本發(fā)明涉及生物技術(shù)和作物育種領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種野生稻(進(jìn)化)關(guān)鍵基因的改良和利用方法，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)野生稻的人工加速進(jìn)化，以便大規(guī)模開發(fā)利用野生稻和其優(yōu)異基因。
背景技術(shù)：
在我國(guó)，水稻一般指亞洲栽培稻(Oryza sativa L.)。栽培稻培育過(guò)程中由于不斷自交，純合度提高，造成遺傳多樣性的降低；同時(shí)水稻品種選育過(guò)分依賴少數(shù)骨干親本，導(dǎo)致遺傳基礎(chǔ)日益狹窄；此外極端氣候頻發(fā)，各種病蟲害爆發(fā)流行，都嚴(yán)重威脅水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)。而水稻馴化過(guò)程中丟失大量的優(yōu)異基因，特別是喪失抵抗生物和非生物逆境的優(yōu)異基因資源，因此，科學(xué)有效地利用遺傳基礎(chǔ)豐富的野生稻資源是水稻遺傳育種的重要方向。
作物野生近緣種在長(zhǎng)期的自然選擇中,產(chǎn)生許多栽培種沒(méi)有的抗逆、抗病等優(yōu)異基因。這些優(yōu)異基因可以通過(guò)遠(yuǎn)緣雜交或生物技術(shù)等方法轉(zhuǎn)育到栽培種中,從而增強(qiáng)抗性，培育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的優(yōu)良品種。野生稻是栽培稻的祖先，蘊(yùn)含大量栽培稻喪失的獨(dú)特優(yōu)異基因。在我國(guó)水稻育種中利用的野生稻主要是普通野生稻(Oryza.rufipogon Griff.)、疣粒野生稻(Oryza.meyeriana Baill.)和藥用野生稻(Oryza.officinalis Wall.),其中以普通野生稻研究利用的較多。
很多研究表明，普通野生稻馴化為亞洲栽培稻的過(guò)程中，很多農(nóng)藝性狀發(fā)生了改變，特別在植株和籽粒形態(tài)上改變很大，如普通野生稻一般表現(xiàn)為匍匍生長(zhǎng)、穗散生，籽粒細(xì)長(zhǎng)、有芒、落粒性強(qiáng)，種皮多為紅色；而栽培稻一般表現(xiàn)為直立生長(zhǎng)、穗下垂、密集，籽粒較寬、無(wú)芒或短芒、落粒性較弱，種皮多為白色。在比較分析其基因組序列差異的基礎(chǔ)上，研究這些性狀的改變背后的分子基序，有助于揭示或重建水稻的進(jìn)化過(guò)程，加深對(duì)水稻野生近緣種進(jìn)化關(guān)鍵基因的了解，拓寬水稻育種途徑，豐富育種材料，提高水稻產(chǎn)量和品質(zhì)。
隨著基因測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，大規(guī)模、高通量的基因測(cè)序廣泛用于亞洲栽培稻的起源進(jìn)化研究。Huang等(2012年)對(duì)大量亞洲栽培稻和普通野生稻進(jìn)行了全基因組重測(cè)序，初步發(fā)現(xiàn)了一些野生稻馴化為栽培稻的選擇性清除區(qū)域，認(rèn)為這些區(qū)域是馴化目標(biāo)區(qū)域。其中包括PROG1(PROSTRATE GROWTH 1，匍匐生長(zhǎng)基因)、Bh4(Black hull4，穎殼顏色控制基因)、sh4(seed shattering 4，種子落粒性控制基因)、qSW5(grain width 5，粒寬控制基因)、OsC1(葉鞘和稃尖顏色控制基因)等基因。這些基因控制的亞洲栽培稻性狀包括直立生長(zhǎng)、分蘗、矮稈、籽粒長(zhǎng)、籽粒寬、落粒性、種皮顏色、穎殼顏色、葉鞘和芒的顏色、直鏈淀粉含量和稻米香味等，包含了大部分普通野生稻與亞洲栽培稻顯著差異的性狀。
目前，對(duì)野生稻資源的利用手段主要還停留在傳統(tǒng)育種技術(shù)上，主要通過(guò)雜交等傳統(tǒng)技術(shù)轉(zhuǎn)育野生稻優(yōu)異基因，主要困難表現(xiàn)在：(1)由于種間雜交存在著生殖障礙，容易造成雜交不結(jié)實(shí)、雜種不育；(2)有利基因與不利基因之間有很強(qiáng)的連鎖障礙，影響有利基因的利用；(3)雜交后代性狀瘋狂分離、難以穩(wěn)定。因此，野生稻資源利用迫切需要引入新的方法和技術(shù)。
以基因工程技術(shù)為代表的現(xiàn)代生物技術(shù)手段，大大加快了育種進(jìn)程。特別是2009年以來(lái)，新型基因組編輯技術(shù)飛速發(fā)展，使在基因組精確操縱真正應(yīng)用到作物定向遺傳改良中。這些技術(shù)包括ZFN(Zinc finger nuclease，鋅指核酸酶)、TALEN(Transcription activator-like effector nuclease，類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶)、CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced palindromic repeats/CRISPR-associated proteins 9)等技術(shù)。利用基因組技術(shù)進(jìn)行基因靶向操作，實(shí)現(xiàn)了基因組水平上的定向修飾，實(shí)現(xiàn)特定堿基的替換、定向的基因敲除或植入，顯著加快作物遺傳改良的進(jìn)程。
但是，如何利用這些基因組編輯技術(shù)來(lái)進(jìn)行野生稻基因的改良和利用，尚沒(méi)有人提出明確的理論方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種野生稻(進(jìn)化)關(guān)鍵基因的改良和利用方法。該方法通過(guò)分析野生稻材料的基因組序列，并與栽培稻基因組進(jìn)行對(duì)比分析，獲取野生稻(進(jìn)化)關(guān)鍵基因改良的潛在靶位點(diǎn)，通過(guò)CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)或其他基因工程技術(shù)，對(duì)潛在靶位點(diǎn)進(jìn)行定向編輯或改良。
具體而言，本發(fā)明提供一種野生稻關(guān)鍵基因的改良和利用方法，其特征在于，所述方法包括：
步驟(1)對(duì)目標(biāo)野生稻材料進(jìn)行全基因組測(cè)序，獲得相應(yīng)的基因組序列；
步驟(2)分析所述野生稻材料的基因組序列并將野生稻材料的基因組序列與普通栽培稻基因組進(jìn)行對(duì)照比較分析；
步驟(3)獲取野生稻關(guān)鍵基因改良的潛在靶位點(diǎn)；
步驟(4)通過(guò)基因編輯技術(shù)，對(duì)潛在靶位點(diǎn)進(jìn)行定向編輯或改良。
進(jìn)一步地，所述基因編輯技術(shù)為ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技術(shù)中的一種。
進(jìn)一步地，所述野生稻包括一般野生稻和所有水稻的近緣野生種。
進(jìn)一步地，所述一般野生稻包括：普通野生稻、藥用野生稻和疣粒野生稻，所述方法優(yōu)選采用普通野生稻。
進(jìn)一步地，所述的關(guān)鍵基因包括野生稻在進(jìn)化成栽培稻過(guò)程中起重要作用的生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)、抗病蟲害、抗非生物逆境的基因，優(yōu)選為水稻進(jìn)化關(guān)鍵基因。
進(jìn)一步地，所述基因編輯技術(shù)包括基因編輯、轉(zhuǎn)基因、基因沉默技術(shù)。
進(jìn)一步地，所述步驟(4)包括：(4-1)通過(guò)基因克隆的方法，進(jìn)行序列驗(yàn)證后，構(gòu)建基因編輯或轉(zhuǎn)基因或基因沉默載體；(4-2)利用構(gòu)建產(chǎn)物轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105，(4-3)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法通過(guò)轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌菌株對(duì)目標(biāo)野生水稻種子進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)基因野生稻植株；(4-4)對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因野生稻植株在靶位點(diǎn)測(cè)序分析或表達(dá)量分析，并對(duì)靶基因出現(xiàn)突變或所需表達(dá)量變化的植株，進(jìn)行目標(biāo)性狀持續(xù)的性狀觀察和跟蹤，(4-5)通過(guò)遺傳分離，獲得非轉(zhuǎn)基因的，在目標(biāo)關(guān)鍵基因序列正確，外觀、農(nóng)藝性狀更接近栽培稻的野生稻材料。
進(jìn)一步地，野生稻關(guān)鍵基因是野生稻進(jìn)化關(guān)鍵基因。
另一方面，本發(fā)明提供所述野生稻關(guān)鍵基因的改良和利用方法在培育水稻品種中的應(yīng)用，其特征在于，培育水稻品種過(guò)程中使用的材料通過(guò)權(quán)利要求1所述方法培育而來(lái)。
另一方面，本發(fā)明提供一種野生水稻直立化生長(zhǎng)改良方法，所述方法包括：步驟(1)對(duì)目標(biāo)野生稻材料進(jìn)行全基因組測(cè)序，獲得相應(yīng)的基因組序列；
步驟(2)分析所述野生稻材料的基因組序列并將野生稻材料的基因組序列與普通栽培稻基因組進(jìn)行對(duì)照比較分析，找到目標(biāo)野生稻的PROG1基因；
步驟(3)獲取野生稻PROG1基因的潛在靶位點(diǎn)；
步驟(4)通過(guò)基因編輯技術(shù)，對(duì)PROG1基因進(jìn)行定向編輯，
所述步驟(4)包括：(4-1)通過(guò)基因克隆的方法，進(jìn)行序列驗(yàn)證后，構(gòu)建基因編輯或轉(zhuǎn)基因或基因沉默載體；(4-2)利用構(gòu)建產(chǎn)物轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105，(4-3)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法通過(guò)轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌菌株對(duì)目標(biāo)野生水稻種子進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)基因野生稻植株；(4-4)對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因野生稻植株在靶位點(diǎn)測(cè)序分析或表達(dá)量分析，并對(duì)靶基因出現(xiàn)突變或所需表達(dá)量變化的植株，進(jìn)行目標(biāo)性狀持續(xù)的性狀觀察和跟蹤，(4-5)通過(guò)遺傳分離，獲得非轉(zhuǎn)基因的，在目標(biāo)關(guān)鍵基因序列正確，外觀、農(nóng)藝性狀更接近栽培稻的野生稻材料。
本文中所涉及的“野生稻”包括一般意義的野生稻(普通野生稻、藥用野生稻和疣粒野生稻等)和其他所有水稻的近緣野生種，優(yōu)選為普通野生稻。
本文中所涉及的“關(guān)鍵基因”包括野生稻進(jìn)化過(guò)程中起重要作用的生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)、抗病蟲害、抗非生物逆境等主效基因，優(yōu)選為水稻進(jìn)化關(guān)鍵基因。
本文中所涉及的“基因改良”方法包括基因編輯、轉(zhuǎn)基因、基因沉默等基因工程技術(shù)，優(yōu)選為基因編輯技術(shù)。
本文中所涉及的“基因編輯”方法，包括ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等可對(duì)基因進(jìn)行定向編輯的技術(shù)，優(yōu)選為CRISPR/Cas9技術(shù)。
相對(duì)于傳統(tǒng)育種方法，本方法有以下優(yōu)點(diǎn)：
本發(fā)明的野生稻(進(jìn)化)關(guān)鍵基因的改良和利用方法，從基因組分析入手，利用基因編輯技術(shù)手段，從而實(shí)現(xiàn)野生稻的人工加速進(jìn)化，快速獲得外觀、農(nóng)藝等性狀更接近栽培稻的水稻材料。實(shí)現(xiàn)大規(guī)模開發(fā)利用各類野生稻資源和基因組中的豐富優(yōu)異基因，批量獲得具有各種優(yōu)良性狀的水稻材料。
本發(fā)明的方法目的性強(qiáng)、周期短、成本低，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模開發(fā)利用野生稻基因組中的各種優(yōu)異基因，可快速、批量獲得具有各種優(yōu)良性狀的水稻材料，顯著提高野生稻資源利用效率，并重建野生稻進(jìn)化的人工路徑。
附圖說(shuō)明
圖1為本發(fā)明提供的野生稻(進(jìn)化)關(guān)鍵基因的改良和利用方法的流程圖。
具體實(shí)施方式
以下參照具體的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的藥材原料、試劑材料等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為市售購(gòu)買產(chǎn)品。
實(shí)施例1 關(guān)鍵基因的確定及相應(yīng)載體的制備
在進(jìn)行野生稻進(jìn)化關(guān)鍵基因進(jìn)行改良之前，首先需要對(duì)目標(biāo)野生稻材料進(jìn)行全基因組測(cè)序，獲得相應(yīng)的基因組序列。本實(shí)施例中，以東鄉(xiāng)野生稻為待改良的目標(biāo)野生水稻，對(duì)該水稻進(jìn)行測(cè)序及改造。本發(fā)明中所采用的東鄉(xiāng)野生稻為常規(guī)可獲得的野生稻。
在獲取了東鄉(xiāng)野生稻的全基因組序列之后，分析該野生稻材料的基因組序列并將野生稻材料的基因組序列與普通栽培稻基因組進(jìn)行對(duì)照比較分析，獲取野生稻關(guān)鍵基因改良的潛在靶位點(diǎn)。
在本實(shí)施例中，通過(guò)對(duì)比找到了若干關(guān)鍵基因，其中包括PROG1基因該基因?yàn)橘橘肷L(zhǎng)基因。
下面以PROG1基因?yàn)槔M(jìn)行改良過(guò)程的描述，不過(guò)首先介紹用于水稻PROG1基因打靶的重組載體的制備過(guò)程。
1.1，選擇水稻PROG1基因(LOC_Os07g0153600)中第一外顯子中自翻譯起始密碼子ATG后第101-位的核苷酸序列TGGATCCCTCATCGGCTTCTTGG，(下劃線部分為5’-(N)X-NGG-3’結(jié)構(gòu)中NGG部分)，作為打靶位點(diǎn)。
1.2，按所選擇靶位點(diǎn)合成(華大基因公司)正向寡核苷酸鏈(OsPROG1KO1P1)和可與之互補(bǔ)的反向寡核苷酸鏈(OsPROG1KO1P2)，
具體序列為：
OsPROG1 KO1 P1:GGCATGGATCCCTCATCGGCTTCT
OsPROG1 KO1 P2:AAACAGAAGCCGATGAGGGATCCA
其中未被下劃線標(biāo)注的部分為上述靶位點(diǎn)中去除NGG的序列或互補(bǔ)序列，下劃線部分為用于連接載體的粘性末端。
1.3,經(jīng)過(guò)退火程序，將OsPROG1 KO1 P1和OsPROG1 KO1 P2兩鏈退火形成具有粘性末端的雙鏈DNA，作為構(gòu)建重組載體的插入片段。
1.4，用Bsa I內(nèi)切酶(NEB公司)在37℃酶切包含能夠在水稻細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的向?qū)NA表達(dá)框(核苷酸序列如Seq ID No.1所示)和能夠在水稻細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的Cas9核酸酶表達(dá)框的水稻CRISPR/Cas9基因工程載體(核苷酸序列如Seq ID No.2所示)，載體結(jié)構(gòu)和構(gòu)建方法按現(xiàn)有文獻(xiàn)(Xu et al,Gene targeting using the Agrobacterium tumefaciens-mediated CRISPR-Cas system in rice,RICE,2014)所示，使用Bsa I內(nèi)切酶酶切水稻CRISPR/Cas9基因工程載體2小時(shí)，65℃失活酶切體系10分鐘，作為構(gòu)建重組載體的骨架片段。
1.5，用T4連接酶(NEB公司)將重組載體骨架片段和插入片段相連，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，構(gòu)成用于水稻OsPROG1基因CRISPR/Cas9打靶的重組載體質(zhì)粒。
實(shí)施例2 農(nóng)桿菌穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因介導(dǎo)的野生稻OsPROG1基因打靶和T0代轉(zhuǎn)基因材料的獲得
2.1，從實(shí)施例1獲得的重組載體，利用凍融法將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105。
2.2，成熟野生稻種子去掉穎殼后，用70％酒精浸泡種子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween 20的50％次氯酸鈉(原液有效氯濃度大于4％)溶液浸泡種子40min(150r/min)。倒掉次氯酸鈉，無(wú)菌水洗5遍至溶液澄清，無(wú)次氯酸鈉味道。無(wú)菌水浸泡種子過(guò)夜。用解剖刀沿種子的糊粉層將胚剝下，將胚接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。30℃下暗培養(yǎng)11天后將愈傷組織與胚乳及胚芽分離，將去芽的狀態(tài)良好、分裂旺盛的初級(jí)愈傷組織進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)3～5天后用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。
采用轉(zhuǎn)入了OsPROG1基因CRISPR/Cas9打靶的重組載體的根癌農(nóng)桿菌，進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，該遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化子篩選及轉(zhuǎn)基因植株再生等參照Yongbo Duan(Yongbo Duan,et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based on phosphomannose isomerase positive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant Cell Report，2012.DOI 10.1007/s00299-012-1275-3.)等的方法。
共獲得47株T0代轉(zhuǎn)基因水稻植株。
2.3，利用植物基因組小量提取試劑盒(天根生化公司)，提取所獲47株含有所述野生稻OsPROG1基因CRISPR/Cas9打靶的重組載體的轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA。以該DNA為模板，用Phusion高保真DNA聚合酶(NEB公司)PCR擴(kuò)增包含靶標(biāo)區(qū)域的序列，其中PCR擴(kuò)增所用的引物為：
OsPROG1 KO1 genome check FP:AAAAGTCTATATGAGGAATAAC
OsPROG1 KO1 genome check RP:CCGCCGCCGTGACGCCATGGGA
2.4，以O(shè)sPROG1KO1 genome check FP為引物對(duì)所獲PCR擴(kuò)增片段直接測(cè)序，分析靶標(biāo)位點(diǎn)的突變。測(cè)序結(jié)果表明，30株植株中，帶有OsPROG1基因靶標(biāo)序列上的突變，突變效率為63.8％；突變的形式包括堿基的插入和/或缺失，產(chǎn)生無(wú)義突變，引起OsPROG1基因翻譯終止；其中，10株轉(zhuǎn)基因植物在兩條染色體同一等位位點(diǎn)上同時(shí)出現(xiàn)了無(wú)義突變，被選為進(jìn)一步篩選的材料。
實(shí)施例3 T0代轉(zhuǎn)基因水稻插入T-DNA拷貝數(shù)的檢測(cè)
使用上述47株轉(zhuǎn)基因株系基因組DNA，參照Litao Yang(Litao Yang,Jiayu Ding,et al.Estimating the copy number of transgenes in transformed rice by real-time quantitative PCR.Plant Cell Rep.,2005,23:759-763)等的方法利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法鑒定所插入的T-DNA拷貝數(shù)。結(jié)果表明，47株中有3株(編號(hào)為：T-33、T-37、T-44)僅攜帶單個(gè)拷貝的T-DNA插入片段。該步驟的目的是為了后面選擇非轉(zhuǎn)基因植株提供參考。因?yàn)榭截悢?shù)越少的T0植株，后代越容易得到非轉(zhuǎn)因植株。
實(shí)施例4 子代中非轉(zhuǎn)基因株系的分離
取100粒T-33種子萌發(fā)成苗后，使用100mg/L潮霉素溶液涂抹子代葉片，28棵T1代植株表現(xiàn)為潮霉素敏感。隨機(jī)抽提10株潮霉素敏感T1代及1株潮霉素抗性植物的葉片DNA，用ACTIN基因特異引物擴(kuò)增作為陽(yáng)性對(duì)照，所有植株均獲得ACTIN基因特異條帶，表明所提取DNA質(zhì)量可以用于檢測(cè)目標(biāo)基因；使用35S啟動(dòng)子、T-Nos和HPT三種特異引物對(duì)上述10株潮霉素敏感T1代及1株潮霉素抗性植物的葉片DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均沒(méi)有獲得目的條帶，這說(shuō)明在遺傳過(guò)程中，這些敏感植株中的外源DNA片段基因分離，這些子代已無(wú)外源DNA插入。隨機(jī)挑選兩株(T-33-73和T-33-84)通過(guò)實(shí)施例2中的方式對(duì)打靶位點(diǎn)測(cè)序表明，染色體對(duì)的兩個(gè)等位位點(diǎn)中OsPROG1基因靶位點(diǎn)出仍然存在無(wú)義突變。說(shuō)明基因編輯造成的突變穩(wěn)定的遺傳給下一代了，即獲得了具有突變的非轉(zhuǎn)基因的后代植株。
通過(guò)上面對(duì)野生稻的改良，將東鄉(xiāng)野生稻由匍匐生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變?yōu)橹绷⑸L(zhǎng)。
以上對(duì)本發(fā)明具體實(shí)施方式的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。