本發(fā)明涉及單克隆抗體制備，尤其是涉及一種利用小鼠模型處理污染雜交瘤細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

1975年Kohler和Milstein建立了雜交瘤技術(shù)，將小鼠骨髓瘤細(xì)胞與產(chǎn)生綿羊紅細(xì)胞的小鼠脾細(xì)胞融合，形成的雜交瘤細(xì)胞既能產(chǎn)生抗體又能進(jìn)行分裂繁殖，且產(chǎn)生的抗體只能識別一種抗原決定簇，稱為單克隆抗體。單克隆抗體是未來治療學(xué)上的一大研究熱點(diǎn)，有報(bào)道稱單克隆抗體藥物將成為生物醫(yī)藥研究的主旋律。迄今為止世界上已經(jīng)研制出數(shù)以千計(jì)的單克隆抗體，并廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，在疾病發(fā)病的機(jī)制診斷和治療方面發(fā)揮重要作用。隨著對單克隆抗體藥物研究的不斷深入，新藥的不斷推出，單克隆抗體藥一直處于較高的增長率。單克隆抗體不僅在體外診斷試劑上得以廣泛應(yīng)用，還可直接用于對人類疾病的診斷、預(yù)防、治療以及免疫機(jī)制的研究，為人類惡性腫瘤的免疫診斷與免疫治療開辟了廣闊的前景。

單克隆抗體制備流程復(fù)雜，涉及到抗原的篩選，免疫，融合，抗體的檢測、效價(jià)評定等多個(gè)步驟，制備周期長，工藝繁瑣，一般得到分泌抗體的成細(xì)胞株的雜交瘤細(xì)胞時(shí)便會做保種工作，便于以后長期制備單克隆抗體，用于臨床試驗(yàn)及醫(yī)藥等方面。

在雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，出現(xiàn)細(xì)胞污染是不可避免的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，污染源主要有細(xì)菌、病毒、霉菌和支原體四大類。目前對于有大量種子庫的細(xì)胞株可以采用強(qiáng)堿進(jìn)行直接消毒處理（一般采用0.2molNaOH）；對于能明顯查到污染源的細(xì)胞株也可以添加抗生素（一般采用青霉素等）對污染源進(jìn)行抑制生長，并通過頻繁換液來進(jìn)行清除，但成功率并不高；而對一些稀有的、對整個(gè)實(shí)驗(yàn)非常重要的雜交瘤細(xì)胞株被污染后如何進(jìn)行除菌處理，則暫未有較為成熟的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種利用小鼠模型處理污染雜交瘤細(xì)胞的方法，該方法操作簡單，不但能對污染雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行有效的滅菌，且成本低廉，細(xì)胞回收成功率高。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案：

本發(fā)明所述的利用小鼠模型處理污染雜交瘤細(xì)胞的方法包括下述步驟：

第一步，對10周齡的BALB/c小鼠用降植烷或液體石蠟進(jìn)行腹腔預(yù)處理，建立小鼠模型；

第二步，將被污染的分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行懸浮，離心，去除培養(yǎng)基；

第三步，經(jīng)第二步處理的雜交瘤細(xì)胞株在倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并調(diào)整細(xì)胞密度為8×10⁵個(gè)/cm²；

第四步，將第三步調(diào)整好密度的雜交瘤細(xì)胞株注射進(jìn)第一步建立的小鼠模型腹腔內(nèi)，每只小鼠模型的注射量為0.2ml,注射密度為8×10⁵個(gè)/cm²；

第五步，5天后觀察小鼠模型情況，對腹部明顯膨大，顏色變深，手觸摸有緊迫感的小鼠模型進(jìn)行腹水采集；

第六步，將第一次采集的腹水進(jìn)行離心，除去上層不溶的油脂物，并倒出上清，保留底部沉淀物；

第七步，用配制的生理鹽水對保留的底部沉淀物重懸，清洗后離心，去除上清及不溶物，保留底部白色沉淀；

第八步，在配制好的DMEM培養(yǎng)基中加入20%小牛血清和一定量的飼養(yǎng)細(xì)胞后，對底部白色沉淀進(jìn)行重懸及培養(yǎng)；

第九步，觀察雜交瘤細(xì)胞生長狀態(tài)，當(dāng)生長至對數(shù)生長期之后，取上清檢測其效價(jià)；

第十步，對符合滅菌要求的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后凍存保種。

所述BALB/c小鼠為SPF級小鼠。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于方法簡單，操作便捷，安全性高。被污染的雜交瘤細(xì)胞在小鼠模型的腹腔內(nèi)大量繁殖并進(jìn)行天然滅菌，而在小鼠模型產(chǎn)生的腹水內(nèi)含有大量的雜交瘤細(xì)胞，通過離心富集并用生理鹽水根據(jù)細(xì)胞的滲透性不同進(jìn)行預(yù)處理，可以將腹水內(nèi)含有的大量紅細(xì)胞去除，對清洗過的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行正常無菌培養(yǎng)即可，不僅成功的做到保種工作，而且周期短，成功率99.9%，提高了整體的工作效率，節(jié)約了單克隆抗體重新制備的成本，也避免了重新進(jìn)行免疫、融合、檢測等重新保種過程復(fù)雜的操作。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明利用小鼠模型處理污染雜交瘤細(xì)胞的方法具體包括下述步驟：

第一步，提前7~21天對10周齡左右的BALB/c小鼠（SPF級）用降植烷或液體石蠟進(jìn)行腹腔預(yù)處理（每只注射量為0.5ml），建立小鼠模型；

第二步，將被污染的分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行懸浮（因?yàn)殡s交瘤細(xì)胞為半懸浮半貼壁狀態(tài)的細(xì)胞），1500r/min,5min離心，將培養(yǎng)基去除干凈，然后用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行重懸；

第三步，經(jīng)第二步處理的雜交瘤細(xì)胞株在倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并調(diào)整細(xì)胞密度為8×10⁵個(gè)/cm²；

第四步，將第三步調(diào)整好密度的雜交瘤細(xì)胞株注射進(jìn)第一步建立的小鼠模型腹腔內(nèi)，每只小鼠模型的注射量為0.2ml,注射密度為8×10⁵個(gè)/cm²；

第五步，5天后觀察小鼠模型情況，對腹部明顯膨大，顏色變深，手觸摸有緊迫感的小鼠模型進(jìn)行腹水采集（用16號針頭）；

第六步，將第一次采集的腹水進(jìn)行離心（2500r/min,5min），除去上層不溶的油脂物，并倒出上清（可保留備用，里面含有大量雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體），保留底部沉淀物（因?yàn)榈谝淮尾杉母顾锖休^多的雜交瘤細(xì)胞）；

第七步，用配制的生理鹽水（0.9%的NaCl溶液）對保留的底部沉淀物重懸（因?yàn)榇藭r(shí)底部沉淀物組分主要有需要的雜交瘤細(xì)胞和小鼠模型腹腔內(nèi)本身的紅細(xì)胞，根據(jù)兩者細(xì)胞的滲透壓不同，采用0.9%的NaCl溶液進(jìn)行清洗時(shí)，紅細(xì)胞將會破碎溶解到生理鹽水里，而雜交瘤細(xì)胞不受影響，在離心后可有效去除破碎的紅細(xì)胞），清洗后離心（2500r/min,5min），重復(fù)兩次，去除上清及不溶物，保留底部白色沉淀（該白色沉淀即為滅菌后的雜交瘤細(xì)胞）；

第八步，在配制好的DMEM培養(yǎng)基中加入20%小牛血清（v /v）和一定量飼養(yǎng)細(xì)胞（飼養(yǎng)細(xì)胞采用的是小鼠腹腔內(nèi)提取的巨噬細(xì)胞，添加后的比例為每100ml的培養(yǎng)基內(nèi)添加一只小鼠腹腔內(nèi)提取的巨噬細(xì)胞，其細(xì)胞密度約為3-10×10⁵個(gè)/cm²），對底部白色沉淀進(jìn)行重懸及培養(yǎng)；由于巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，容易獲得，便于培養(yǎng)，作用為細(xì)胞培養(yǎng)前期可以給予雜交瘤細(xì)胞提供細(xì)胞密度，吞噬細(xì)胞碎片及分泌生長因子，有利于培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞的成活率，后期會自動全部消失，不影響雜交瘤細(xì)胞種類；

第九步，每天觀察雜交瘤細(xì)胞生長狀態(tài)，當(dāng)生長至對數(shù)生長期之后（即雜交瘤細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察狀態(tài)比較好，細(xì)胞邊緣清晰，明亮，形態(tài)飽滿且長滿平皿底部面積3/4的時(shí)候），取上清檢測其效價(jià)（用ELISA法）；

第十步，對符合滅菌要求的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后凍存保種（-80冷柜或液氮內(nèi)庫存）。