本發(fā)明屬于病毒檢測領(lǐng)域，具體涉及一種鑒別犬細小病毒、犬瘟熱病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PCR檢測方法。

背景技術(shù)：

犬瘟熱、犬細小病毒病、犬副流感、犬腺病毒2型是犬常見傳染病，發(fā)病率高、死亡率高，對養(yǎng)犬業(yè)造成嚴重損失。犬細小病毒病由犬細小病毒（Canine Parvovirus ,CPV）引起的犬的一種急性傳染病，以急性出血性胃腸炎或非化膿性心肌炎為特征，各種年齡和不同性別的犬都有易感性，但幼犬的易感性更高，病死率達50%。犬瘟熱由犬瘟熱病毒（Canine Distempter Virus,CDV）引起，犬和肉食目中許多動物的一種高度接觸性傳染病，以早期雙相熱、急性鼻卡他和隨后的支氣管炎、卡他性肺炎、嚴重的胃腸炎和神經(jīng)癥狀為特征，可引起犬全身性的免疫抑制，病死率極高。犬副流感是由副流感病毒5型（Canine Parainfluenza Virus,CPIV）引起犬的一種傳染病，以突然發(fā)熱、卡他性鼻炎和支氣管炎為特征，是犬呼吸系統(tǒng)重要疾病之一，可感染各種年齡犬，幼齡犬病情較重，潛伏期較短，突然發(fā)熱，咳嗽和呼吸困難，有些犬還表現(xiàn)后軀麻痹和運動失調(diào)等神經(jīng)癥狀。犬腺病毒2型為犬傳染性喉氣管炎病毒（Canine adenovirus，CAV），主要引起幼犬的傳染性喉氣管炎和腸炎。多可見于4月齡以下的幼犬，潛伏期為 5~6 天，以持續(xù)性高熱（體溫在39.5℃左右）、咳嗽、漿液性或黏液性鼻涕、扁桃體炎、喉氣管炎和肺炎為特征。

上述四種犬疾病臨床癥狀相似，又易于混合感染，臨床鑒別診斷非常困難，常用的單一PCR方法耗時又長，因此，建立一種可以同時檢測這四種疾病的鑒別診斷方法具有很高的實用性和現(xiàn)實意義，以便盡快采取有效的治療和防控措施，減少這些疾病對養(yǎng)犬業(yè)造成的危害。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種用于鑒別犬細小病毒、犬瘟熱病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PCR檢測引物，試劑盒和檢測方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種用于鑒別犬細小病毒、犬瘟熱病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PCR檢測引物，其核苷酸序列如下所示：

CPVP1：5' ACGGTGGTCAACCTGCTGTC3'（SEQ ID NO：1）；

CPVP2：5' AATGGCCCTTGTGTAGACGC3'（SEQ ID NO：2）；

CDVP1：5' GGGTCAGGTAGGAGACAAAGGC3'（SEQ ID NO：3）；

CDVP2：5' AGACACCAAGGTCCGAGCACAG3'（SEQ ID NO：4）；

CPIVP1：5' TCCCATCATTCTCGCTCACC3'（SEQ ID NO：5）；

CPIVP2：5' ATACCCCGCTTCCTGTTCCT3'（SEQ ID NO：6）；

CAVP1：5' TGCCTCTTCCCAGCGTAA3'（SEQ ID NO：7）；

CAVP2：5' CTGCCAGCCACAGTCCAA3'（SEQ ID NO：8）。

一種用于鑒別犬細小病毒、犬瘟熱病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PCR檢測試劑盒，該試劑盒包含上述檢測引物。

一種用于鑒別犬細小病毒、犬瘟熱病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PCR檢測方法，包括下列步驟：

1)從樣品中提取病毒核酸；

2)以核酸為模板，用上述所述的引物對進行PCR擴增反應(yīng)獲得擴增產(chǎn)物；

3)將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，確定病毒類型。

優(yōu)選的，步驟2）中PCR擴增反應(yīng)體系為：2×1 step buffer 12.5μL， 引物CPVP1、CPVP2、CDVP1、CDVP2、CPIVP1、CPIVP2、CAVP1、CAVP2各0.25μL，病毒核酸模板 2 μL，余量水，總體積為25μl。

優(yōu)選的，步驟2）中PCR反應(yīng)程序：50℃，30min；95 ℃預(yù)變性 2 min；然后95 ℃，30s，53 ℃，30s，72 ℃，30 s，共進行30個循環(huán)；最后 72 ℃延伸7min。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明方法可以同時檢測犬細小病毒、犬瘟熱病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四種病毒；操作簡單，檢測速度快且高通量；準確性高、特異性好，重復(fù)性好，可以準確、快速、高通量地進行分析，有利于在臨床實踐中推廣應(yīng)用。

本發(fā)明的引物特異性好，除可以與所要檢測的四種目標病毒核酸結(jié)合外，不與其他常見病毒，如貓瘟熱、犬腺病毒1型、犬鉤端螺旋體等核酸結(jié)合。

附圖說明

圖1為特異性試驗電泳結(jié)果圖；

圖2為敏感性試驗電泳結(jié)果圖；

圖3為重復(fù)性試驗電泳結(jié)果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的說明。

實施例1 引物設(shè)計

根據(jù)犬細小病毒基因、犬瘟熱病毒基因、犬副流感病毒基因和犬腺病毒2型基因的保守序列，經(jīng)過篩選各設(shè)計了一對特異性引物，用于犬細小病毒基因、犬瘟熱病毒基因、犬副流感病毒基因和犬腺病毒2型基因的部分基因片段。預(yù)期擴增產(chǎn)物片段長度分別為1033bp、804bp、396bp和258bp。引物的序列如下：

犬細小病毒基因擴增引物：

CPVP1： 5' ACGGTGGTCAACCTGCTGTC 3'（SEQ ID NO：1）；

CPVP2：5' AATGGCCCTTGTGTAGACGC 3'（SEQ ID NO：2）；

犬瘟熱病毒基因擴增引物：

CDVP1：5' GGGTCAGGTAGGAGACAAAGGC 3'（SEQ ID NO：3）；

CDVP2：5' AGACACCAAGGTCCGAGCACAG 3'（SEQ ID NO：4）；

犬副流感病毒基因擴增引物：

CPIVP1：5' TCCCATCATTCTCGCTCACC 3'（SEQ ID NO：5）；

CPIVP2：5' ATACCCCGCTTCCTGTTCCT 3'（SEQ ID NO：6）；

犬腺病毒2型基因擴增引物：

CAVP1：5' TGCCTCTTCCCAGCGTAA 3'（SEQ ID NO：7）；

CAVP2：5' CTGCCAGCCACAGTCCAA 3'（SEQ ID NO：8）。

以上引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

實施例2 四重PCR檢測方法

1）DNA 的提取：按照Axygen公司病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒操作說明書，提取病毒基因組，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2）四重PCR擴增反應(yīng)

在PCR反應(yīng)管中分別加入滅菌水7.5μL，2×1 step buffer 12.5μL， CPV 上、下游引物(20pmol/μL)各0.25μL，CDV上、下游引物(20pmol/μL)各0.25μL，CPIV上、下游引物(20pmol/μL)各0.25μL，CAV-2上、下游引物(20pmol/μL)各0.25μL，primescript 1 step enzyme mix 1 μL，模板 2 μL，共25μl RT-PCR擴增體系。

PCR反應(yīng)程序：50℃，30min；95 ℃預(yù)變性 2 min；然后95 ℃，30s，53 ℃，30s，72 ℃，30 s，共進行30個循環(huán)；最后 72 ℃延伸7min；4 ℃保存。

結(jié)果觀察：PCR產(chǎn)物經(jīng) 1.2% 瓊脂糖凝膠電泳顯示，犬細小病毒、犬瘟熱病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型引物擴增的PCR產(chǎn)物分別在1033bp、804bp、396bp和258bp左右各出現(xiàn)了一條片段，四重引物擴增的PCR產(chǎn)物出現(xiàn)了4條帶，與預(yù)期大小相符。

實施例3 特異性試驗

按照實施例2的方法，利用四重PCR檢測方法，以犬四聯(lián)活疫苗（犬細小病毒病、犬瘟熱、犬副流感和犬腺病毒2型）提取的基因組為模板，并以滅菌水為陰性對照，驗證該RT-PCR方法的特異性。

PCR產(chǎn)物經(jīng) 1.2% 瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1。

圖1結(jié)果顯示，犬細小病毒、犬瘟熱病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型引物擴增的PCR產(chǎn)物分別在1033bp、804bp、396bp和258bp左右各出現(xiàn)了一條片段，四重引物擴增的PCR產(chǎn)物出現(xiàn)了4條帶，與預(yù)期大小相符，而滅菌水對照、貓瘟熱、犬腺病毒1型、犬鉤端螺旋體均沒有出現(xiàn)條帶(圖1)。

實施例4 敏感性試驗

將200μL犬四聯(lián)活疫苗提取基因組，用核酸分析儀確定其濃度，然后將其按 10倍遞減稀釋至 10^-8，用引物對其進行 PCR擴增，驗證該RT-PCR方法的敏感性。

用核酸分析儀測定犬四聯(lián)活疫苗基因組的濃度為7.06ng/μL，按 10倍遞減稀釋至 10^-8，RT-PCR擴增體系為 25 μL，模板為2μL。能檢出的最小基因組濃度為7.06×10^-4ng/μL（圖2）。

實施例5 擴增重復(fù)性試驗

將犬四聯(lián)活疫苗在相同條件下，重復(fù)進行 8次基因組提取和RT-PCR擴增檢測，以驗證該RT-PCR方法的重復(fù)性。

PCR產(chǎn)物經(jīng) 1.2% 瓊脂糖凝膠電泳顯示，8次提取的犬四聯(lián)活疫苗基因組的PCR擴增結(jié)果均出現(xiàn)了四條清晰明亮的目的條帶（圖3）。結(jié)果表明，建立的犬細小病毒、犬瘟熱病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型四重RT-PCR檢測方法具有良好的重復(fù)性。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所

<120> 一種鑒別犬細小病毒、犬瘟熱病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PC

R檢測方法

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acggtggtca acctgctgtc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agacaccaag gtccgagcac ag 22

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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