本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集方法。
背景技術(shù)：
：循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcells，CTC)是指自發(fā)或因診療操作由實(shí)體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，是惡性腫瘤患者出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的主要原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，轉(zhuǎn)移是超過90％的腫瘤患者的死亡原因。近年來，隨著一些基礎(chǔ)學(xué)科相關(guān)技術(shù)的不斷改進(jìn)，CTC檢測作為一種新型的非侵入性診斷工具，相比傳統(tǒng)組織活檢具有無創(chuàng)、可多次獲取、可實(shí)時(shí)監(jiān)測等優(yōu)勢，因此檢測CTC被形象地稱為“液體活檢”，具有重要的臨床研究及應(yīng)用價(jià)值，已成為臨床研究的熱點(diǎn)。已有大量臨床研究已經(jīng)證實(shí)：通過對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測，可有效地進(jìn)行對(duì)多種腫瘤進(jìn)行早期診斷、預(yù)后判斷、監(jiān)測術(shù)后復(fù)發(fā)、個(gè)體化治療、化療藥物的快速評(píng)估、耐藥性的監(jiān)測等。近10年的大量臨床研究表明，檢測CTC數(shù)量有助于結(jié)腸癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌患者的預(yù)后評(píng)估；當(dāng)CTC出現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)、過表達(dá)上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)時(shí)，往往提示腫瘤患者預(yù)后不佳，臨床研究發(fā)現(xiàn)，早期發(fā)現(xiàn)的癌癥患者，90％可以治愈。但是，由于常規(guī)檢測技術(shù)的局限性，早期發(fā)現(xiàn)癌癥的人群只占少數(shù)，我國早期(Ⅰ期)癌癥病人約占總體病人數(shù)5％-10％，70％的病人都屬于晚期發(fā)現(xiàn)，這類病人5年生存率僅10％～30％。世界衛(wèi)生組織早在2006年就指出癌癥的防治三原則：早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療，可見，盡早發(fā)現(xiàn)是癌癥防治的關(guān)鍵。但是在腫瘤的常規(guī)檢測手段中，例如CT或核磁共振檢查，對(duì)小于5毫米的腫瘤診斷比較困難，如胰腺癌、肺癌往往發(fā)現(xiàn)確診以后都是中晚期的?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，很多腫瘤在1毫米的情況下已經(jīng)可以在血液里查到循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcells,CTC)。因此，早期發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移不僅對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后的判斷有重要意義，而且對(duì)指導(dǎo)臨床治療也有很大價(jià)值。而目前臨床腫瘤的發(fā)現(xiàn)和診斷仍高度依賴于影像學(xué)及血清腫瘤標(biāo)志物的檢查，難以早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)，也難以及時(shí)反映療效。因此，現(xiàn)有腫瘤常規(guī)篩查、診斷方法不能滿足臨床需求，臨床迫切需要安全、準(zhǔn)確性高、操作方便的癌癥篩查、診斷新方法。血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞以較低的數(shù)量存在于血液中，一般需要富集后才能有效檢測和分析。血液中的細(xì)胞種類繁多，要絕對(duì)準(zhǔn)確地鑒定血液中的腫瘤細(xì)胞，并不容易。CTC在腫瘤患者外周血中極為稀少，約1～10個(gè)/mL，而正常成人外周血中所有血細(xì)胞濃度為109/mL，白細(xì)胞的濃度是4～10×106/mL。遠(yuǎn)低于血液中其他類型細(xì)胞數(shù)量的稀缺性使得CTC在血液檢測中極具挑戰(zhàn)性。CTC檢測一般包括CTC富集和CTC鑒定兩個(gè)部分，通常要通過富集的步驟以去除大部分正常細(xì)胞，然后再鑒定得到的細(xì)胞的確是CTC。CTC的富集方法主要分為物理方法和生物化學(xué)方法兩大類。CTC的鑒定主要通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)或核酸分子水平進(jìn)行分析鑒定。CTC的富集方法主要分為物理方法和生物化學(xué)方法兩大類。物理法基于腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞物理性質(zhì)，如大小、變形性、密度、介電性等的差異，利用外力場比如磁場，流體場，電場等的作用進(jìn)行分離捕獲。生物化學(xué)法通常依賴于細(xì)胞膜表面的抗原與偶聯(lián)在分離介質(zhì)上的抗體相結(jié)合，達(dá)到分離捕獲的目的。現(xiàn)階段應(yīng)用于CTC的富集技術(shù)主要包括：基于細(xì)胞密度的離心法、基于細(xì)胞體積的濾膜過濾法(isolationbysizeofepithelialtumourcells，ISET)、免疫磁珠法(magneticactivatedcellsorting,MACS)、CTC-Chip微流控芯片技術(shù)等?，F(xiàn)有密度梯度離心法特異性低、敏感性低、回收率低、穩(wěn)定性低，不僅容易造成腫瘤細(xì)胞丟失，且依賴于腫瘤細(xì)胞的特性、離心的時(shí)間、溫度等多種因素，作為單一的CTC分離手段未來發(fā)展?jié)摿κ钟邢蕖SET法雖然操作簡便、價(jià)格低廉、通量高，可同時(shí)大批量處理樣本，耗時(shí)較短，但存在缺乏特異性、腫瘤細(xì)胞被漏檢(≦8um)的可能，同樣不可能成為未來的發(fā)展趨勢與潮流。CTC當(dāng)前循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集應(yīng)用最廣發(fā)的是陽性富集的方法，包括免疫磁珠法陽性富集、微流控芯片法陽性富集。微流控芯片應(yīng)用于稀有細(xì)胞分選的不足主要表現(xiàn)在耗時(shí)長、效果差、細(xì)胞活性受損三個(gè)方面。此外，通量和純度在大多數(shù)芯片中往往是互相制約的兩個(gè)指標(biāo)，通量上升則意味著純度下降，反之亦然，如何兼顧兩者是微流控分選技術(shù)發(fā)展的又一挑戰(zhàn)。最后，考慮到捕獲到的細(xì)胞可能含有不同的亞型，或是同一類細(xì)胞的不同生長階段，后續(xù)的表型分析對(duì)臨床診斷具有重要意義，這對(duì)捕獲細(xì)胞的活性提出了較高的要求。但是，微通道中微結(jié)構(gòu)的擠壓，高剪切流的流場，外加的電場、聲場等都會(huì)對(duì)細(xì)胞的活性造成一定的損傷，對(duì)后續(xù)分析造成困擾。申請(qǐng)?zhí)枮?01110161224.7的中國專利公開了一種定量分析循環(huán)腫瘤細(xì)胞的試劑及試劑盒，通過設(shè)計(jì)適宜檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞的探針，從而可配合流式細(xì)胞技術(shù)，獲得循環(huán)腫瘤細(xì)胞的測定結(jié)果。免疫磁珠法是目前應(yīng)用最為廣泛的CTC分離方法，主要是指陽性富集法，具有簡便易行、分離純度高的優(yōu)點(diǎn)，但回收率低、存在漏檢的缺陷也非常明顯。目前，大量的免疫磁珠法CTC研究根據(jù)腫瘤的上皮抗原進(jìn)行分離，并且認(rèn)為EpCAM是目前最優(yōu)的腫瘤生物標(biāo)記物，但有研究表明大多數(shù)惡性腫瘤的CTC會(huì)丟失EpCAM抗原。這就意味著這種方法有可能會(huì)漏檢具有侵害性的CTC。事實(shí)上，研究發(fā)現(xiàn)134種組織類型不同的腫瘤細(xì)胞只有70％表達(dá)EpCAM，但存在表達(dá)強(qiáng)度不一的差異性。目前，尚沒有一種100％特異性的腫瘤生物標(biāo)記物。但循環(huán)腫瘤細(xì)胞陽性富集方法存在著CTC特異性標(biāo)志物缺乏、單克隆抗體篩選困難、回收率低、存在漏檢(抗體無法識(shí)別的腫瘤細(xì)胞被忽略)等缺點(diǎn)，影響檢測結(jié)果。由于CTC缺乏特異性的標(biāo)志物，目前普遍采用EpCAM(上皮細(xì)胞粘附分子)磁珠標(biāo)記并分離CTC，基于這一原理發(fā)展起來的CellSearch等儀器已經(jīng)投入市場運(yùn)作。然而，該方法無法檢出低表達(dá)和不表達(dá)EpCAM的CTC。已有研究指出，基于這一原理分離CTC將低估其數(shù)量并丟失具有高轉(zhuǎn)移及增殖潛力的CTC亞群。一個(gè)典型的例子就是，發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的CTC低表達(dá)或不表達(dá)EpCAM亞群因?yàn)榫哂懈叩倪w移力而被認(rèn)為是造成轉(zhuǎn)移的最主要原因之一。與免疫磁珠陽性富集方法相比，CTC免疫磁珠陰性富集方法具有更多的優(yōu)勢。該技術(shù)利用結(jié)合有CD45單克隆抗體的免疫磁珠特異性結(jié)合白細(xì)胞表面的CD45抗原(白細(xì)胞共同抗原)，對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行磁性標(biāo)記，通過外加磁場去除白細(xì)胞，從而可以不依賴CTC表面標(biāo)記物，把CTC所有亞群、全部類型富集出來。CTC免疫磁珠陰性富集技術(shù)在分離出全部類型的CTC上具有技術(shù)優(yōu)勢，同時(shí)由于不依賴于CTC表面標(biāo)記物，預(yù)期可用于所有類型實(shí)體瘤的CTC富集。因此，開發(fā)不依賴于CTC表面標(biāo)記物的分離方法是一個(gè)具有巨大前景的技術(shù)方向。另一方面，陰性富集策略的免疫磁珠法通過有效去除CD45+的白細(xì)胞或CD61+的巨噬細(xì)胞、血小板等外周血其他細(xì)胞而間接富集稀有上皮細(xì)胞，某種程度上克服了EMT導(dǎo)致的EpCAM陽性富集策略的缺陷。此外，通過陰性富集策略得到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞還具有沒有經(jīng)過任何標(biāo)記、高細(xì)胞活性等優(yōu)勢。綜上所述，現(xiàn)經(jīng)報(bào)道的多種CTC分離方法雖然各自具有獨(dú)特的檢測優(yōu)勢，但仍暴露出一些問題，如循環(huán)腫瘤細(xì)胞回收率不高(70％-80％)、不能獲得有活性的CTC、生物標(biāo)記物選擇困難、分離技術(shù)復(fù)雜等。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：提供一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集方法，解決現(xiàn)有循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離方法存在的循環(huán)腫瘤細(xì)胞回收率不高、不能獲得有活性的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，生物標(biāo)記物選擇困難、分離技術(shù)復(fù)雜的問題。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集方法，包括以下步驟：S1：將密度梯度分離液(Ficollpagueplus，GEHealth)和腫瘤患者血樣在淋巴細(xì)胞分離管中混合，加入洗滌緩沖液，進(jìn)行第一次離心；S2：將經(jīng)過第一次離心的淋巴細(xì)胞分離管中擋板上層溶液轉(zhuǎn)移至第一離心管中，進(jìn)行第二次離心，吸去上清，加入紅細(xì)胞裂解液，靜置；S3：將經(jīng)過靜置后的第一離心管進(jìn)行第三次離心，吸去上清，加入磁珠孵育緩沖液，再加入陰性富集免疫磁珠，混勻，孵育20-40min，所述陰性富集免疫磁珠結(jié)合有靶向白細(xì)胞表面廣譜標(biāo)記物CD45；S4：將上述經(jīng)過孵育后的第一離心管放置在磁力架上靜置，將上清液全部轉(zhuǎn)移至第二離心管中，用洗滌緩沖液沖洗第二離心管；S5：將上述第二離心管進(jìn)行第四次離心，吸去第二離心管上清液，在第二離心管中加入細(xì)胞固定液重懸后涂于載玻片上，過夜干燥，得到干燥的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明公開的循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集方法，采用淋巴細(xì)胞分離管基礎(chǔ)上的密度梯度離心對(duì)血樣進(jìn)行前處理，簡化了白細(xì)胞分離操作步驟，縮短了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集時(shí)間，整個(gè)操作在2.5h內(nèi)即可完成；經(jīng)處理后留下的白細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)于血樣原始白細(xì)胞數(shù)量的30-50％，對(duì)留下的白細(xì)胞采用自制陰性富集免疫磁珠CD45標(biāo)記白細(xì)胞并去除，減少了免疫磁珠的用量，大大節(jié)約了循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集的成本；本發(fā)明采用淋巴細(xì)胞分離管對(duì)血樣進(jìn)行前處理，并對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集方法進(jìn)行改良，有效提高了富集操作穩(wěn)定性，循環(huán)腫瘤細(xì)胞的回收率達(dá)到85％以上；本發(fā)明還具有高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，可以在數(shù)量極少的樣品中穩(wěn)定檢出循環(huán)腫瘤細(xì)胞。附圖說明圖1為本發(fā)明具體實(shí)施方式的一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集方法與傳統(tǒng)密度梯度離心法制得的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集回收率柱狀圖；圖2為本發(fā)明具體實(shí)施方式的一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集方法對(duì)不同類型腫瘤細(xì)胞的富集回收率柱狀圖；圖3為本發(fā)明具體實(shí)施方式的一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集方法富集的SKOV3細(xì)胞后免疫熒光鑒定結(jié)果圖；圖4為本發(fā)明具體實(shí)施方式的一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集方法對(duì)不同數(shù)量NCI-H226循環(huán)腫瘤細(xì)胞的平均回收率柱狀圖；圖5為本發(fā)明具體實(shí)施方式的一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集方法對(duì)不同數(shù)量NCI-H226循環(huán)腫瘤細(xì)胞的回收率線性回歸圖。具體實(shí)施方式為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式并配合附圖予以說明。本發(fā)明涉及的縮略語和關(guān)鍵術(shù)語定義：CTC：循環(huán)腫瘤細(xì)胞；CD45：白細(xì)胞表面共同抗原；CK-FITC：異硫氰酸熒光素偶聯(lián)細(xì)胞角蛋白抗體；CD45-PE：藻紅蛋白蛋白偶聯(lián)CD45抗體；DAPI：4',6-二脒基-2-苯基吲哚。本發(fā)明最關(guān)鍵的構(gòu)思在于：采用淋巴細(xì)胞分離管基礎(chǔ)上的密度梯度離心對(duì)血樣進(jìn)行前處理，簡化了白細(xì)胞分離操作步驟，縮短了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集時(shí)間，對(duì)留下的白細(xì)胞采用自制陰性富集免疫磁珠CD45標(biāo)記白細(xì)胞并去除，減少了免疫磁珠的用量，大大節(jié)約了循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集的成本。一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集方法，包括以下步驟：S1：將密度梯度分離液(Ficollpagueplus，GEHealth)和腫瘤患者血樣在淋巴細(xì)胞分離管中混合，加入洗滌緩沖液，進(jìn)行第一次離心；S2：將經(jīng)過第一次離心的淋巴細(xì)胞分離管中擋板上層溶液轉(zhuǎn)移至第一離心管中，進(jìn)行第二次離心，吸去上清，加入紅細(xì)胞裂解液，靜置；S3：將經(jīng)過靜置后的第一離心管進(jìn)行第三次離心，吸去上清，加入磁珠孵育緩沖液，再加入陰性富集免疫磁珠，混勻，孵育20-40min，所述陰性富集免疫磁珠結(jié)合有靶向白細(xì)胞表面廣譜標(biāo)記物CD45；S4：將上述經(jīng)過孵育后的第一離心管放置在磁力架上靜置，將上清液全部轉(zhuǎn)移至第二離心管中，用洗滌緩沖液沖洗第二離心管；S5：將上述第二離心管進(jìn)行第四次離心，吸去第二離心管上清液，在第二離心管中加入細(xì)胞固定液重懸后涂于載玻片上，過夜干燥，得到干燥的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明的循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集原理：本發(fā)明公開了一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測方法，主要步驟包括利用密度梯度離心去除紅細(xì)胞及大量中性粒細(xì)胞，通過紅細(xì)胞裂解，進(jìn)一步去除殘余紅細(xì)胞，將得到的白細(xì)胞與自制陰性富集免疫磁珠(靶向白細(xì)胞表面廣譜標(biāo)記物CD45)進(jìn)行孵育，經(jīng)磁場吸附去除白細(xì)胞，收集未與磁珠結(jié)合的上清部分，離心后涂片，空氣干燥制片，制得干燥的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。上述循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集方法，采用淋巴細(xì)胞分離管基礎(chǔ)上的密度梯度離心對(duì)血樣進(jìn)行前處理，簡化了白細(xì)胞分離操作步驟，縮短了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集時(shí)間，整個(gè)操作在2.5h內(nèi)即可完成；留下的白細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)于血樣原始白細(xì)胞數(shù)量的30-50％，對(duì)留下的白細(xì)胞采用自制陰性富集免疫磁珠CD45標(biāo)記白細(xì)胞并去除，減少了免疫磁珠的用量，大大節(jié)約了循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集的成本；本發(fā)明采用淋巴細(xì)胞分離管對(duì)血樣進(jìn)行前處理，并對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集方法進(jìn)行改良，有效提高了富集操作穩(wěn)定性，循環(huán)腫瘤細(xì)胞的回收率達(dá)到85％以上；本發(fā)明還具有高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，可以在數(shù)量極少的樣品中穩(wěn)定檢出循環(huán)腫瘤細(xì)胞。進(jìn)一步的，所述S1具體為：在淋巴細(xì)胞分離管中加入密度梯度分離液，瞬時(shí)離心使密度梯度分離液全部離心到管底；在裝有密度梯度分離液的淋巴細(xì)胞分離管中加入3mL的腫瘤患者血樣，并加入大于3mL的洗滌緩沖液，進(jìn)行第一次離心，所述第一次離心的條件為25℃、800g/15min。進(jìn)一步的，所述S2具體為：將上述經(jīng)過第一次離心的淋巴細(xì)胞分離管中擋板上層溶液轉(zhuǎn)移至第一離心管中，進(jìn)行第二次離心，所述第二次離心的條件為25℃、300g/10min，吸去上清，加入5mL的紅細(xì)胞裂解液，靜置5min。進(jìn)一步的，所述S3具體為：將經(jīng)過靜置后的第一離心管進(jìn)行第三次離心，所述第三次離心的條件為25℃、300g/10min，吸去上清，加入5mL磁珠孵育緩沖液，再加入200uL陰性富集免疫磁珠，吹打混勻，于4℃低速垂直混勻，孵育30min，所述陰性富集免疫磁珠結(jié)合有靶向白細(xì)胞表面廣譜標(biāo)記物CD45。進(jìn)一步的，所述S4具體為：將上述經(jīng)過孵育后的第一離心管放置在磁力架上靜置5min，將上清液全部轉(zhuǎn)移至第二離心管中，用洗滌緩沖液沖洗第二離心管2次。進(jìn)一步的，所述S5具體為：將上述第二離心管進(jìn)行第四次離心，吸去上清液至剩余體積為100uL，在第二離心管中加入100uL細(xì)胞固定液，重懸后涂于載玻片上，25℃過夜干燥，得到干燥的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，所述第四次離心的條件為25℃、600g/5min。進(jìn)一步的，所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集方法還包括步驟：S6：利用多色免疫熒光技術(shù)對(duì)干燥的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行鑒定并熒光計(jì)數(shù)。進(jìn)一步的，所述多色免疫熒光技術(shù)采用的染料為CK-FITC、CD45-PE或DAPI。對(duì)比實(shí)施例1在健康人外周血中摻入一定數(shù)量的SiHa細(xì)胞，以模擬宮頸癌患者含有循環(huán)腫瘤細(xì)胞血樣，按比例稀釋得到2×104的細(xì)胞懸液，并在熒光顯微鏡下精確計(jì)數(shù)并調(diào)整至100個(gè)/5uL，將計(jì)數(shù)后細(xì)胞懸液摻入3mL外周血，分別制得含有100個(gè)SiHa細(xì)胞/3mL的外周血樣，以上述血樣作為腫瘤患者血樣，分別按照以下三種血液前處理方案(A、紅細(xì)胞裂解；B、密度梯度離心；C、紅細(xì)胞裂解+密度梯度離心)處理后，分別按照實(shí)施例1的步驟進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集；對(duì)紅細(xì)胞去除效率、白細(xì)胞去除效率進(jìn)行評(píng)價(jià)。不同血液前處理方案紅細(xì)胞去除效率、白細(xì)胞去除效率如表1所示。表1.不同血液前處理方案的紅細(xì)胞去除效率、白細(xì)胞去除效率血液前處理方案紅細(xì)胞去除效率白細(xì)胞去除效率紅細(xì)胞裂解～98～99.5％>99.5％密度梯度離心>99.5％～99.7-99.9％紅細(xì)胞裂解+密度梯度離心>99.99％～99.7-99.9％由表1看出，采用紅細(xì)胞裂解+密度梯度離心的前處理方式，紅細(xì)胞去除效率和白細(xì)胞去除效率最高。實(shí)施例1一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集方法，包括以下步驟：S1：在淋巴細(xì)胞分離管中加入密度梯度分離液，瞬時(shí)離心使密度梯度分離液全部離心到管底；在裝有密度梯度分離液的淋巴細(xì)胞分離管中加入3mL的腫瘤患者血樣，并加入大于3mL的洗滌緩沖液，進(jìn)行第一次離心，所述第一次離心的條件為25℃、800g/15min；S2：將上述經(jīng)過第一次離心的淋巴細(xì)胞分離管中擋板上層溶液轉(zhuǎn)移至第一離心管中，進(jìn)行第二次離心，所述第二次離心的條件為25℃、300g/10min，吸去上清，加入5mL的紅細(xì)胞裂解液，靜置5min；S3：將經(jīng)過靜置后的第一離心管進(jìn)行第三次離心，所述第三次離心的條件為25℃、300g/10min，吸去上清，加入5mL磁珠孵育緩沖液，再加入200uL陰性富集免疫磁珠，吹打混勻，于4℃低速垂直混勻，孵育30min，所述陰性富集免疫磁珠結(jié)合有靶向白細(xì)胞表面廣譜標(biāo)記物CD45；S4：將上述經(jīng)過孵育后的第一離心管放置在磁力架上靜置5min，將上清液全部轉(zhuǎn)移至第二離心管中，用洗滌緩沖液沖洗第二離心管2次；S5：將上述第二離心管進(jìn)行第四次離心，吸去上清液至剩余體積為100uL，在第二離心管中加入100uL細(xì)胞固定液重懸后涂于載玻片上，25℃過夜干燥，得到干燥的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，所述第四次離心的條件為25℃、600g/5min；S6：利用多色免疫熒光技術(shù)對(duì)干燥的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行鑒定并熒光計(jì)數(shù)，所述多色免疫熒光技術(shù)采用的染料為CK-FITC、CD45-PE或DAPI。實(shí)施例2請(qǐng)參照?qǐng)D1，在健康人外周血中摻入一定數(shù)量的SiHa細(xì)胞，以模擬宮頸癌患者含有循環(huán)腫瘤細(xì)胞血樣，并評(píng)價(jià)所建立循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集方法對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集效率，具體監(jiān)測步驟如下：1、將培養(yǎng)并消化收獲的SiHa細(xì)胞用CelltrackerGreen進(jìn)行綠色熒光預(yù)先標(biāo)記，按比例稀釋得到2×104的細(xì)胞懸液，并在熒光顯微鏡下精確計(jì)數(shù)并調(diào)整至100個(gè)/5uL；2、將計(jì)數(shù)后細(xì)胞懸液摻入3mL外周血，分別制得含有100個(gè)SiHa細(xì)胞/3mL的外周血樣本；3、對(duì)含有100個(gè)SiHa細(xì)胞/3mL的外周血樣本分別按照以下兩種方案分別進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集；A、傳統(tǒng)密度梯度離心法；B、淋巴細(xì)胞分離管密度梯度離心(改進(jìn)方案)4、采用實(shí)施例1的循環(huán)腫瘤陰性富集方法富集并檢測外周血樣本，并對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集方法的富集效率進(jìn)行評(píng)價(jià)。從圖1看出，采用淋巴細(xì)胞分離管密度梯度離心結(jié)合循環(huán)腫瘤陰性富集方法得到SiHa細(xì)胞的回收率達(dá)到89％，顯著高于傳統(tǒng)密度梯度離心法得到SiHa細(xì)胞的回收率76％。實(shí)施例3請(qǐng)參照?qǐng)D2及圖3，在健康人外周血中摻入一定數(shù)量的卵巢癌SKOV-3、宮頸癌SiHa細(xì)胞、乳腺癌SKBR3細(xì)胞，評(píng)價(jià)本方案涉及的循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集方法是否適用于不同腫瘤類型的循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測，具體檢測步驟如下：1、在本實(shí)施例中以100個(gè)卵巢癌SKOV-3、宮頸癌SiHa細(xì)胞、乳腺癌SKBR3細(xì)胞摻入健康人外周血的方法，以模擬不同腫瘤患者含有循環(huán)腫瘤細(xì)胞血樣，將培養(yǎng)并消化收獲的不同腫瘤類型細(xì)胞用CelltrackerGreen進(jìn)行綠色熒光預(yù)先標(biāo)記，按比例稀釋得到不同濃度的細(xì)胞懸液，并在熒光顯微鏡下精確計(jì)數(shù)。2、將計(jì)數(shù)后細(xì)胞懸液摻入3mL外周血，制得100個(gè)不同類型腫瘤細(xì)胞/3mL的外周血樣本。3、采用實(shí)施例1的循環(huán)腫瘤陰性富集方法富集并檢測外周血樣本。從圖2看出，采用本發(fā)明涉及的循環(huán)腫瘤陰性富集方法對(duì)不同類型腫瘤細(xì)胞的富集回收率均在85％以上。實(shí)施例4請(qǐng)參照?qǐng)D4，在健康人外周血中摻入不同數(shù)量NCI-H226細(xì)胞，以其為血樣，采用實(shí)施例1的循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集方法評(píng)價(jià)循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集效率，具體檢測步驟如下：1、在本實(shí)施例中以非小細(xì)胞肺癌NCI-H226細(xì)胞摻入健康人外周血的方法，以模擬肺癌患者含有循環(huán)腫瘤細(xì)胞血樣。將培養(yǎng)并消化收獲的NCI-H226細(xì)胞用CelltrackerGreen進(jìn)行綠色熒光預(yù)先標(biāo)記，按比例稀釋得到不同濃度的細(xì)胞懸液，并在熒光顯微鏡下精確計(jì)數(shù)。2.將計(jì)數(shù)后細(xì)胞懸液摻入3ml外周血，分別制得含有6、9、15、30、90、300個(gè)NCI-H226細(xì)胞/3ml的外周血樣本。3.采用本發(fā)明所公開的循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集試劑盒，利用上述方法富集外周血樣本中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，空氣干燥制片后，對(duì)CellTracker+的綠色熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)，對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集方法的富集效率、靈敏度進(jìn)行評(píng)價(jià)。從圖4看出，采用本發(fā)明涉及的循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集方法對(duì)不用數(shù)量的NCI-H226細(xì)胞的外周血樣本進(jìn)行循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集的回收率均達(dá)到較高的水平，其中，含有9、15、30個(gè)NCI-H226細(xì)胞/3ml的外周血樣本的平均回收率均在85％以上，從圖5看出，不同數(shù)量循環(huán)腫瘤細(xì)胞整體富集的整體回收率為77.66％，說明本發(fā)明涉及的循環(huán)腫瘤細(xì)胞富集方法具有較高的靈敏度。綜上所述，本發(fā)明提供的循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集方法，采用淋巴細(xì)胞分離管基礎(chǔ)上的密度梯度離心對(duì)血樣進(jìn)行前處理，簡化了白細(xì)胞分離操作步驟，縮短了循環(huán)腫瘤細(xì)胞的富集時(shí)間，整個(gè)操作在2.5h內(nèi)即可完成；留下的白細(xì)胞數(shù)量相當(dāng)于血樣原始白細(xì)胞數(shù)量的30-50％，對(duì)留下的白細(xì)胞采用自制陰性富集免疫磁珠CD45標(biāo)記白細(xì)胞并去除，減少了免疫磁珠的用量，大大節(jié)約了循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集的成本；本發(fā)明采用淋巴細(xì)胞分離管對(duì)血樣進(jìn)行前處理，并對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞陰性富集方法進(jìn)行改良，有效提高了富集操作穩(wěn)定性，循環(huán)腫瘤細(xì)胞的回收率達(dá)到85％以上；本發(fā)明還具有高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，可以在數(shù)量極少的樣品中穩(wěn)定檢出循環(huán)腫瘤細(xì)胞。以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等同變換，或直接或間接運(yùn)用在相關(guān)的
技術(shù)領(lǐng)域：
，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3