本發明涉及微生物發酵領域，具體涉及一種高產伊枯草菌素的枯草芽孢桿菌的培養基、其制備方法以及枯草芽孢桿菌的培養方法。
背景技術：
在我國，由于動物養殖密度大、畜禽疾病復雜多樣及監管不到位等諸多原因，普遍存在抗生素濫用的問題，例如在防治畜禽疾病時過量使用抗生素、在畜禽飼料中隨意添加抗生素、隨意使用抗生素藥物濾渣、使用違禁種類抗生素等使得動物養殖和食品安全問題日益嚴峻，且細菌耐藥性的提高也為養殖業的可持續發展埋下隱患。目前相關部門和國家機關已經出臺一系列限用禁用部分抗生素的政策方針，市場上常用的耐藥性較高的抗生素首當其沖。可是當前復雜多樣的畜禽疾病也決定了抗菌抗病藥物的必要性，研發和尋找新型抗菌物質成為當務之急，具有抗菌能力的生物活性抗菌肽開始被人類深入研究，伊枯草菌素就是其中之一。
伊枯草菌素是由枯草芽孢桿菌產生的一種有環脂肽結構的小分子多肽，一般包括親水和疏水兩部分，疏水部分是β-氨基脂肪酸，親水部分是由7-10個α-氨基酸形成的酰胺鍵環。大部分枯草芽孢桿菌都具有產生伊枯草菌素的能力，伊枯草菌素具有較強的抗菌特性，具有抗菌譜廣，無副作用的特點，是一種較好的抗菌制劑。
目前取得伊枯草菌素的方式主要有兩種：微生物發酵和化學合成，微生物發酵主要是通過發酵枯草芽孢桿菌獲得，化學合成法主要根據氨基酸序列合成，但化學合成法無論在產量和成本上都有很大局限性，很難滿足生產需要。枯草芽孢桿菌發酵包括液體發酵(專利ZL200910058559.9)和固體發酵(Mizumoto等人)，伊枯草菌素產量最高可分別達到8g/L和3.3g/Kg。但是這兩種方法因為成本控制和污染控制問題無法廣泛推廣。
本發明人長期從事微生物發酵及次級代謝產物研究工作。在對一株枯草芽孢桿菌的發酵培養基進行研究改良過程中，通過對發酵培養基的成分比例、發酵工藝參數和發酵方法進行研究，獲得了能夠高密度發酵枯草芽孢桿菌進而獲得高產量伊枯草菌素的培養基配方和發酵方法，完成了本發明。
技術實現要素：
有鑒于此，本發明的目的是提供一枯草芽孢桿菌培養基、其制備方法以及枯草芽孢桿菌的培養方法，以解決現有技術中提到的不足。
本發明的目的是通過以下技術方案來實現：
一種枯草芽孢桿菌培養基，包括種子培養基和發酵培養基，所述發酵培養基的成分以及各種成分在第一載體液中的含量為：糖10-30g/L、破壁啤酒酵母5-25g/L、水解羽毛粉1-15g/L、蛋白胨1-5g/L、水解蛋白1-5g/L和第一添加劑0.1-0.6g/L。
進一步地，所述發酵培養基的成分以及各種成分在第一載體液中的含量為：糖15-25g/L、破壁啤酒酵母12-18g/L、水解羽毛粉6-9g/L、蛋白胨3-4g/L、水解蛋白3-4g/L和第一添加劑0.3-0.4g/L。更優選為：糖20g/L、破壁啤酒酵母15g/L、水解羽毛粉7g/L、蛋白胨4g/L、水解蛋白3g/L和第一添加劑0.3g/L
進一步地，所述種子培養基的成分以及各種成分在第二載體液中的含量為：葡萄糖7～14g/L、圣琪酵母浸出物3～7g/L、蛋白胨3～7g/L和第二添加劑6～10g/L。
進一步地，所述種子培養基的成分以及各種成分在第二載體液中的含量為：葡萄糖10g/L、圣琪酵母浸出物5g/L、蛋白胨5g/L和第二添加劑8.5g/L。
進一步地，在所述發酵培養基中，所述糖為蔗糖，所述蛋白胨為大豆蛋白胨，所述水解蛋白為小麥水解蛋白。
進一步地，在所述發酵培養基中，所述第一添加劑包括該七水合硫酸鎂，其加量為0.1-0.5g/L；
進一步地，在所述種子培養基中，所述第二添加劑包括氯化鈉和七水合硫酸鎂，其加量為：氯化鈉8g/L，七水合硫酸鎂0.5g/L。
進一步地，在所述發酵培養基中，所述第一添加劑還包括硫酸亞鐵，其加量為0.05-0.1g/L。
進一步地，所述第一載體液和第二載體液優選為水。
一種所述的枯草芽孢桿菌的培養基的制備方法：其特征在于：
發酵培養基的制備方法為：按比例稱取糖、破壁啤酒酵母、水解羽毛粉、蛋白胨、水解蛋白和第一添加劑，然后加入第一載體液中，攪拌均勻；
種子培養基的制備方法為：按比例稱取葡萄糖、圣琪酵母浸出物、蛋白胨和第二添加劑，并將其加入第二載體液中，攪拌均勻。
一種采用所述的培養基進行枯草芽孢桿菌的培養，枯草芽孢桿菌的培養方法包括以下步驟：
S1：種子培養：將枯草芽孢桿菌菌種接種于種子培養基中，于30～35℃下，搖床培養，制得一級種子液；
按10％的接種量將上述制得的一級種子液接種于所述種子培養基中，于30～35℃下，搖床培養，培養至種子液中的OD值為3-4時停止培養，即制得二級種子液；
S2：發酵培養：將所述發酵培養基裝在發酵罐中，將步驟S1中制得的二級種子液按10％的比例加入發酵罐中進行發酵培養；
S3：檢測：步驟S2中發酵結束以后，取發酵液，并對發酵液進行處理，然后檢測發酵液中的伊枯草菌素。
進一步地，步驟S2中，所述發酵培養的過程包括増菌培養階段、發酵表達中前期和發酵表達后期；
増菌培養階段：0-8h進行増菌培養，増菌培養中的參數為：溫度：30～35℃，pH：6.8-7.0，轉速：180～250rpm，發酵罐罐壓：0.3-0.4kg/cm2，DO：大于30％；
發酵表達中前期：發酵培養至8-60h時進行中前期的發酵表達，中前期的發酵表達中的參數為：溫度：28～33℃，pH：6.5-6.8，轉速：150～200rpm，發酵罐罐壓：0.2-0.4kg/cm2，DO：大于30％；
發酵表達后期：發酵培養至60-72h時進行后期的發酵表達，后期的發酵表達中的參數為：溫度：28～33℃，pH：6.5-6.8，轉速：180～220rpm，發酵罐罐壓：0.3-0.4kg/cm2，DO：大于30％。
進一步地，步驟S3中，所述檢測的具體過程為：發酵結束后，取發酵上清用0.45μm濾膜過濾除菌后，采用10KD超濾管進行二次超濾分離，再選用截留分子量為1000Da的透析袋進行處理，真空冷凍干燥，然后以冷凍前樣品體積的1/10的比例加雙蒸水溶解，0.45μm濾膜過濾得到處理后的發酵液；對測定處理后的發酵液中的伊枯草菌素含量。
本發明至少具有以下有益效果：
①本發明提供了一種培育枯草芽孢桿菌的培養基，該培養基能夠有效培養枯草芽孢桿菌，其增值快、存活率高，所培育的菌種活性高，培養基對枯草芽孢桿菌的的生長和次級代謝產物的產生有著重要的影響，并能夠通過本發明的培養基(特別是發酵培養基)和優化后的培育方法共同作用使得枯草芽孢桿菌產生伊枯草菌素的量提高，每升發酵液能夠獲得11g左右的伊枯草菌素，試驗過程中最高達到了將近12g，遠遠高出現有技術中的產量。
②本發明中的發酵培養基營養成分豐富，無需后期補料即可獲得高密度菌體和高產伊枯草菌素。
③本發明的發酵工藝簡單，操作方便，有利于伊枯草菌素大規模發酵生產；而且該培養基和培養過程不會產生污染以及二次污染問題，并且其成本較現有技術低。
綜上，本發明的培養基以及培養方法具有極其重要和廣泛的市場應用價值和前景。
具體實施方式
下面對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。以下提供的本發明的實施例的詳細描述并非旨在限制要求保護的本發明的范圍，而是僅僅表示本發明的選定實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通方法人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
實施例1
一種培育高產伊枯草菌素的枯草芽孢桿菌的培養基，包括種子培養基和發酵培養基，所述發酵培養基的成分以及各種成分在水中的含量為：
蔗糖10g/L、破壁啤酒酵母25g/L、水解羽毛粉1g/L、大豆蛋白胨5g/L、小麥水解蛋白1g/L、七水合硫酸鎂0.5g/L和硫酸亞鐵0.05g/L。
實施例2
一種培育高產伊枯草菌素的枯草芽孢桿菌的培養基，包括種子培養基和發酵培養基，所述發酵培養基的成分以及各種成分在水中的含量為：
蔗糖30g/L、破壁啤酒酵母5g/L、水解羽毛粉15g/L、大豆蛋白胨1g/L、小麥水解蛋白5g/L、七水合硫酸鎂0.1g/L和硫酸亞鐵0.1g/L。
實施例3
一種培育高產伊枯草菌素的枯草芽孢桿菌的培養基，包括種子培養基和發酵培養基，所述發酵培養基的成分以及各種成分在水中的含量為：
蔗糖15g/L、破壁啤酒酵母18g/L、水解羽毛粉6g/L、大豆蛋白胨4g/L、小麥水解蛋白3g/L、七水合硫酸鎂0.5g/L和硫酸亞鐵0.05g/L。
實施例4
一種培育高產伊枯草菌素的枯草芽孢桿菌的培養基，包括種子培養基和發酵培養基，所述發酵培養基的成分以及各種成分在水中的含量為：
蔗糖25g/L、破壁啤酒酵母12g/L、水解羽毛粉9g/L、大豆蛋白胨3g/L、小麥水解蛋白4g/L、七水合硫酸鎂0.1g/L和硫酸亞鐵0.1g/L。
實施例5
一種培育高產伊枯草菌素的枯草芽孢桿菌的培養基，包括種子培養基和發酵培養基，所述發酵培養基的成分以及各種成分在水中的含量為：
蔗糖20g/L、破壁啤酒酵母15g/L、水解羽毛粉7g/L、大豆蛋白胨4g/L、小麥水解蛋白3g/L、七水合硫酸鎂0.24g/L和硫酸亞鐵0.06g/L。
實施例6
實施例1～5中的任意一個中所述的種子培養基的成分以及各種成分在水中的含量為：葡萄糖7g/L、圣琪酵母浸出物7g/L、蛋白胨3g/L、氯化鈉8g/L和七水合硫酸鎂0.5g/L。
實施例7
實施例1～5中的任意一個中所述的種子培養基的成分以及各種成分在水中的含量為：葡萄糖14g/L、圣琪酵母浸出物3g/L、蛋白胨7g/L、氯化鈉8g/L和七水合硫酸鎂0.5g/L。
實施例8
實施例1～5中的任意一個中所述的種子培養基的成分以及各種成分在水中的含量為：葡萄糖9g/L、圣琪酵母浸出物7g/L、蛋白胨4g/L、氯化鈉8g/L和七水合硫酸鎂0.5g/L。
實施例9
實施例1～5中的任意一個中所述的種子培養基的成分以及各種成分在水中的含量為：葡萄糖12g/L、圣琪酵母浸出物5g/L、蛋白胨5g/L、氯化鈉8g/L和七水合硫酸鎂0.5g/L。
實施例10
實施例1～5中的任意一個中所述的種子培養基的成分以及各種成分在水中的含量為：葡萄糖10g/L、圣琪酵母浸出物5g/L、蛋白胨5g/L、氯化鈉8g/L和七水合硫酸鎂0.5g/L。
實施例11
培育枯草芽孢桿菌的發酵培養基的制備方法為：根據發酵培養基中載體水的體積量，然后按上述實施例1～5中任意一個實施例所述的比例稱取蔗糖、破壁啤酒酵母、水解羽毛粉、大豆蛋白胨、小麥水解蛋白、七水合硫酸鎂和硫酸亞鐵，然后將這些成分加至水中，攪拌均勻，滅菌處理；
培育枯草芽孢桿菌的種子培養基的制備方法為：根據種子培養基中載體水的體積量，然后按上述實施例6～10中任意一個實施例所述的比例稱取葡萄糖、圣琪酵母浸出物、蛋白胨、氯化鈉和七水合硫酸鎂，然后將這些成分加至水中，攪拌均勻，滅菌處理。
實施例12
11、一種枯草芽孢桿菌的培養方法，其包括以下步驟：
S1：種子培養：取斜面保存的枯草芽孢桿菌菌種，將枯草芽孢桿菌菌種接種于裝有300ml種子培養基的1L三角瓶中，接種后，種子培養基中的芽孢含量約為106cfu/ml，于33℃下，160rpm搖床培養8-10h，培養至種子液中的OD值為1-2時停止培養，即制得一級種子液；
按10％的接種量將上述制得的一級種子液接種于裝有400ml種子培養基的1L三角瓶中，于33℃下，150rpm搖床培養12h左右，培養至種子液中的OD值為3-4時停止培養，即制得二級種子液；
上述的種子培養基為按以下配方配制：10g葡萄糖/1L水,5g圣琪酵母浸出物/1L水，5g蛋白胨/1L水，8g氯化鈉/1L水，0.5g七水合硫酸鎂/1L水。
S2：發酵培養：將30L的所述發酵培養基裝在50L發酵罐中，將步驟S1中制得的二級種子液按10％的體積比例加入發酵罐中進行發酵培養，該發酵培養的過程包括前8小時的増菌培養階段、8-60小時時的中前期的發酵表達階段和60-72小時的后期的發酵表達階段；
該發酵培養基中為按以下配方及比例配制：10g蔗糖/1L水、5g破壁啤酒酵母/1L水、1g水解羽毛粉/1L水、1g大豆蛋白胨/1L水、1g小麥水解蛋白/1L水、0.1g七水合硫酸鎂/1L水、0.05g硫酸亞鐵/1L水。
具體發酵中的具體參數如下表1所示。
表1 發酵罐中發酵工藝的參數
S3：檢測：步驟S2中發酵結束以后，取發酵上清用0.45μm濾膜過濾除菌后，采用10KD超濾管進行二次超濾分離；由于超濾分離得到的是截留后的濾出液，而小分子的鹽類也隨之在濾出液中存在，故需要對濾出液進行脫鹽處理,該脫鹽處理選用截留分子量為1000Da的透析袋除去鹽分而保留目的多肽，然后真空冷凍干燥，再以冷凍前樣品體積的1/10的比例加雙蒸水溶解，0.45μm濾膜過濾備用。
采用高效液相色譜法測定伊枯草菌素含量(標品有上海佑隆生物技術有限公司提供，純度99.9％)。色譜條件為：色譜柱C18×150mm，流動相為45％乙腈：5％甲醇：50％水，流速為0.8ml/min，波長為280nm。經檢測，經過72h發酵，發酵液上清中的伊枯草菌素含量為8.64g/L，伊枯草菌素含量較高，其說明了本發明中的培養基和優化后的培養方法對枯草芽孢桿菌的的生長較好以及其次級代謝產物的產生量較大。
實施例13
一種枯草芽孢桿菌的培養方法，其包括以下步驟：
S1：種子培養：同實施例12的步驟S1，這里不再重復限定；
S2：發酵培養：將30L的所述發酵培養基裝在50L發酵罐中，將步驟S1中制得的二級種子液按10％的體積比例加入發酵罐中進行發酵培養，該發酵培養的過程包括前8小時的増菌培養階段、8-60小時時的中前期的發酵表達階段和60-72小時的后期的發酵表達階段；具體發酵中的具體參數如下表1所示。
該發酵培養基中為按以下配方及比例配制：15g蔗糖/1L水、12g破壁啤酒酵母/1L水、8g水解羽毛粉/1L水、2.5g大豆蛋白胨/1L水、2.5g小麥水解蛋白/1L水、0.25g七水合硫酸鎂/1L水、0.075g硫酸亞鐵/1L水。
S3：檢測：具體過程同實施例12步驟S3，這里不再重復限定。經檢測，經過72h發酵，發酵液上清中的伊枯草菌素含量為9.33g/L，伊枯草菌素含量較高，其也同時說明了本發明中的發酵培養基對枯草芽孢桿菌的的生長和次級代謝產物的產生有著重要的影響。
實施例14
一種枯草芽孢桿菌的培養方法，其包括以下步驟：
S1：種子培養：同實施例12的步驟S1，這里不再重復限定；
S2：發酵培養：將30L的所述發酵培養基裝在50L發酵罐中，將步驟S1中制得的二級種子液按10％的體積比例加入發酵罐中進行發酵培養，該發酵培養的過程包括前8小時的増菌培養階段、8-60小時時的中前期的發酵表達階段和60-72小時的后期的發酵表達階段；具體發酵中的具體參數如下表1所示。
該發酵培養基中為按以下配方及比例配制：15g蔗糖/1L水、20g破壁啤酒酵母/1L水、13g水解羽毛粉/1L水、2.5g大豆蛋白胨/1L水、4g小麥水解蛋白/1L水、0.25g七水合硫酸鎂/1L水、0.075g硫酸亞鐵/1L水。
S3：檢測：具體過程同實施例12步驟S3，這里不再重復限定。經檢測，經過72h發酵，發酵液上清中的伊枯草菌素含量為10.95g/L，伊枯草菌素的含量極高，其說明了發酵培養基對枯草芽孢桿菌的的生長和次級代謝產物的產生有著重要的影響。
實施例15
一種枯草芽孢桿菌的培養方法，其包括以下步驟：
S1：種子培養：取斜面保存的枯草芽孢桿菌菌種，將枯草芽孢桿菌菌種接種于裝有300ml種子培養基的1L三角瓶中，接種后，種子培養基中的芽孢含量約為106cfu/ml，于33℃下，160rpm搖床培養8-10h，培養至種子液中的OD值為1-2時停止培養，即制得一級種子液；
按10％的接種量將上述制得的一級種子液接種于裝有400ml種子培養基的1L三角瓶中，于33℃下，150rpm搖床培養12h左右，培養至種子液中的OD值為3-4時停止培養，即制得二級種子液；
上述的種子培養基為按以下配方配制：10g葡萄糖/1L水,7g圣琪酵母浸出物/1L水，5g蛋白胨/1L水，8g氯化鈉/1L水，0.5g七水合硫酸鎂/1L水。
S2：發酵培養：將30L的所述發酵培養基裝在50L發酵罐中，將步驟S1中制得的二級種子液按10％的體積比例加入發酵罐中進行發酵培養，該發酵培養的過程包括前8小時的増菌培養階段、8-60小時時的中前期的發酵表達階段和60-72小時的后期的發酵表達階段；具體發酵中的具體參數如下表1所示。
該發酵培養基中為按以下配方及比例配制：10g蔗糖/1L水、5g破壁啤酒酵母/1L水、1g水解羽毛粉/1L水、1g大豆蛋白胨/1L水、1g小麥水解蛋白/1L水、0.1g七水合硫酸鎂/1L水、0.05g硫酸亞鐵/1L水
S3：檢測：具體過程同實施例12步驟S3，這里不再重復限定。經檢測，經過72h發酵，發酵液上清中的伊枯草菌素含量為9.05g/L，該實施例也說明了種子培養基對枯草芽孢桿菌的生長和次級代謝產物的產生有重要作用，尤其是圣琪酵母浸出物。
具體實施時，本發明中的培養量可根據種子培養基和發酵培養基中各種成分的之間的比值按比例擴大，但不管規模如何，只要比例在本發明的范圍內，便在本發明的保護范圍內，且本發明擴大生產后不會影響最終的結果。
本發明中的七水合硫酸鎂可用硫酸鎂代替，但需要根據分子量適當減少加量便可。
以上所述僅為本發明的優選實施例，并不用于限制本發明，對于本領域技術人員而言，本發明可以有各種改動和變化。凡在本發明的精神和原理之內所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。