LPC-H12可以通過以下技術方案來實現在p53-/_小鼠胚胎肝細胞中導入癌基因Hras后，通過單克隆打板技術得到源于 ⑶133+細胞的單細胞克隆群，最后通過篩選建立含高比率⑶133+細胞亞群的鼠肝腫瘤細胞系。具體技術方案如下建立⑶133高表達的鼠肝腫瘤細胞系a)分離p53-/_小鼠胚胎肝細胞(LPC細胞)取E13. 5d的p53_/_小鼠胚胎，在PBS 中漂洗2-3次；用無菌眼科剪及鑷子完整剪取其肝臟。將其剪碎后，加入肝臟消化液于37°C 消化30min成單細胞懸液。離心去上清，用PBS洗2_3次，將細胞與大鼠抗小鼠E-cadherin 單抗一起4°C孵育30min (所用抗體量為如g E-cadherin/l X IO7個細胞)。用PBS洗2_3 次，離心去上清，將細胞與羊抗大鼠的磁珠(20ul/lX108細胞)一起4°C孵育15min。最后采用磁珠分選系統(MACS)分離出E-cadherin+胚胎肝細胞。分離出的細胞接種于預先鋪有明膠的細胞培養皿中，采用含10%胎牛血清、0.0說尼古丁、10_711101/1地塞米松、1\1丁5、 IX 巰基乙醇、40ng/ml 的 HGF、20ng/ml 的 EGF、100U/ml 青霉素、100ug/ml 鏈霉素的 DMEM/ F12培養液，于37°C、5%二氧化碳/95%空氣的恒溫培養箱中進行培養。b)MSCV-IRES-GFP-Hras (MIG-Hras)逆轉錄病毒的制備按照 invitrogen 公司 lipofectAMINE 2000 Reagent說明書提供的參考方法進行操作，將MIG-Hras質粒轉染包裝細胞Ecotropic中，培養48及7 后分別收集病毒上清。c) LPC-H鼠肝腫瘤細胞系的建立感染LPC細胞前一天，將LPC細胞接種于預先鋪有明膠的對孔板中(5X103個細胞/孔)。感染時去培養液，加入b)中的病毒上清，每隔 8h更換一次病毒上清，持續感染Mh。去病毒，加入新鮮細胞培養液，隔天換液，每三天傳代一次。收集1 X IO5 1 X IO7的細胞通過流式分選帶GFP熒光的細胞，于新鮮細胞培養液中擴大培養。d)含高比率⑶133+細胞亞群并具有高致瘤性的鼠肝腫瘤細胞系的建立將LPC-H 鼠肝腫瘤細胞系培養至對數生長期，用0. 25%胰酶+0. EDTA消化后，PBS洗滌兩次， 取IXlO5 IXlO7的細胞放入流式管中，離心去上清，加入100 μ 1的10%山羊血清懸浮細胞，4°C封閉lOmin。隨后加入帶PE熒光的小鼠CD133抗體(0. 5mg/ml) 2. 5ul，4°C孵育 30min。用FACS緩沖液(PBS+0. 5% BSA)洗滌兩次，棄上清，加入Iml細胞培養液，通過流式分選儀將單個帶GFP熒光、CD133+的LPC-H細胞打入加有新鮮細胞培養液的96孔板中。 于37°C、5%二氧化碳/95%空氣的恒溫培養箱中進行培養。7-14d后，待各單個細胞擴增起來后，移入M孔板中繼續培養。待細胞生長至生長對數期，各單克隆取一部分細胞進行 ⑶133表達的檢測，篩選得到高表達腫瘤干細胞標志物⑶133的鼠肝腫瘤細胞系LPC-H12。通過BD流式分析儀進行檢測，本發明所述的CD133高表達的鼠肝腫瘤細胞系 LPC-Hl2對干細胞標志物⑶133及EpCAM的表達量均高于初始LPC-H細胞系。通過RT-PCR方法證實，本發明所述的⑶133高表達的鼠肝腫瘤細胞系LPC-H12表達多種干細胞相關基因，諸如 Alb、AFP、CK19、Bmi 1、ALDHlal、SOXl、Nanog、Notchl。通過體外球體形成實驗，本發明所述的⑶133高表達的鼠肝腫瘤細胞系LPC-H12 具有高體外成球能力。
通過測量對比本發明與LPC-H，本發明LPC-H12細胞成瘤率為100%，腫瘤生長速度明顯高于LPC-H。作為本發明所要解決的技術問題之二，一種高表達CD133的鼠肝腫瘤細胞系的制備方法具體步驟如下a)分離p53-/_小鼠胚胎肝細胞(LPC細胞)取E13. 5d的p53_/_小鼠胚胎，在PBS 中漂洗2-3次；用無菌眼科剪及鑷子完整剪取其肝臟。將其剪碎后，加入肝臟消化液于37°C 消化30min成單細胞懸液。離心去上清，用PBS洗2_3次，將細胞與大鼠抗小鼠E-cadherin 單抗一起4°C孵育30min (所用抗體量為如g E-cadherin/l X IO7個細胞)。用PBS洗2_3 次，離心去上清，將細胞與羊抗大鼠的磁珠(20ul/lX108細胞)一起4°C孵育15min。最后采用磁珠分選系統(MACS)分離出E-cadherin+胚胎肝細胞。分離出的細胞接種于預先鋪有明膠的細胞培養皿中，采用含10%胎牛血清、0.0說尼古丁、10_711101/1地塞米松、1\1丁5、 IX 巰基乙醇、40ng/ml 的 HGF、20ng/ml 的 EGF、100U/ml 青霉素、100ug/ml 鏈霉素的 DMEM/ F12培養液，于37°C、5%二氧化碳/95%空氣的恒溫培養箱中進行培養。b)MSCV-IRES-GFP-Hras (MIG-Hras)逆轉錄病毒的制備按照 invitrogen 公司 lipofectAMINE 2000 Reagent說明書提供的參考方法進行操作，將MIG-Hras質粒轉染包裝細胞Ecotropic中，培養48及7 后分別收集病毒上清。c) LPC-H鼠肝腫瘤細胞系的建立感染LPC細胞前一天，將LPC細胞接種于預先鋪有明膠的對孔板中(5X103個細胞/孔)。感染時去培養液，加入b)中的病毒上清，每隔 8h更換一次病毒上清，持續感染Mh。去病毒，加入新鮮細胞培養液，隔天換液，每三天傳代一次。收集1 X IO5 1 X IO7的細胞通過流式分選帶GFP熒光的細胞，于新鮮細胞培養液中擴大培養。d)含高比率⑶133+細胞亞群并具有高致瘤性的鼠肝腫瘤細胞系的建立將LPC-H 鼠肝腫瘤細胞系培養至對數生長期，用0. 25%胰酶+0. 1 % EDTA消化后，PBS洗滌兩次，取 1X105 1X107的細胞放入流式管中，離心去上清，加入100 μ 1的10%山羊血清懸浮細胞，4°C封閉lOmin。隨后加入帶PE熒光的小鼠CD133抗體2. 5ul (0. 5mg/ml)，4°C孵育 30min。用FACS緩沖液(PBS+0. 5% BSA)洗滌兩次，棄上清，加入Iml細胞培養液，通過流式分選儀將單個帶GFP熒光、CD133+的LPC-H細胞打入加有新鮮細胞培養液的96孔板中。 于37°C、5%二氧化碳/95%空氣的恒溫培養箱中進行培養。7-14d后，待各單個細胞擴增起來后，移入M孔板中繼續培養。待細胞生長至生長對數期，各單克隆取一部分細胞進行 ⑶133表達的檢測，篩選得到高表達腫瘤干細胞標志物⑶133的鼠肝腫瘤細胞系LPC-H12。本發明具有如下有益效果和實質性特點1)該細胞系表達各肝干細胞相關基因以及干細胞Marker ⑶133、EpCAM，其中 ⑶133的表達量較以往有大幅度提高；2)具有高體外成球能力3)具有高體內致瘤能力；4)這一鼠肝腫瘤細胞系為研究⑶133+肝癌干細胞亞群在肝癌發生及發展過程中的作用和機理以及抗肝腫瘤干細胞藥物的篩選提供有力工具。


圖1LPC-H12細胞的相差圖。圖2不同LPC-H單細胞克隆中表達⑶133情況示意圖。圖3LPC-H12細胞系中⑶133及EpCAM的表達情況示意圖。圖4LPC-H12細胞系中肝干細胞相關基因的表達情況示意圖。A為陽性對照；B為 LPC-Hl2 樣本。圖5LPC-H及LPC-H12細胞形成球體的情況比較示意圖。A為LPC-H及LPC-H12細胞懸浮培養所形成的球體相差圖，Bar = IOOum ；B為LPC-H及LPC-H12細胞所形成的球體數對比。圖6LPC-H及LPC-H12細胞致瘤性的情況比較示意圖。
具體實施例方式以下對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1建立⑶133高表達的鼠肝腫瘤細胞系LPC-H12 a)分離p53-/_小鼠胚胎肝細胞(LPC細胞)取E13. 5d的p53_/_小鼠胚胎，在 PBS中漂洗2-3次；用無菌眼科剪及鑷子完整剪取其肝臟。將其剪碎后，加入肝臟消化液于37°C消化30min成單細胞懸液。離心去上清，用PBS洗2_3次，將細胞與大鼠抗小鼠 E-cadherin單抗一起4°C孵育30min(所用抗體量為^g E-cadherin/1 X IO7個細胞)。用 PBS洗2-3次，離心去上清，將細胞與羊抗大鼠的磁珠(20ul/lX108細胞)一起4°C孵育 15min。最后采用磁珠分選系統(MACS)分離出E-cadherin+胚胎肝細胞。分離出的細胞接種于預先鋪有明膠的細胞培養皿中，采用含10%胎牛血清、0. OlM尼古丁、10_7mol/L地塞米松、IX ITS、IX 巰基乙醇、40ng/ml 的 HGF、20ng/ml 的 EGF、100U/ml 青霉素、100ug/ml 鏈霉素的DMEM/F12培養液，于37°C、5%二氧化碳/95%空氣的恒溫培養箱中進行培養。b)MSCV-IRES-GFP-Hras (MIG-Hras)逆轉錄病毒的制備按照 invitrogen 公司 lipofectAMINE 2000 Reagent說明書提供的參考方法進行操作，將MIG-Hras質粒轉染包裝細胞Ecotropic中，培養48及7 后分別收集病毒上清。c) LPC-H鼠肝腫瘤細胞系的建立感染LPC細胞前一天，將LPC細胞接種于預先鋪有明膠的對孔板中(5X103個細胞/孔)。感染時去培養液，加入b)中的病毒上清，每隔 8h更換一次病毒上清，持續感染Mh。去病毒，加入新鮮細胞培養液，隔天換液，每三天傳代一次。收集1 X IO5 1 X IO7的細胞通過流式分選帶GFP熒光的細胞，于新鮮細胞培養液中擴大培養。d)含高比率⑶133+細胞亞群并具有高致瘤性的鼠肝腫瘤細胞系的建立將LPC-H 鼠肝腫瘤細胞系培養至對數生長期，用0. 25%胰酶+0. EDTA消化后，PBS洗滌兩次， 取IXlO5 IXlO7的細胞放入流式管中，離心去上清，加入100 μ 1的10%山羊血清懸浮細胞，4°C封閉lOmin。隨后加入帶PE熒光的小鼠CD133抗體2. 5ul (0. 5mg/ml)，4°C孵育 30min。用FACS緩沖液(PBS+0. 5% BSA)洗滌兩次，棄上清，加入Iml細胞培養液，通過流式分選儀將單個帶GFP熒光、CD133+的LPC-H細胞打入加有新鮮細胞培養液的96孔板中。 于37°C、5%二氧化碳/95%空氣的恒溫培養箱中進行培養。7-14d后，待各單個細胞擴增起來后，移入M孔板中繼續培養，細胞形態如圖1所示。待細胞生長至生長對數期，各單克隆取一部分細胞進行CD133表達的檢測，篩選得到高表達腫瘤干細胞標志物CD133的鼠肝腫瘤細胞系LPC-H12。(各組LPC-H的⑶133表達量對比如圖2所示)實施例2LPC-Hl2細胞系高表達干細胞標志物CD133及EpCAM a)LPC-Hl2 細胞系體外常規培養條件為10% FBS 以及 50mM2-mercaptoethanol 所配制的DMEM/F12培養液，37°C，5%二氧化碳/95%空氣，飽和濕度。b)生長至對數生長期的LPC-H12細胞，用0. 25%胰酶+0. 1 % EDTA消化后，PBS洗滌兩次，取IXio5 IXlO7的細胞放入流式管中，離心，去上清，加入ιοομ 1的10%山羊血清懸浮細胞，4°c封閉lOmin。c)在步驟 b)中加入 CD133-PE 或 EpCAM-PE 熒光抗體 2. 5ul (0. 5mg/ml)，4°C孵育 30minod)加入FACS緩沖液，輕輕混勻，300g離心5min，棄上清。e)加入300-500ul的FACS緩沖液，用BD流式分析儀進行檢測。如圖3所示 LPC-Hl2對干細胞標志物⑶133及EpCAM的表達量均高于初始LPC-H細胞系。實施例3LPC-Hl2細胞系中肝干細胞相關基因的表達a)將體外常規培養、生長至對數生長期的LPC-H12細胞，用0. 25%胰酶+0. EDTA消化后收集細胞，PBS洗滌細胞兩次，細胞沉淀用TaKara公司的總RNA提取試劑盒進行總RNA的提取。 b)取2ug總RNA使用TaKara公司的逆轉錄試劑盒將其反轉成cDNA。c)PCR檢測肝干細胞增殖、自我更新相關基因的表達情況。所擴增的目的基因及其引物序列如表1所示，所述引物由英俊生物技術有限公司合成。PCR反應條件為預變性 95 0C 5min，循環反應；35次，循環條件為變性95°C 130s，退火30s，退火溫度見表1，延伸 720C 30sο 末輪延伸為 72°C，10min。d)PCR產物經1. 5%瓊脂糖電泳進行檢測，并在凝膠成像系統上觀察，結果如圖4 所示。通過RT-PCR檢測，LPC-H12細胞系中與肝干細胞相關基因Alb、AFP, CK19, BmiU ALDHlal、SOXl、Nanog、Notchl 均有表達。表1. PCR擴增中各基因的特異性引物序列
權利要求
1.一種高表達CD133的鼠肝腫瘤細胞系，其特征在于，該細胞系為一種具有干細胞標志物CD133高表達量特性的鼠肝腫瘤細胞系。
2.根據權利要求1所述的一種高表達CD133的鼠肝腫瘤細胞系，其特征在于，所述細胞系于2010年12月16日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC No. C2010115o
3.根據權利要求1所述的一種高表達⑶133的鼠肝腫瘤細胞系，其特征在于，其建立過程具體包含如下步驟a)分離p53-/_小鼠胚胎肝細胞(LPC細胞)取E13.5d的p53_/_小鼠胚胎，在PBS中漂洗2-3次；用無菌眼科剪及鑷子完整剪取其肝臟。將其剪碎后，加入肝臟消化液于37°C 消化30min成單細胞懸液。離心去上清，用PBS洗2_3次，將細胞與大鼠抗小鼠E-cadherin 單抗一起4°C孵育30min (所用抗體量為^g E-cadherin/1 X IO7個細胞)。用PBS洗2-3 次，離心去上清，將細胞與羊抗大鼠的磁珠(20ul/lX108細胞)一起4°C孵育15min。最后采用磁珠分選系統(MACS)分離出E-cadherin+胚胎肝細胞。分離出的細胞接種于預先鋪有明膠的細胞培養皿中，采用含10%胎牛血清、0.0說尼古丁、10_711101/1地塞米松、1\1丁5、 IX 巰基乙醇、40ng/ml 的 HGF、20ng/ml 的 EGF、100U/ml 青霉素、100ug/ml 鏈霉素的 DMEM/ F12培養液，于37°C、5%二氧化碳/95%空氣的恒溫培養箱中進行培養。b)MSCV-IRES-GFP-Hras (MIG-Hras)逆轉錄病毒的制備按照 invitrogen 公司 lipofectAMINE 2000 Reagent說明書提供的參考方法進行操作，將MIG-Hras質粒轉染包裝細胞Ecotropic中，培養48及7 后分別收集病毒上清。c)LPC-H鼠肝腫瘤細胞系的建立感染LPC細胞前一天，將LPC細胞接種于預先鋪有明膠的M孔板中(5 XlO3個細胞/孔)。感染時去培養液，加入b)中的病毒上清，每隔他更換一次病毒上清，持續感染Mh。去病毒，加入新鮮細胞培養液，隔天換液，每三天傳代一次。 收集1 X IO5 1 X IO7的細胞通過流式分選帶GFP熒光的細胞，于新鮮細胞培養液中擴大培養。d)含高比率CD133+細胞亞群并具有高致瘤性的鼠肝腫瘤細胞系的建立將LPC-H 鼠肝腫瘤細胞系培養至對數生長期，用0. 25%胰酶+0. EDTA消化后，PBS洗滌兩次， 取IXlO5 IXlO7的細胞放入流式管中，離心去上清，加入100 μ 1的10%山羊血清懸浮細胞，4°C封閉lOmin。隨后加入帶PE熒光的小鼠CD133抗體2. 5ul (0. 5mg/ml)，4°C孵育 30min。用FACS緩沖液(PBS+0. 5% BSA)洗滌兩次，棄上清，加入Iml細胞培養液，通過流式分選儀將單個帶GFP熒光、CD133+的LPC-H細胞打入加有新鮮細胞培養液的96孔板中。 于37°C、5%二氧化碳/95%空氣的恒溫培養箱中進行培養。7-14d后，待各單個細胞擴增起來后，移入M孔板中繼續培養。待細胞生長至生長對數期，各單克隆取一部分細胞進行 ⑶133表達的檢測，篩選得到高表達腫瘤干細胞標志物⑶133的鼠肝腫瘤細胞系LPC-H12。
4.根據權利要求1所述的一種高表達CD133的鼠肝腫瘤細胞系，其特征在于，所述細胞系為一種對干細胞標志物CD133及EpCAM的表達量均高于初始細胞系LPC-H的鼠肝腫瘤細胞系。
5.根據權利要求1所述的一種高表達CD133的鼠肝腫瘤細胞系，其特征在于，所述細胞系為一種表達與干細胞相關的基因Alb、AFP、CK19、Bmil、ALDHlal、SOXl、Nanog、Notchl中的一種或多種的鼠肝腫瘤細胞系。
6.根據權利要求1所述，一種高表達CD133的鼠肝腫瘤細胞系，其特征在于，所述細胞系為一種較之初始細胞系LPC-H，具有體外高成球能力的鼠肝腫瘤細胞系。
7.根據權利要求1所述的一種高表達CD133的鼠肝腫瘤細胞系，其特征在于，所述細胞系為一種較之初始細胞系LPC-H，具有體內高致瘤能力的鼠肝腫瘤細胞系。
8.一種高表達CD133的鼠肝腫瘤細胞系的制備方法，其特征在于，所述方法具體包括如下步驟a)分離p53-/_小鼠胚胎肝細胞(LPC細胞)取E13.5d的p53_/_小鼠胚胎，在PBS中漂洗2-3次；用無菌眼科剪及鑷子完整剪取其肝臟。將其剪碎后，加入肝臟消化液于37°C 消化30min成單細胞懸液。離心去上清，用PBS洗2_3次，將細胞與大鼠抗小鼠E-cadherin 單抗一起4°C孵育30min (所用抗體量為^g E-cadherin/1 X IO7個細胞)。用PBS洗2-3 次，離心去上清，將細胞與羊抗大鼠的磁珠(20ul/lX108細胞)一起4°C孵育15min。最后采用磁珠分選系統(MACS)分離出E-cadherin+胚胎肝細胞。分離出的細胞接種于預先鋪有明膠的細胞培養皿中，采用含10%胎牛血清、0.0說尼古丁、10_711101/1地塞米松、1\1丁5、 IX 巰基乙醇、40ng/ml 的 HGF、20ng/ml 的 EGF、100U/ml 青霉素、100ug/ml 鏈霉素的 DMEM/ F12培養液，于37°C、5%二氧化碳/95%空氣的恒溫培養箱中進行培養。b)MSCV-IRES-GFP-Hras (MIG-Hras)逆轉錄病毒的制備按照 invitrogen 公司 lipofectAMINE 2000 Reagent說明書提供的參考方法進行操作，將MIG-Hras質粒轉染包裝細胞Ecotropic中，培養48及7 后分別收集病毒上清。c)LPC-H鼠肝腫瘤細胞系的建立感染LPC細胞前一天，將LPC細胞接種于預先鋪有明膠的M孔板中(5 XlO3個細胞/孔)。感染時去培養液，加入b)中的病毒上清，每隔他更換一次病毒上清，持續感染Mh。去病毒，加入新鮮細胞培養液，隔天換液，每三天傳代一次。 收集1 X IO5 1 X IO7的細胞通過流式分選帶GFP熒光的細胞，于新鮮細胞培養液中擴大培養。d)含高比率CD133+細胞亞群并具有高致瘤性的鼠肝腫瘤細胞系的建立將LPC-H 鼠肝腫瘤細胞系培養至對數生長期，用0. 25%胰酶+0. EDTA消化后，PBS洗滌兩次， 取IXlO5 IXlO7的細胞放入流式管中，離心去上清，加入100 μ 1的10%山羊血清懸浮細胞，4°C封閉lOmin。隨后加入帶PE熒光的小鼠CD133抗體2. 5ul (0. 5mg/ml)，4°C孵育 30min。用FACS緩沖液(PBS+0. 5% BSA)洗滌兩次，棄上清，加入Iml細胞培養液，通過流式分選儀將單個帶GFP熒光、CD133+的LPC-H細胞打入加有新鮮細胞培養液的96孔板中。 于37°C、5%二氧化碳/95%空氣的恒溫培養箱中進行培養。7-14d后，待各單個細胞擴增起來后，移入M孔板中繼續培養。待細胞生長至生長對數期，各單克隆取一部分細胞進行 ⑶133表達的檢測，篩選得到高表達腫瘤干細胞標志物⑶133的鼠肝腫瘤細胞系LPC-H12。
全文摘要
本發明提供了一種高表達CD133的鼠肝腫瘤細胞系及其制備方法，通過在p53-/-小鼠胚胎肝細胞中導入癌基因Hras后，利用單克隆打板技術得到源于CD133+細胞的單細胞克隆群，最后篩選建立含高比率CD133+細胞亞群的鼠肝腫瘤細胞系。該細胞系LPC-H12表達各肝干細胞相關基因以及干細胞MarkerCD133、EpCAM，具有高體外成球能力及體內致瘤能力。這一鼠肝腫瘤細胞系為研究CD133+肝癌干細胞亞群在肝癌發生及發展過程中的作用和機理以及針對肝腫瘤干細胞的藥物的篩選提供有力工具。
文檔編號C12N5/073GK102181399SQ20111005661
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月9日 優先權日2011年3月9日
發明者劉蘭蘭, 劉永忠, 張力, 楊兆娟, 馬愛輝 申請人:上海市腫瘤研究所