一種提高衣康酸發酵產量的菌株及其構建和利用菌株生產衣康酸的方法
【專利摘要】本發明涉及基因工程領域，具體的說是一種提高衣康酸發酵產量的菌株及其構建和利用菌株生產衣康酸的方法。所述菌株為土曲霉中插入烏頭酸脫羧酶基因得到得到重組土曲霉。通過基因工程改造構建帶有順烏頭酸脫羧酶基因表達盒PgpdAt1-cad-TtrpC的質粒，將其插入土曲霉中催化順烏頭酸得到過表達順烏頭酸脫羧酶得到重組土曲霉。本發明提供重組菌株的衣康酸發酵產量普遍高于出發菌株。
【專利說明】一種提高衣康酸發酵產量的菌株及其構建和利用菌株生產衣康酸的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程領域，具體的說是一種提高衣康酸發酵產量的菌株及其構建和利用菌株生產衣康酸的方法。
技術背景
[0002]衣康酸是一種重要的化工產品，被美國能源部認為是十二個重要高附加值化學品之一，主要用于腈綸化纖、樹脂、橡膠、涂料、造紙、醫藥、農藥、輕工、食品、絲綢等領域。目前國內外所有深層發酵生產衣康酸的工廠都采用土曲霉。如圖1所示，在土曲霉中衣康酸的代謝途徑是由三羧酸循環分流出來的，三羧酸循環中的順烏頭酸在順烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase, CAD)的催化作用下脫羧形成衣康酸(Kanamasa, S.,Dwiartij L.，Okabej Μ.，Park E.Y., Cloning andfunctional characterization ofthe cis-aconitic acid decarboxylase (CAD)gene from Aspergillus terreus.App1.Microbiol.Biotechnol.，2008，80，223-229)。Li等對土曲霉在高產和低產衣康酸兩種條件下的基因轉錄差異進行了比較分析，發現翻譯成順烏頭酸脫羧酶的cad基因在高產衣康酸條件下的轉錄水平顯著提高(Li，A.，van Luijkj N.，Beekj Μ.，Caspers, Μ.，Punt, P.，van der Werfj Μ., A clone—basedtranscriptomics approach for the identification ofgenes relevantfor itaconic acid production in Aspergillus.Fungal Genet.Biol.,2011，48，602-611)，這一實驗結果表明，順烏頭酸脫羧酶是衣康酸生物合成途徑中的一個關鍵酶，在土曲霉中提聞cad基因的表達水平將有助于提聞衣康酸的發酵廣量。
[0003]關于通過基因工程提高衣康酸發酵產量的研究至今僅有兩篇報道。Tevz等通過在土曲霉A156中過量表達6-磷酸果糖激酶突變體解除了針對磷酸果糖激酶的反饋抑制，強化了糖酵解途徑，把衣康酸的產量提高了大約2倍，同時發酵周期縮短(Tev，G.，Bencina5M., Legisa，Μ.，Enhancing itaconic acid production by Aspergillus terreus.App1.Microbiol.Biotechnol.，2010，87，1657-1664) ；Lin 等通過在土曲霉 NRRL1960 中過量表達透明顫菌血紅蛋白，提高了菌株對低氧的耐受性，并把衣康酸的發酵產量提高了 17% (Lin, Y.H., Li, Y.F., Huang, M.C., Tsai, Y.C., Intracellular expression ofVitreoscilla hemoglobin inAspergillus terreus to alleviate effect of a shortbreak in aerationduirng culture,Biotechnol.Lett.,2004,26, 1067 1072)。但是，關于通過在土曲霉中過表達順烏頭酸脫羧酶提高衣康酸發酵產量的研究，至今未見報道。

【發明內容】

[0004]本發明目的在于提供一種提高衣康酸發酵產量的菌株及其構建和利用菌株生產衣康酸的方法。
[0005]為實現上述目的，本發明采用的技術方案為:
[0006]一種提高衣康酸發酵產量的菌株，所述菌株為通過基因工程改造在土曲霉中插入烏頭酸脫羧酶基因表達盒PgpdAtl-cad-TtrpC得到的重組土曲霉。
[0007]提高衣康酸發酵產量的菌株的構建方法，通過基因工程改造構建順烏頭酸脫羧酶基因表達盒，將其插入土曲霉中得到含有順烏頭酸脫羧酶表達盒的重組土曲霉。
[0008]利用提高衣康酸發酵產量的菌株生產衣康酸的方法，通過基因工程改造構建順烏頭酸脫羧酶基因表達盒，將其插入土曲霉中得到含有順烏頭酸脫羧酶表達盒的重組土曲霉，過表達順烏頭酸脫羧酶來加強催化順烏頭酸生成衣康酸的反應過程，進而提高衣康酸產量。
[0009]所述順烏頭酸脫羧酶表達盒由土曲霉順烏頭酸脫羧酶基因、土曲霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子和構巢曲霉色氨酸合成酶基因終止子組成。將所述重組土曲霉培養于發酵培養基中，所述發酵培養基為:140g L—1 葡萄糖，2g L-1 NH4NO3,0.2g L^i(NH4)2HPO4, 20mg L-1FeSO470.4g L-1 MgSO4^Omgr1 ZnSO4,40mg L-1 CuSO4 和水，用硫酸調整 pH 至 3.5，115°C滅菌 IOrnin0
[0010]本發明所具有的優點:本發明提供的基因工程改造土曲霉以提高衣康酸發酵產量的方法，相較于傳統的物理、化學等誘變方式，本發明方法目的明確，可操作性強，便于篩選。本發明提供重組菌株的衣康酸發酵產量普遍高于出發菌株，其中產量最高的菌株C27比出發菌株提高了約7g/L (9.5%)，具有很強的應用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為本發明【背景技術】中提到的土曲霉產衣康酸代謝途徑圖。
[0012]圖2為本發明實施例提供的載體PSGF957質粒圖譜，hph-casette為潮霉素抗性元件；sgfp為綠色熒光蛋白基因；TtrpC為構巢曲霉色氨酸合成酶終止子；Pmgpd為紅曲霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子。
[0013]圖3為本發明實施例提供的載體pJJL-2質粒圖譜，其中PgpdAtl為土曲霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子。
[0014]圖4為本發明實施例提供的載體pXH-1質粒圖譜，PgpdAtl為土曲霉甘油醛_3_磷酸脫氫酶啟動子JtrpC為構巢曲霉色氨酸合成酶終止子。
[0015]圖5為本發明實施例提供的載體pXH-3質粒圖譜，PgpdAtI為土曲霉甘油醛_3_磷酸脫氫酶啟動子JtrpC為構巢曲霉色氨酸合成酶終止子，cad為順烏頭酸脫羧酶脫羧酶基因。
[0016]圖6為本發明實施例提供的載體pXH-4質粒圖譜，PgpdAtI為土曲霉甘油醛_3_磷酸脫氫酶啟動子JtrpC為構巢曲霉色氨酸合成酶終止子；hph為潮霉素磷酸轉移酶基因，該質粒含有能在土曲霉中過表達hph基因，從而賦予宿主菌潮霉素抗性。
[0017]圖7為本發明實施例提供的重組土曲霉菌株搖瓶發酵產衣康酸能力的比較效果圖，WT為出發菌株CICC40205。
[0018]圖8為本發明實施例提供的HPLC分析菌株發酵液中衣康酸的純度。a:衣康酸標準品；b:出發菌株CICC40205的發酵液；c:重組菌株C27的發酵液；d:重組菌株C5的發酵液。
[0019]圖9為本發明實施例提供的PCR分析部分重組菌株中cad基因表達盒的整合情況。M:200bp DNA maker ;1:重組菌株C5;2:重組菌株C12;3:重組菌株C25;4:重組菌株C27;5:重組菌株C28;6:重組菌株C38;7:pXH-3 (陽性對照);8:出發菌株CICC40205 (陰性對照)。
【具體實施方式】
[0020]載體(vector)是指能夠將DNA片段轉移到受體細胞中的一種能自我復制的環狀DNA分子。
[0021]啟動子(promoter)定義為一種結合RNA聚合酶并指導聚合酶到達編碼序列的正確的轉錄起始位點從而起始轉錄的DNA序列。RNA聚合酶能有效的催化與編碼區適當DNA鏈互補的信息RNA的裝配。啟動子還可以理解為包括用于轉錄mRNA后用于翻譯5’非編碼區(介于啟動子和轉錄起始位點之間)，cis-作用轉錄調控元件，如增強子和能與轉錄因子相互作用的其他核酸序列。
[0022]“同一性”或“同一性百分比”是指兩個氨基酸序列之間或兩個核酸序列之間的序列同一性。為確定兩個氨基酸序列或兩個核酸的同一性百分數，以最佳比較目的對序列進行比對。兩個序列之間的同一性百分比是由這些序列共有的相同位置的數目的函數(即，同一性百分數=相同位置的數目/位置的總數(例如，重疊位置)X100)。例如，“同一性百分比”通過下列方式來計算:在比較窗中比較兩個經最佳比對的序列，測定在兩個序列中出現相同核苷酸堿基或相同氨基酸殘基的位置的數目以產生匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗中位置的總數目(即，窗的大小)，并且將結果乘以100從而產生序列同一性百分比。用于比較的序列的最佳比對可以通過下述來進行:例如，Smith 和 Waterman (Smith, T.F.andffaterman, M.S., Comparison of biosequences, Adv.App1.Math., 1981, 2, 482-489)的局部同源性算法；Needleman 和 Wunsch (NeedlemanS.B.andWunsch C.D., A general method applicable to the search forsimilaritiesin the amino acid sequence of two proteins, J.Mol.Biol., 1970, 48, 443-453.)的同源性比對算法；Pearson 和 Lipman (Pearson W.R.，Lipman D.J.，Improved toolsfor biological sequence comparison, Proc.Natl.Acad.Sc1.，1988，85，2444-2452.)的相似性搜索方法；這些算法的計算機化實施(例如，Wisconsin Genetics SoftwarePackage，Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.中的 GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA);或手工比對和目測檢查(參見，例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology (1995 增干丨J)。
[0023]以下結合具體實施例對本發明的技術路線做進一步詳細說明。
[0024]本發明中質粒提取釆用OMEGA公司Plasmid Mini Kit I試劑盒(D6942-01)，DNA片段回收是釆用OMEGA公司Cycle-Pure Kit試劑盒(D6492-01)，凝膠回收是釆用OMEGA公司Gel Extraction Kit試劑盒(D2500-01 )。土曲霉CICC40205菌株購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。
[0025]實施例1 土曲霉順烏頭酸脫羧酶基因cad表達盒的構建
[0026]1.1表達載體pXH-1的構建
[0027]以 TtrpC-F(5，-cagacatgtagatctaagcttgcggccgcacttaacgttactgaaatc_3，)和TtrpC-R(5，-gtcgtgccagtcgactctaga-3，)為引物對，以質粒 pSGF957 (由 Seoul Nationaluniversity 得到，構建質粒圖譜如圖 2，Kimj J.G.，Choij Y.D.，Changj Y.J.，Kimj S.U.，Genetictransformation of Monascus purpureus DSMl379， Biotechnology Letters，2003，25，1509 - 1514)為模板進行 PCR 擴增 TtrpC 片段，產物經 Pci KFermentasj CatalogN0.:#ER1871)和Xba I酶切并純化。pJJL_2是將PgpdAtl啟動子片段克隆在pMD18_simple載體上(Takara，Catalog N0.:D103A)，然后通過定點突變除去pMD18_simple質粒上的PciI酶切位點所獲得(質粒圖譜參見圖3)，其具體構建方法參照中國專利:一種絲狀真菌甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(gpd)的啟動子及其應用(申請號201210116163.7)。用Pci I和Xba I對質粒pJJL-2進行酶切，回收載體片段。將回收的pJJL_2片段和TtrpC片段經T4連接酶連接得到質粒pXH-1 (參見圖4)。
[0028]1.2 土曲霉順烏頭酸脫羧酶基因的克隆
[0029]本發明所使用的土曲霉CICC40205菌株購自中國工業微生物菌種保藏管理中心。根據土曲霉NIH2624基因組數據庫公布的信息設計引物cad-Fl (5’ -gcattccatgaccaaacaatctgcggacagc-3，)和 cad-Rl (5， -ggcggatccttataccagtggcgatttcacgg-3，)，以土曲霉CICC40205的cDNA為模板擴增土曲霉順烏頭酸脫羧酶基因，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測長度約為1500bp的條帶為目的產物，目的條帶產物經割膠回收純化后TA克隆至pMD18_T載體(TaKaRa，Catalog N0.:D101A)中，測序后得到質粒pXH_2。測序結果顯示克隆的DNA條帶為土曲霉順烏頭酸脫羧酶基因，核苷酸序列為SEQ ID N0.1，對應的氨基酸序列為SEQ ID N0.2。與已完成基因組測序的土曲霉NIH2624菌株的基因ATEG—09971相比較，同源性為96%，與Kanamasa等人克隆的cad基因(GenBank:AB326105.1)的同源性為 100% (Kanamasa, S.，Dwiartij L，Okabej M.，Park E.Y.，Cloning andfunctionalcharacterization of the cis-aconitic acid decarboxylase (CAD)gene fromAspergillus terreus.App1.Microbiol.Biotechnol.，2008，80，223-229)。
[0030]SEQ ID N0.1:
[0031]
【權利要求】
1.一種提高衣康酸發酵產量的菌株，其特征在于:所述菌株為通過基因工程改造在土曲霉中插入烏頭酸脫羧酶基因表達盒PgpdAtl-Cad-TtrpC得到的重組土曲霉。
2.—種權利要求1所述的提高衣康酸發酵產量的菌株的構建方法，其特征在于:通過基因工程改造構建順烏頭酸脫羧酶基因表達盒，將其插入土曲霉中得到含有順烏頭酸脫羧酶表達盒的重組土曲霉。
3.一種權利要求1所述的利用提高衣康酸發酵產量的菌株生產衣康酸的方法，其特征在于:通過基因工程改造構建順烏頭酸脫羧酶基因表達盒，將其插入土曲霉中得到含有順烏頭酸脫羧酶表達盒的重組土曲霉，過表達順烏頭酸脫羧酶來加強催化順烏頭酸生成衣康酸的反應過程，進而提高衣康酸產量。
4.按權利要求3所述的利用提高衣康酸發酵產量的菌株生產衣康酸的方法，其特征在于:所述順烏頭酸脫羧酶表達盒由土曲霉順烏頭酸脫羧酶基因、土曲霉甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子和構巢曲霉色氨酸合成酶基因終止子組成。
5.按權利要求3所述的利用提高衣康酸發酵產量的菌株生產衣康酸的方法，其特征在于:將所述重組土曲霉培養于發酵培養基中，所述發酵培養基為=HOgL-1葡萄糖，2g L-1NH4NO3,0.2g L-1 (NH4)2HPO4, 20mg L-1 FeSO4,0.4g L-1 MgSO4,40mg L-1 ZnSO4,40mg L-1 CuSO4和水，用硫酸調整pH至3.5，115°C滅菌IOmin0
【文檔編號】C12R1/66GK103834582SQ201210477312
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月22日 優先權日:2012年11月22日
【發明者】李建軍, 黃雪年, 呂雪峰, 李悅明, 張希銘, 李霞 申請人:中國科學院青島生物能源與過程研究所, 青島科海生物有限公司