本發明涉及一種熒光分子探針及納米探針，特別涉及一種具有水溶性以及具有聚集誘導發射效應的熒光分子探針和熒光納米探針，及它們的制備方法，特別還涉及到該熒光分子探針在白蛋白的檢測方面的應用，屬于化學分析、生物分析檢測技術領域。

背景技術：

人血清白蛋白(HSA)是人體血液中一種主要的蛋白，在維持血漿膠體滲透壓，運輸內源性和外源性分子包括許多藥物起著關鍵的作用。研究證明，HSA在體液中的濃度與許多疾病包括癌癥、類風濕性關節炎、心肌缺血和肝功能衰竭的進展密切相關(G.Fanali,A.di Masi,V.Trezza,M.Marino,M.Fasano,P.Ascenzi,Mol Aspects Med.2012,33,209；V.Arroyo,R.Garcia-Martinez,X.Salvatella,J.Hepatol.2014,61,396；C.-E.Ha,N.V.Bhagavan,BBA-Gen.Subjects 2013,1830,5486；J.Rozga,T.Piatek,P.Malkowski,Ann.Transpl.2013,18,205.)。人體中HSA的含量作為一個可靠的健康指標，其正常水平約為35–55g L^-1(527-828μmolL^-1)。血漿中低水平的白蛋白與肝硬化、慢性肝炎和肝衰密切相關。相反，尿液中過量的HSA存在，被公認為是診斷糖尿病、高血壓、心血管疾病和腎臟疾病的一個指標。因此，高選擇性、高靈敏度、準確的檢測人體液中HSA的含量，尤其是血清中的含量，在臨床診斷中具有重要的意義。

目前為止，包括染料結合熒光分析法，基于抗體(免疫組化)方法，以及質譜為基礎的蛋白質組學技術，用于血液樣品中白蛋白的定量檢測。在眾多的方法中，基于熒光的分析法由于其快速、靈敏、非破壞性和適用于高通量檢測的優異特點，已被廣泛的應用于不同樣品中HAS含量的檢測。但是，已經報道的熒光探針具有一些局限性，例如，一些探針在水溶液中溶解性差，使得它很難在生物系統中應用(X.Fan,Q.He,S.Sun,H.Li,Y.Pei,Y.Xu,Chem.Commun.2016,52,1178.)。另外，一些文獻報道的探針檢測白蛋白，是通過共價鍵與蛋白的巰基或者是氨基結合來實現的(P.Anees,S.Sreejith,A.Ajayaghosh,J.Am.Chem.Soc.2014,136,13233；M.Cieplak,K.Szwabinska,M.Sosnowska,B.K.C.Chandra,P.Borowicz,K.Noworyta,F.D’Souza,W.Kutner,Biosens.Bioelectron.2015,74,960.)。但是，這種不可逆的結合可能會導致蛋白的變性。此外，大部分檢測白蛋白的熒光探針利用傳統的有機染料分子作為熒光發射基團，這類分子在生理緩沖液中容易產生聚集，然而，聚集之后由于聚集體的激發態非輻射弛豫導致熒光淬滅。研究者們為了克服這一缺陷，不得不使用極稀的探針溶液和溶解度高的探針來用于蛋白的檢測。然而，稀溶液的探針同樣面臨發射熒光弱、靈敏度差等問題。此外，即使在稀溶液中聚集導致淬滅的影響也無法完全避免，因為，在生物分析中熒光探針分子可能積聚在生物大分子和蛋白質的疏水腔的表面，導致熒光淬滅。因此，設計熒光探針具有完全水溶性，并且能夠克服聚集誘導淬滅的缺陷來檢測人血清白蛋白是非常關鍵的。

技術實現要素：

針對現有檢測血清蛋白的熒光探針的性能存在的不足，本發明的第一個目的是在于提供一種水溶性好，且同時具有聚集誘導效應的熒光分子探針。

本發明的第二個目的是在于提供一種由水溶性好且具有聚集誘導效應的熒光分子探針在水溶液中自組裝形成熒光納米探針。

本發明的第三個目的是在于提供一種操作簡單、原料易得的制備所述熒光分子探針的方法。

本發明的第四個目的是在于提供一種操作簡單、條件溫和的制備熒光納米探針的方法。

本發明的第五個目的是在于提供一種所述的熒光納米探針在檢測血液中白蛋白的應用；所述的熒光分子探針在水溶液中自組裝形成疏松的納米粒，與白蛋白作用后發生脫組裝，探針分子進入蛋白的疏水性空腔而限制探針分子的旋轉而發射熒光來實現對蛋白的檢測，表現出靈敏度高、選擇性好的特點。

為了實現上述技術目的，本發明提供了一種具有水溶性及聚集誘導發射效應的熒光分子探針，具有式1結構：

其中，

R₁、R₂和R₃獨立選自氫、鹵素、烷基、羥基、烷氧基、硝基、羧基或胺基；

R₄選自C₁～C₁₃脂肪鏈或C₈～C₁₃含芳基的烷鏈。

優選的方案，R₂和R₃均選自氫、氟、氯、溴、碘、甲基、羥基、甲氧基、硝基、羧基或二甲胺基；較優選的方案，R₂和R₃均選自氫。

優選的方案，R₄選自C₂～C₈烷鏈或1,4-二亞甲基苯基基團。

優選的方案，R₁選自氫、氟、氯、溴、碘、甲基、羥基、甲氧基、硝基、羧基或二甲胺基，較優選的方案，R₁選自氫。

本發明還提供了一種熒光納米探針，是由所述熒光分子探針自組裝形成。式1結構的熒光分子探針在水溶液中通過自組裝形成聚集態納米粒，聚集態納米粒主要由熒光分子探針單體、寡聚體和多聚體構成。

本發明還提供了一種制備所述的具有水溶性及聚集誘導發射效應的熒光探針分子的方法，該方法包括以下步驟：

1)4-甲酰基吡啶、式2苯胺類化合物和式3苯偶酰類化合物在醋酸/醋酸銨體系中進行環化反應，得到式4中間體；

2)式4中間體與式5二溴代化合物進行親核取代反應，得到式6中間體；

3)式6中間體與吡啶發生親核取代反應，即得；

其中，

R₁、R₂和R₃獨立選自氫、鹵素、烷基、羥基、烷氧基、硝基、羧基或胺基；

R₄選自C₁～C₁₃脂肪鏈或C₈～C₁₃含芳基的烷鏈。

優選的方案，1)中的反應過程為：將4-甲酰基啶和苯胺類化合物在冰醋酸溶劑中攪拌0.5～1.5h，再加入苯偶酰類化合物和醋酸銨，在110～130℃溫度下反應8～16h。

優選的方案，2)中的反應條件為：采用乙腈作為溶劑，在80～95℃反應6～10小時。

優選的方案，3)中的反應條件為：采用吡啶作為溶劑，在80～95℃反應6～10小時。

本發明還提供了一種制備所述的熒光納米探針的方法，該方法是將所述的熒光分子探針溶于有機溶劑后，加入到水溶液中，超聲處理，即得熒光納米探針。

優選的方案，有機溶劑選自甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺、二甲亞砜、四氫呋喃、乙腈中的至少一種。

優選的方案，水溶液選自純水、生理鹽水、磷酸緩沖溶液、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液或三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽緩沖溶液。

本發明還提供了一種所述熒光納米探針的應用，將熒光納米探針應用于血清白蛋白的檢測。

優選的方案，將熒光納米探針應用于化學溶液體系、患者血液或生物組織中白蛋白的熒光定量分析檢測。

本發明的熒光探針分子是一種典型的bola型分子，具有多苯基取代咪唑環和四級銨鹽結構，中間通過疏水性烷基鏈連接。探針分子具有良好的水溶性，在水中自組裝形成有機納米粒，且沒有熒光。與白蛋白識別之后，發生脫組裝，探針分子進入蛋白的疏水性空腔，與蛋白的氨基酸殘基發生氫鍵作用和疏水作用，最終導致限制探針分子的旋轉而產生熒光。其檢測原理如圖5。

本發明的具有水溶及聚集誘導效應熒光分子探針制備路線如下(以R₁、R₂，和R₃為氫，R₄＝C₂、C₄、C₆、C₈、C₁₀、C₁₂烷鏈為例進行具體說明)：

本發明的具有水溶性及聚集誘導效應的熒光分子探針的具體制備方法通過如下步驟實現：

a、將4-甲酰基吡啶和苯胺溶解于冰醋酸中，常溫攪拌1小時，然后依次加入苯偶酰和醋酸銨混合均勻，繼續加熱120℃回流反應過夜，TLC檢測反應完全后用氫氧化鈉溶液調pH至近中性有沉淀產生，減壓過濾得濾餅，干燥，柱色譜分離純化得到化合物1；

b、將化合物1溶解于乙腈中，加入二溴化合物(1,2-二溴乙烷、1,4-二溴丁烷、1,6-二溴己烷、1,4-二(溴甲基)苯、1,8-二溴辛烷、1,10-二溴癸烷或1,12-二溴十二烷)；體系混合均勻后，90℃加熱回流，反應結束后，減壓蒸餾除掉溶劑，柱色譜分離純化得到化合物2、化合物4、化合物6、化合物8、化合物10、化合物12或化合物14；

c、將化合物2、化合物4、化合物6、化合物8、化合物10、化合物12或化合物14溶解在吡啶中，體系加熱90℃回流反應，反應結束后，減壓蒸餾除掉溶劑，柱色譜分離純化得到目標產物。

本發明的熒光納米探針的制備方法通過如下步驟實現：

將目標產物充分溶解于有機溶劑中制備成母液，然后用移液槍吸取母液，在超聲條件下加入到一定量的水溶液中，體系常溫攪拌30min后即得檢測血清白蛋白用的有機納米粒。利用動態光散射(DLS)、和投射電鏡(TEM)來觀察形成納米粒的粒徑和形貌。

本發明的技術方案基于熒光納米探針檢測白蛋白的方法是充分利用了熒光分子探針在水溶液中自組裝形成納米粒，且形成的納米粒溶液沒有熒光，而在白蛋白存在時，發生脫組裝，探針分子進入蛋白的疏水性空腔，與蛋白的氨基酸殘基發生氫鍵作用和疏水作用，最終導致限制探針分子的旋轉而產生熒光。本發明正是基于此而建立檢測白蛋白的方法，該方法抗干擾強、靈敏度高，可以廣泛推廣應用。

本發明的熒光納米探針能夠用于化學模擬生物體系中白蛋白的檢測；也可用臨床醫學上血清中白蛋白的檢測。

相對現有技術，本發明的技術方案帶來的有益技術效果：

1)本發明的熒光分子探針具有水溶性好，可以在水中自組裝形成無熒光的納米粒的特點，且其具有聚集誘導發射效應，與白蛋白作用時發生脫組裝，產生480nm的熒光，特別適用于熒光檢測。

2)本發明的熒光探針分子及熒光納米探針的制備方法簡單、成本低，有利于大規模生產。

3)本發明的熒光納米探針用于檢測血清等中的白蛋白，該探針對白蛋白具有很好的選擇性，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、免疫球蛋白、葡萄糖氧化酶、組氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、賴氨酸、谷胱甘肽、ATP、葡萄糖等對白蛋白的檢測沒有干擾，該納米探針溶液的熒光強度與白蛋白的濃度在一定的濃度范圍內(白蛋白的濃度范圍0-15μM)具有良好的線性關系，顯示出定量檢測特性，完全可以滿足臨床上對患者血液中白蛋白的含量檢測的要求。

4)本發明的熒光納米探針對白蛋白的響應時間短(15s)，測定的靈敏度高，抗干擾能力強，操作簡單，成本低廉，使得其適合推廣運用。

附圖說明

【圖1】本發明實施例1中制備的熒光納米探針動態光散射圖。

【圖2】本發明實施例1中制備的熒光納米探針的投射電鏡圖。

【圖3】本發明實施例1中熒光納米探針的熒光強度與白蛋白濃度的線性關系，橫坐標為白蛋白濃度，縱坐標為熒光強度。

【圖4】本發明實施例1中熒光納米探針對白蛋白的選擇性。

【圖5】為熒光納米探針用于白蛋白檢測的原理圖。

具體實施方式

以下實施方式旨在進一步闡釋說明本發明而不是對本發明的限定。

實施例1

本發明的聚集誘導熒光發射增強的目標物3(實例中R₁、R₂、R₃＝H、R₄＝C₂)的合成，合成路線如下：

化合物1的合成：分別稱取4-甲酰基吡啶(1.06g,10mmol)和苯胺(0.91ml，10mmol)溶解在100mL冰醋酸當中，室溫攪拌一小時。苯偶酰(2.1g，10mmol)和醋酸銨(3.55g，46mmol)順序加入到反應體系中，化合物在120℃條件下反應過夜，反應結束后反應體系倒入到300mL冰水中，用0.1mmol/L的氫氧化鈉溶液調解體系pH至中性，混合物過濾用水洗三遍，真空干燥后硅膠柱層析分離純化得到產物。產率為42％。核磁共振分析結果為：¹H NMR(400MHz,CDCl₃,δ):8.48–8.47(d,J＝2H),7.58-7.60(d,J＝2H),7.31-7.35(m,4H),7.22-7.29(m,7H),7.13-7.14(d,2H),7.09-7.10(d,2H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl3,δ):149.71,143.84,139.20,137.78,136.65,133.96,132.46,131.05,130.00,129.48,129.01,128.47,128.34,128.30,128.27,127.32,126.97,122.32.HRMS(ESI)m/z:計算值C₂₆H₁₉N₃,373.1579[M]；發現374.1651[M+H]⁺.

化合物2的合成：稱取化合物1(0.19g,0.50mmol)和化合物1,2-二溴乙烷(93mg,0.50mmol)溶解在15mL乙腈中，室溫充分攪拌，反應體系在90℃充分回流10小時，TLC板監測反應完全后，減壓蒸餾除去溶劑，硅膠柱層析分離得到產物2。產率為45％。核磁共振分析結果為：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,δ):9.09–9.11(d,2H),7.81-7.82(d,2H),7.51-7.55(m,7H),7.25-7.42(m,8H),3.48-3.50(t,2H),3.40-3.43(t,2H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆,δ):145.39,144.84,141.81,140.85,140.41,137.23,137.04,136.75,135.92,133.49,133.41,131.35,130.79,129.16,128.96,127.06,123.72,123.48,60.74,32.08.

化合物3的合成：稱取化合物2(110mg，0.20mmol)溶解在10mL吡啶溶液中，室溫充分攪拌，反應體系在90℃充分回流8小時，TLC板監測反應完全后，減壓蒸餾除去溶劑，硅膠柱層析分離得到產物3。產率為53％。核磁共振分析結果為：¹H NMR(400MHz,CDCl₃,δ):9.14-9.15(d,2H),8.94-8.96(d,2H),8.68-8.72(t,1H),8.19-8.23(t,2H)7.77-7.79(d,2H),7.50-7.55(m,7H),7.27-7.37(m,8H),5.29-5.32(t,2H),5.20-5.23(t,2H),1.88-1.92(m,4H),1.23-1.32(m,4H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆,δ):147.08,145.80,145.48,144.77,140.57,140.43,136.80,135.84,133.45,131.37,130.66,130.47,130.11,129.78,129.15,128.93,128.87,128.58,128.06,127.01,124.12,59.58,59.05.

實施例2

本發明的聚集誘導熒光發射增強的目標物5(實例中R₁、R₂、R₃＝H、R₄＝C₄)的合成，合成路線如下：

化合物1的合成：分別稱取4-甲酰基吡啶(1.06g,10mmol)和苯胺(0.91ml，10mmol)溶解在100mL冰醋酸當中，室溫攪拌一小時。苯偶酰(2.1g，10mmol)和醋酸銨(3.55g，46mmol)順序加入到反應體系中，化合物在120℃條件下反應過夜，反應結束后反應體系倒入到300mL冰水中，用0.1mmol/L的氫氧化鈉溶液調解體系pH至中性，混合物過濾用水洗三遍，真空干燥后硅膠柱層析分離純化得到產物。產率為42％。核磁共振分析結果為：¹H NMR(400MHz,CDCl₃,δ):8.48–8.47(d,J＝2H),7.58-7.60(d,J＝2H),7.31-7.35(m,4H),7.22-7.29(m,7H),7.13-7.14(d,2H),7.09-7.10(d,2H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl3,δ):149.71,143.84,139.20,137.78,136.65,133.96,132.46,131.05,130.00,129.48,129.01,128.47,128.34,128.30,128.27,127.32,126.97,122.32.HRMS(ESI)m/z:計算值C₂₆H₁₉N₃,373.1579[M]；發現374.1651[M+H]⁺.

化合物4的合成：稱取化合物1(0.19g,0.50mmol)和化合物1,4-二溴丁烷(0.106g,0.50mmol)溶解在15mL乙腈中，室溫充分攪拌，反應體系在90℃充分回流10小時，TLC板監測反應完全后，減壓蒸餾除去溶劑，硅膠柱層析分離得到產物4。產率為51％。核磁共振分析結果為：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,δ):8.90-8.92(d,2H),7.79-7.81(d,2H),7.48-7.53(m,7H),7.26-7.36(m,8H),4.50-4.54(t,2H),3.54-3.57(t,2H),1.98-2.01(m,2H),1.79-1.82(m,2H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆,δ):144.99,144.17,140.55,140.33,136.51,135.96,133.54,131.38,130.63,129.71,129.30,129.12,128.98,128.91,127.99,127.01,124.12,59.60,34.36,29.61,29.16.

化合物5的合成：稱取化合物4(120mg，0.20mmol)溶解在10mL吡啶溶液中，室溫充分攪拌，反應體系在90℃充分回流8小時，TLC板監測反應完全后，減壓蒸餾除去溶劑，硅膠柱層析分離得到產物5。產率為53％。核磁共振分析結果為：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,δ):9.29-9.30(d,2H),9.10-9.12(d,2H),8.61-8.65(t,1H),8.16-8.20(t,2H)7.77-7.79(d,2H),7.49-7.53(m,7H),7.26-7.37(m,8H),4.76-4.80(t,2H),4.65-4.69(t,2H),1.91-1.98(m,4H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆,δ):144.67,144.05,143.82,142.73,139.19,138.93,135.12,134.58,132.18,130.01,129.29,129.07,128.35,127.94,127.76,127.54,127.21,126.61,125.63,122.61,58.62,57.91,26.25,25.89.

實施例3

本發明的聚集誘導熒光發射增強的目標物7(實例中R₁、R₂、R₃＝H、R₄＝C₆)的合成，合成路線如下：

化合物1的合成：分別稱取4-甲酰基吡啶(1.06g,10mmol)和苯胺(0.91ml，10mmol)溶解在100mL冰醋酸當中，室溫攪拌一小時。苯偶酰(2.1g，10mmol)和醋酸銨(3.55g，46mmol)順序加入到反應體系中，化合物在120℃條件下反應過夜，反應結束后反應體系倒入到300mL冰水中，用0.1mmol/L的氫氧化鈉溶液調解體系pH至中性，混合物過濾用水洗三遍，真空干燥后硅膠柱層析分離純化得到產物。產率為42％。核磁共振分析結果為：¹H NMR(400MHz,CDCl₃,δ):8.48–8.47(d,J＝2H),7.58-7.60(d,J＝2H),7.31-7.35(m,4H),7.22-7.29(m,7H),7.13-7.14(d,2H),7.09-7.10(d,2H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl3,δ):149.71,143.84,139.20,137.78,136.65,133.96,132.46,131.05,130.00,129.48,129.01,128.47,128.34,128.30,128.27,127.32,126.97,122.32.HRMS(ESI)m/z:計算值C₂₆H₁₉N₃,373.1579[M]；發現374.1651[M+H]⁺.

化合物6的合成：稱取化合物1(0.19g,0.50mmol)和化合物1,6-二溴己烷(0.12g,0.50mmol)溶解在15mL乙腈中，室溫充分攪拌，反應體系在90℃充分回流10小時，TLC板監測反應完全后，減壓蒸餾除去溶劑，硅膠柱層析分離得到產物6。產率為54％。核磁共振分析結果為：¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,δ):8.91-8.93(d,2H),7.79-7.80(d,2H),7.49-7.54(m,7H),7.28-7.37(m,8H),4.46-4.50(t,2H),3.51-3.54(t,2H),1.78-1.91(m,2H),1.78-1.81(m,2H),1.24-1.43(m,4H)；¹³C NMR(125MHz,DMSO-d₆,δ):143.36,142.41,138.93,138.61,134.80,134.32,131.90,129.74,129.00,128.78,128.08,127.67,127.51,127.35,127.29,126.35,125.36,122.40,58.74,33.83,30.66,30.14,25.66,23.30.

化合物7的合成：稱取化合物6(110mg，0.21mmol)溶解在10mL吡啶溶液中，室溫充分攪拌，反應體系在90℃充分回流8小時，TLC板監測反應完全后，減壓蒸餾除去溶劑，硅膠柱層析分離得到產物3。產率為53％。核磁共振分析結果為：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,δ):9.29-9.30(d,2H),9.10-9.12(d,2H),8.61-8.65(t,1H),8.16-8.20(t,2H)7.77-7.79(d,2H),7.49-7.53(m,7H),7.26-7.37(m,8H),4.76-4.80(t,2H),4.65-4.69(t,2H),1.91-1.98(m,4H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆,δ):145.13,144.56,144.34,143.21,139.78,139.43,135.62,135.15,132.74,130.58,129.85,129.62,128.91,128.52,128.33,128.19,128.11,127.71,127.17,126.18,123.15,59.97,59.24,29.97,29.65,24.24,24.20.

實施例4

熒光有機納米探針的制備：

用移液槍取20μL化合物7(1mM)的二甲亞砜溶液，超聲條下中加入到2mL的磷酸緩沖溶液(10mM，pH＝7.4)中使化合物3的最終濃度為10μM。室溫條件下攪拌30min體系有乳光產生，為了驗證其納米聚集行為，動態光散射實驗測定其平均粒徑為101nm，如附圖1所示。

實施例5

制備的熒光納米探針的投射電子顯微鏡(TEM)測試：

吸取一滴實施例4中所制備的溶液，滴于銅網上，用濾吸干水分，自然晾干，置于投射電鏡中進行觀察。投射電鏡圖片如附圖2所示。

實施例6

熒光納米探針的熒光強度與白蛋白濃度的線性關系：

向實施例4中所制備的體系中分別加入10μL的白蛋白溶液液，使白蛋白的最終濃度分別達到，1.5μM、3.0μM、4.5μM、6.0μM、7.5μM、9.0μM、10.5μM、12.0μM、13.5μM、15.0μM、18.0μM、21μM。所有測試溶液配制完成后，利用渦旋儀使其混合均勻。室溫孵育1min后測量其在480nm處的熒光發射強度。所得結果如附圖3所示，體系中480nm的熒光強度與白蛋白的濃度在0–15μM之間具有很好的線性關系。

實施例7

熒光納米探針對白蛋白檢測的選擇性：

使用實施例4中所制備的溶液作為熒光納米探針，并評價該探針對白蛋白的選擇性，該納米探針的激發波長為380nm。該體系中化合3的濃度為10μM，分別向該體系加入白蛋白使其濃度為15μM，以及5倍摩爾當量的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、免疫球蛋白、葡萄糖氧化酶、組氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、賴氨酸、谷胱甘肽、ATP、葡萄糖混合充分后，室溫孵育1min后，測其熒光發射光譜并記錄480nm處熒光發射的強度。結果如附圖5所示，只有加入白蛋白的體系中產生強的藍綠色熒光，而加入其它物種的溶液中幾乎觀察不到藍綠色熒光。上述結果表明，該熒光有機納米粒檢測白蛋白具有良好的選擇性和實際應用性。

最后，特別需要說明的是，以上舉例僅是本發明的若干具體實施例。本發明顯然不限于以上實例，本領域的相關技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。