一種利用GnRHR基因檢測綿羊繁殖力的方法
【專利摘要】本發明提供的一種利用GnRHR基因檢測綿羊繁殖力的方法，即找出顯著影響綿羊繁殖力的分子標記。選取GnRHR基因作為綿羊繁殖力的候選基因，利用PCR-SSCP技術，檢測策勒黑羊、吐魯番黑羊品種中GnRHR基因外顯子2的遺傳多態性，并分析研究其堿基突變對于綿羊繁殖性狀的影響，最終發現GnRHR基因外顯子2區的堿基突變G230C，可降低綿羊繁殖力，同時通過選擇基因型為GG的綿羊個體，淘汰基因型為GC、CC的綿羊個體，可選育提高綿羊的繁殖力。
【專利說明】—種利用GnRHR基因檢測綿羊繁殖力的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子標記技術，利用GnRHR基因檢測綿羊繁殖力的方法以及在選育提高綿羊繁殖力中的應用，具有重要的生產價值。
【背景技術】
[0002]新疆作為我國的五大牧區，2013年的綿山羊存欄量達4161.52萬只，具有豐富的綿羊品種資源，尤其是策勒黑羊、吐魯番黑羊的優良地方綿羊品種，得到有效利用，因此結合新疆現有種質資源，提高綿羊的良種化程度，加大新疆的羊肉產量，是滿足人民群眾日益增長的需求的一個有效手段和根本方法。
[0003]促性腺激素釋放激素受體(GonadotropinReleasing Hormone Receptor, GnRHR)是位于垂體促性腺細胞表面的一種高親和性G蛋白耦聯受體，可轉導來自細胞外配位體、下丘腦因子下丘腦促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone, GnRH)的信號，調節垂體前葉合成與釋放促黃體素和促卵泡素，從而促進性腺的生長、成熟和調控生物的繁殖力。因此，GnRHR基因在調節哺乳動物生殖發育和機能中起著關鍵作用，是繁殖性狀的一個重要生理候選基因。國外研究證實，綿羊的GnRHR基因位于6號染色體上，由3個外顯子和2個內含子組成。研究表明，GnRHR基因的多態性引起的氨基酸序列的改變會影響配體GnRH和受體GnRHR的結合力，進而影響動物的發育和生殖能力。
[0004]目前，國內外對于綿羊GnRHR基因外顯子2的多態性研究較少。劉忠慧等對小尾寒羊和多塞特羊2 個綿羊品種中GnRHR基因的外顯子1和2進行了多態性檢測，結果發現，GnRHR基因外顯子2區域發生了突變G230C，該突變導致了甘氨酸改變為半胱氨酸。但該研究未對多態基因型和產羔數進行關聯分析，無法判斷GnRHR基因是否是影響小尾寒羊和多塞特羊繁殖力的主效基因。孫潔等對小尾寒羊和湖羊、南非肉用美利奴、考力代和中國美利奴綿羊中GnRHR基因的外顯子1-3進行了多態性檢測，結果表明，在小尾寒羊和湖羊中GnRHR基因外顯子2存在2個突變(A50G和A101 )，均引起氨基酸改變，突變純合型(DD)小尾寒羊平均產羔數比野生型(CC)多0.81只(P〈0.01)。
[0005]PCR-SSCP是以PCR為基礎，基于DNA構象差別而進行快速、靈敏、有效檢測基因點突變，檢測基因多態性的常用方法。其基本原理是經PCR擴增的DNA片段在變性劑或低離子濃度下，經高溫處理使之解鏈并保持在單鏈狀態下，DNA單鏈可折疊成一定空間構象，在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時，相同長度DNA單鏈因其堿基序列不同，甚至單個堿基不同，導致形成的構象不同，而且單鏈DNA構象的變化很可能引起了遷移率的改變，每條單鏈處于一定的位置，靶DNA中若發生堿基缺失、插入或單個堿基置換時，就會出現泳動變位，通過顯色或顯影后在凝膠上就會顯示出帶型的差別，即多態性。
[0006]本發明選取GnRHR基因作為綿羊繁殖力的候選基因，利用分子生物學技術PCR-SSCP，檢測策勒黑羊、吐魯番黑羊品種中GnRHR基因外顯子2的遺傳多態性，分析研究其堿基突變對于綿羊繁殖性狀的影響，進而用于綿羊繁殖力的早期選育，這對于提高農牧民經濟收入、加快新疆肉羊業的發展具有重要意義和實踐應用價值。
【發明內容】

[0007]本發明的目的在于:提供利用PCR-SSCP技術檢測，找出可顯著影響綿羊繁殖力的分子標記，同時提供一種高效用于選育提高策勒黑羊和吐魯番黑羊繁殖力的方法。
[0008]本發明的目的是這樣實現的:一種利用GnRHR基因檢測綿羊繁殖力的方法，分步驟實施；
[0009]提取策勒黑羊和吐魯番黑羊基因組DNA，設計合成引物一對:上游引物F為5’ -CCTACAGTTATACATCTTTGGGA-3’，下游引物 R 為 5’ -TGAGAAATACATACTGTGGGGAT-3’，其擴增片段大小為241bp，最適退火溫度為53.8°C ;PCR擴增反應體系:總體積為20 μ 1，其中PCR MixturelO μ 1，ddH208 μ 1，上下游引物各0.5 μ 1，DNA模板I μ I ；PCR擴增反應條件:94°C 5min, 30 個循環的 94°C 30s,53.8°C 30s,72°C lmin,72°C 5min，4。。保存；
[0010]采用PCR-SSCP技術，取3μ I PCR產物與7 μ I變性劑混合，放入PCR儀98°C IOmin進行變性，_20°C冷卻IOmin后點樣，8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳25h，銀染顯色后凝膠成像，分析帶型，用以檢測GnRHR基因外顯子2區的遺傳多態性，發現堿基突變G — C，位于外顯子2區的第230位堿基，導致氨基酸改變的Gly — Ala,并產生的3種基因型:GG、GC和CC0
[0011]所述方法，選擇基因型為GG的綿羊個體，用于選育提高綿羊的繁殖力。
[0012]本發明原理與作用:采集剛宰殺的策勒黑羊和吐魯番黑羊頸靜脈血樣，枸櫞酸鈉抗凝，提取基因組DNA，參照文獻，合成可擴增GnRHR基因外顯子2區的一對引物，進行PCR擴增，利用SSCP技術檢測GnRHR基因外顯子2區的遺傳多態性，判斷基因型，對發現的不同基因型進行DNA測序，確定突變的堿基及位置，并與繁殖性狀(產羔數)進行關聯分析，最終確定、找出影響策勒黑羊和吐魯番黑羊繁殖力的DNA分子標記，此外，通過檢測出的基因型，留用攜帶具有高繁殖力潛能的基因型綿羊個體，以此選育提高綿羊的繁殖力；該方法快捷精準，應用性極強，彰顯技術進步。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]本發明結合實施例作進一步說明。
[0014]附圖1為PCR擴增產物電泳圖；
[0015]如圖所示:M為DL2000DNA Marker,泳道1-10為PCR擴增產物。
[0016]附圖2為8%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；
[0017]如圖所示:泳道8、9判定為GG基因型，泳道5、6判定為GC基因型，泳道1_4、7、10判定為CC基因型。
[0018]附圖3為DNA測序結果對比圖；
[0019]如圖所示:在GnRHR基因外顯子2區，發現了堿基突變G — C，致使野生純合型GG變為突變純合型Ce。
【具體實施方式】
[0020]本發明結合附圖作進一步說明。
[0021]實施例[0022]1、基因組DNA提取:
[0023]采集剛宰殺的策勒黑羊和吐魯番黑羊頸靜脈血樣5mL，枸櫞酸鈉抗凝，參照《分子克隆實驗指南》，合成可擴增GnRHR基因外顯子2;用酚氯仿抽提法提取血樣基因組DNA，-20°C保存。
[0024](I)解凍血樣，轉移1000L至2.0ml離心管，加入等體積PBS緩沖液，溫和搖動混勻；12000r/min離心IOmin,棄去上清液,重復上述步驟至上清液透明、沉淀呈淡黃色。
[0025](2)在離心管中加入DNA抽提液5001，搖動，使血細胞沉淀脫離離心管管壁，37°C水浴Ih。
[0026](3)加蛋白酶K至101 (20mg/mL)并混勻，55°C過夜至澄清，尚未澄清者，可補加101蛋白酶K混勻繼續消化直至澄清。
[0027](4)將反應液冷卻至室溫，加Tris飽和酚5001，溫和搖動混勻；12000r/min離心lOmin，將上清液轉入另一 1.5ml離心管中，重復一次。
[0028](5)加三氯甲烷5001，充分混勻；12000r/mim離心lOmin，將上清液轉入另一 1.5ml
離心管中。
[0029](6)加三氯甲烷、異戊醇混合液(24:1) 5001，充分混勻；12000r/min離心lOmin，將上清液轉入另一 1.5ml離心管中。
[0030](7)加0.1倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無水乙醇(_20°C )，溫和轉動離心管直至白色的絮 狀沉淀析出，_20°C保存30min~60min。
[0031](8) 12000r/min離心lOmin，棄去上清液，用70%冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次。
[0032](9) 12000r/min離心IOmin,棄去上清液,室溫下使乙醇揮發干凈。
[0033](10)干燥后的DNA溶于80~1001的超純水中，4°C保存直至DNA完全溶解，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，-20°C保存。
[0034]2、PCR 擴增:
[0035]I)引物設計及合成:根據綿羊GnRHR基因外顯子2的DNA序列(GenBank登錄號:L43841.1 )，參考文獻《促性腺激素釋放激素受體(GnRHR)基因多態性及其與濟寧青山羊高繁殖力關系》的引物設計，送上海生物工程技術有限責任公司合成，引物序列如下:
[0036]上游引物F:5’-CCTACAGTTATACATCTTTGGGA-3’ ；
[0037]下游引物R: 5’ -TGAGAAATACATACTGTGGGGAT-3’ ；
[0038]2) PCR擴增反應體系:總體積為20 u 1，其中PCR MixturelOu 1，ddH208 U 1，上下游引物各0.5 yl，DNA模板I ill ;
[0039]3) PCR 擴增反應條件-MV 5min, 30 個循環的 94°C 30s,53.8°C 30s,72°C lmin,72 °C 5min，4°C 保存；
[0040]4)PCR擴增產物檢測:用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色15min，凝膠成像儀成像，結果從圖1中得出，條帶清晰，無雜帶，片段大小符合目的片段大小241bp。
[0041]其中主要試劑的配制:
[0042]20mg/ml蛋白酶K:1OOmg蛋白酶K溶于5ml超純水，-20°C保存。
[0043]PBS 緩沖液:NaC18g, KC10.2g，Na2HPO4L 44g，KH2PO40.24g，加超純水定容至1000ml,調pH至7.4,高壓滅菌。
[0044]0.5mol/l EDTA:EDTA186.1g 溶于 800ml 的超純水中，用 NaOH 調 pH 至 8.0，定容至1000ml，高壓滅菌，4 V保存。
[0045]lmol/1 Tris.HCl:Tris 堿 121.14g 溶于 800ml 超純水中，HCl 調節 pH 至 8.0，定容至1000ml，高壓滅菌，4°C保存。
[0046]5mol/l NaCl:NaC1292.2g 溶于 1000ml 超純水中。
[0047]10%SDS:10g SDS溶于90ml的超純水中，68°C水浴溶解，用HCl調pH至?.2，定容至 100ml ο
[0048]DNA 抽提液:取 0.5mol/l EDTA40ml,lmol/1 Tris.HClIOml，5mol/lNaC14ml，10%SDS10ml，定容至100ml，高壓滅菌，4°C保存。
[0049]70%乙醇:無水乙醇70ml,加超純水定容至100ml。
[0050]10XTBE:Trisl08g，硼酸 55g，EDTA.2H207.44g，加超純水定容至 1000ml。
[0051]IXTBE:10 X TBElOml，加超純水定容至 100ml。
[0052]0.8%瓊脂糖凝膠配方:0.4g瓊脂粉溶于50mll XTBE，放于微波爐內加熱1.5min
充分溶解，備用。
[0053]2.5%瓊脂糖凝膠配方:2.5g瓊脂粉溶于100mlI X TBE,放于微波爐內加熱3min充
分溶解，備用。
[0054]其中實驗選用的Taq DNA聚合酶、蛋白酶K、dNTPs、10 X PCR Buffer、溴化乙錠(EB)由新疆寶信提供；6XLoading Buffer,Marker I 由莊盟生物提供；NaC1、KC1、Na2HPO4、KH2PO4, SDS、Tris.HCl、NaCl、Tris飽和酚、EDTA、三氯甲烷、無水乙醇、硼酸、二甲苯氰FF、過硫酸銨、溴酚藍、瓊脂糖、超純水、離心管、槍頭由博邁德生物提供。
[0055]3、SSCP 檢測:
[0056]取3 μ I PCR產物，與7 μ I變性劑混合，放入PCR儀中進行變性(98°C lOmin)，取出后立即置于冰上，放入-20°C冰箱，IOmin后取出點樣，進行8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，電壓180V，電流50mA，根據PCR擴增產物的大小，電泳25h。
[0057]經銀染顯色后，凝膠成像儀成像，結果從圖2中得出，GnRHR基因外顯子2具有多態性，存在三種基因型:GG、GC和CC。
[0058]4、DNA 測序:
[0059]將三種不同基因型的PCR產物送上海生工測序，根據測序結果分析突變堿基及位點，測序結果如圖3。從圖中可以看出，在GnRHR基因外顯子2區(共275bp)發現了堿基突變G — C。進一步分析發現，該突變位點位于外顯子2區的第230位堿基，并導致了氨基酸的改變Gly — Ala。
[0060]5、數據統計分析:
[0061]利用軟件SPSS17.0,分析比較不同基因型間，總體平均產羔數的差異，結果如下表。
[0062]表
[0063]
【權利要求】
1.一種利用GnRHR基因檢測綿羊繁殖力的方法，其特征在于:分步驟實施； 提取策勒黑羊和吐魯番黑羊基因組DNA，設計合成引物一對:上游引物F為5’ -CCTACAGTTATACATCTTTGGGA-3’，下游引物 R 為 5’ -TGAGAAATACATACTGTGGGGAT-3’ ;擴增片段大小為241 bp，最適退火溫度為53.80C ； PCR擴增反應體系:總體積為20u I, PCR Mixture IOu I, ddH20 8 yl，上下游引物各0.5 u I, DNA 模板 I u I ; PCR 擴增反應條件:94°C 5 min, 30 個循環的 94°C 30 s、53.8°C 30 s、72°C I min,72°C 5 min, 4°C 保存； 采用PCR-SSCP技術，取3 u I PCR產物與7 U I變性劑混合，放入PCR儀98°C 10 min進行變性，_20°C冷卻10 min后點樣，8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳25 h，銀染顯色后凝膠成像，分析帶型，用以檢測GnRHR基因外顯子2區的遺傳多態性，發現堿基突變G — C，位于外顯子2區的第230位堿基，導致氨基酸改變的Gly — Ala,并產生的3種基因型為:GG、GC和CC。
2.依據權利I所述方法，其特征在于:選擇基因型為GG的綿羊個體，用于選育提高綿羊的繁殖力。`
【文檔編號】C12Q1/68GK103740804SQ201310514882
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年10月25日 優先權日:2013年10月25日
【發明者】劉武軍, 邵勇鋼, 王瓊, 田佳, 努孜古麗·圖爾蓀 申請人:劉武軍, 新疆農業大學