本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及棉花根際溶磷菌株的篩選及溶磷效率的鑒定方法。
背景技術(shù)：
：磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的大量元素之一，幾乎參與了植物所有的生命活動(dòng)過程。植物所需磷素90％以上來自土壤，雖然土壤中總磷含量豐富，但是能被植物直接利用的有效磷含量通常在1μmol/L左右，遠(yuǎn)不能滿足植物獲取充足磷營(yíng)養(yǎng)的需求。為了保證作物的產(chǎn)量，往往需要大量施用磷肥，但磷肥一般總利用率不超過25％。大量施用磷肥不僅增加了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的成本，而且造成水體的富營(yíng)養(yǎng)化，破環(huán)生態(tài)環(huán)境。同時(shí)，生產(chǎn)磷肥的不可再生磷礦資源，按目前生產(chǎn)和使用水平，將在2050年枯竭。土壤中有效磷不足和磷肥資源緊缺影響作物產(chǎn)量提高和品質(zhì)改良已成為全球亟待解決的土壤養(yǎng)分問題之一。我國(guó)磷細(xì)菌的研究始于20世紀(jì)50年代。目前，有關(guān)植物根際溶磷菌的研究較多，已涉及到紅樹林、紅三葉、枸杞、苜蓿、紅豆草、小麥、水稻、大豆、玉米等多種植物。研究結(jié)果證明，土壤中磷細(xì)菌能將植物難以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用的形態(tài)，并促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，但實(shí)際應(yīng)用并不廣泛。主要原因是解磷微生物種類繁多，不同植物根際解磷微生物種類不一，不同種類微生物解磷能力相差很大，且解磷的機(jī)制各不相同，加上耕作土壤類型復(fù)雜，很難找到可以滿足所有土壤類型的菌株，因此有必要因地制宜，篩選分離特定土壤特定作物根際解磷微生物，為實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。我國(guó)是棉花的主要生產(chǎn)國(guó)之一，土壤有效磷缺乏、磷肥資源緊缺、耕地資源有限等都制約我國(guó)棉花產(chǎn)量進(jìn)一步的提高，而有關(guān)棉花根際溶磷細(xì)菌的篩選及其溶磷效率的鑒定研究還很薄弱，因此本發(fā)明擬對(duì)我國(guó)棉花根際土壤溶磷細(xì)菌進(jìn)行分離、純化、鑒定，以期篩選出優(yōu)良的溶磷菌株，為我國(guó)棉花產(chǎn)量的提高和微生物菌肥的研制提供理論依據(jù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供棉花根際溶磷菌株的篩選及溶磷效率的鑒定方法，通過初篩、復(fù)篩、提取菌株DNA、PCR擴(kuò)增、序列對(duì)比以及定性和定量的方法，篩選出棉花根際具有高效溶磷效率的菌株，對(duì)于促進(jìn)棉花對(duì)土壤中難溶無機(jī)磷的吸收利用效果明顯，在菌肥的研究方面具有廣闊的市場(chǎng)前景和利用價(jià)值。棉花根際溶磷菌株的篩選及溶磷效率的鑒定方法，包括如下步驟：1、棉花根際土壤的采集采集常用的棉花品種新陸早42號(hào)、45號(hào)、50號(hào)根際的土壤；2、棉花根際土壤理化性質(zhì)的測(cè)定理化性質(zhì)的測(cè)定包括：含水量、PH值、有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、速效磷、全鉀的測(cè)定；3、棉花根際溶磷菌株的分離純化通過有關(guān)微生物分離、純化、培養(yǎng)及功能鑒定的多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，對(duì)棉花根際的溶磷菌株進(jìn)行分離純化；4、溶磷菌種的鑒定通過對(duì)菌株的形態(tài)觀察、革蘭氏染色、抗酸性染色和采用CTAB法提取溶磷細(xì)菌的總DNA，利用細(xì)菌16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后，送生工公司測(cè)序，將菌株的測(cè)序序列在GenBank和EMBL核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)；5、溶磷能力的鑒定溶磷能力的鑒定包括定性和定量?jī)刹糠郑刻鞙y(cè)量并記錄溶磷圈與菌落直徑的比值(D/d)，大約測(cè)量10天；制備純化各個(gè)菌株的發(fā)酵液。繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線后，采用鋁銻比色法測(cè)定發(fā)酵液中水溶性磷含量。有益效果：本發(fā)明對(duì)溶磷微生物在棉花方面的研究為棉花產(chǎn)量的提高和微生物菌肥的研制提供理論依據(jù)。附圖說明圖1是棉花根際溶磷菌株的分離純化圖；圖2是菌液PCR電泳結(jié)果圖；圖3是菌液PCR產(chǎn)物Hha1酶切結(jié)果圖；圖4是有效磷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實(shí)施方式下面通過具體方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例一種棉花根際高效溶磷菌株篩選的方法,包括如下步驟：1、棉花根際土樣采集通過對(duì)角線法采集種植新陸早42號(hào)、新陸早45號(hào)和新陸早50號(hào)三個(gè)棉花品種的地下5-15cm的根際土壤，裝入滅過菌的牛皮紙袋，黑暗4℃冷藏備用。2、棉花根際土壤理化性質(zhì)測(cè)定(1)土壤水分含量測(cè)定：取小量土壤樣品置于滅過菌的小鋁盒中，于烘箱105℃烘烤4h。其中鋁盒、烘干前后鋁盒中的土壤樣品分別稱重，計(jì)算土壤水分含量。(2)土壤樣品制備：將土壤樣品置于報(bào)紙上，攤開，剔除植物殘?bào)w，經(jīng)常翻動(dòng)土樣以加速干燥，并用手捏碎土塊土團(tuán)，使其直徑在1cm以下。風(fēng)干的土樣經(jīng)碾碎后磨碎，過20目的篩子后裝袋并標(biāo)記備用。(3)土壤pH值測(cè)定：將10g土樣樣品置于添加有50ml去離子水的100ml三角瓶中，180rpm搖床搖30min后靜置過濾，取濾液，用pH酸度計(jì)測(cè)其pH值。(4)土壤有機(jī)質(zhì)測(cè)定：用重鉻酸鉀容量法測(cè)定土壤樣品中的有機(jī)質(zhì)含量。(5)土壤全氮量測(cè)定：使用凱氏定氮法測(cè)定土壤樣品中的含氮量。(6)土壤全磷量測(cè)定：使用氫氧化鈉消煮-鉬銻抗比色法測(cè)定土壤樣品中的全磷量。(7)土壤速效磷測(cè)定：依據(jù)土樣pH值，采用碳酸氫鈉法測(cè)定土壤樣品中的速效磷含量。(8)土壤全鉀測(cè)定：使用NaOH熔融—火焰光度計(jì)法測(cè)定土壤樣品中的全鉀量。表一棉花根際土壤理化性棉花品種PH值有機(jī)質(zhì)含量全氮全磷有效磷全鉀新陸早42號(hào)7.6660.873.440.24933.8515.40新陸早45號(hào)7.6750.633.220.36924.523.86新陸早50號(hào)7.6644.943.410.33529.005.453、棉花根際溶磷菌株的分離與純化在無菌條件下稱取土壤樣品10g于90mL無菌水中，振蕩30min后制備棉花根際土壤懸液，梯度為10-1-10-6。無菌操作下,分別取各濃度樣品0.lml涂布于難溶磷平板培養(yǎng)基上,細(xì)菌選10-4-10-6三個(gè)梯度，每梯度重復(fù)3皿。細(xì)菌30℃，倒置培養(yǎng)。觀察平皿的菌落生長(zhǎng)情況，挑取具有溶磷圈的單個(gè)菌落進(jìn)行轉(zhuǎn)接，轉(zhuǎn)接于牛肉膏蛋白胨平板上，連續(xù)轉(zhuǎn)接純化5次后，分別用牛肉膏蛋白胨斜面保存菌種和用甘油保存菌種。4、溶磷菌種鑒定(1)形態(tài)觀察將純化好的溶磷細(xì)菌接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)。觀察菌株的生長(zhǎng)情況和形態(tài)特征。將培養(yǎng)24h的菌株進(jìn)行革蘭氏染色和抗酸性染色。表二溶磷菌的形態(tài)觀察和生理生化特征(2)分子水平鑒定采用CTAB法提取溶磷細(xì)菌的總DNA，利用細(xì)菌16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后，送上海生工公司測(cè)序。將菌株的測(cè)序序列在GenBank和EMBL核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)。5、棉花根際溶磷細(xì)菌溶磷能力的鑒定(1)定性測(cè)定將純化的菌株點(diǎn)接在難溶性無機(jī)磷的固體培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)。每天測(cè)量并記錄溶磷圈與菌落直徑的比值(D/d)，大約測(cè)量10天。按照溶磷圈與菌落直徑的比值的大小初步判斷溶磷菌株溶磷能力的大小。(2)定量測(cè)量制備純化各個(gè)菌株的發(fā)酵液。繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線后，采用鋁銻比色法測(cè)定發(fā)酵液中水溶性磷含量，確定溶磷菌株溶磷能力的大小，并每天測(cè)量發(fā)酵液中的pH值。綜合分析定性測(cè)定和定量測(cè)定的溶磷能力測(cè)定結(jié)果，根據(jù)溶磷圈與菌落直徑比(D/d)和發(fā)酵液中水溶性磷含量的大小篩選出高效的溶磷菌株。表三磷菌的溶磷能力當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3