本發(fā)明涉及一種抗福莫特羅單克隆抗體、產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，以及該抗體在檢測(cè)福莫特羅上的應(yīng)用，屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域和獸藥殘留分析技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

福莫特羅(Formoterol)是由日本山之內(nèi)制藥株式會(huì)社中央研究所開(kāi)發(fā)的第三代β₂-腎上腺素受體激動(dòng)劑平喘藥物，具有支氣管擴(kuò)張作用，還有抗過(guò)敏和抑制水腫的作用，可用于治療慢性支氣管哮喘、夜間哮喘、運(yùn)動(dòng)性哮喘、慢性阻塞性肺病以及兒童非哮喘性呼吸道疾病。近年來(lái)，隨著我國(guó)對(duì)食品安全監(jiān)管力度的加強(qiáng)，對(duì)違禁使用獸藥的監(jiān)管力度逐漸加大，濫用違禁獸藥的現(xiàn)象有所控制，但是出現(xiàn)了使用生物活性相似的替代品代替重點(diǎn)監(jiān)管獸藥的新現(xiàn)象。新型“瘦肉精”福莫特羅與克倫特羅等三種常用“瘦肉精”物質(zhì)具有同樣的促進(jìn)生長(zhǎng)、增加瘦肉率的作用，2002年農(nóng)業(yè)部1519號(hào)條例規(guī)定食品動(dòng)物禁止使用β激動(dòng)劑類藥物作為飼料添加劑。福莫特羅檢測(cè)手段滯后，尤其是快速檢測(cè)產(chǎn)品缺乏，國(guó)家及各省市正在加緊建立新型“瘦肉精”物質(zhì)的確證方法，同時(shí)也急需適合批量、快速篩選的檢測(cè)產(chǎn)品，滿足政府和企業(yè)的需要。

目前有關(guān)福莫特羅殘留的檢測(cè)技術(shù)主要有高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)及免疫分析技術(shù)，前三種方法靈敏、準(zhǔn)確，但操作繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和技術(shù)要求較高，不適合大批量樣品的快速檢測(cè)。免疫分析方法包括酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和膠體金免疫層析法(GICA)，具有靈敏度高、特異性好、成本低、操作方便等特點(diǎn)，適于大批量樣品篩選。因此，抗福莫特羅單克隆抗體的制備對(duì)于動(dòng)物性食品免疫快速檢測(cè)方法的建立以及保障人類健康具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種抗福莫特羅單克隆抗體，所述單克隆抗體對(duì)福莫特羅有特異性，所述抗單克隆抗體由保藏編號(hào)為CCTCC NO:C2016182的雜交瘤細(xì)胞株Formoterol-3E6產(chǎn)生。進(jìn)一步的，本發(fā)明將該單克隆抗體應(yīng)用于檢測(cè)福莫特羅。

本發(fā)明所述技術(shù)問(wèn)題是由以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。

一種抗福莫特羅單克隆抗體，該單克隆抗體由保藏號(hào)為CCTCC NO:C2016182的雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。該雜交瘤細(xì)胞株被命名為雜交瘤細(xì)胞株Formoterol-3E6，于2016年10月26日送交中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏號(hào)為CCTCC NO:C2016182。

上述抗福莫特羅單克隆抗體效價(jià)為1:512000，亞型為IgG₁，親和力常數(shù)Ka＝7.24×10⁸L/mol，對(duì)福莫特羅抑制率IC₅₀為1.1μg/L，與福莫特羅的交叉反應(yīng)率為100.00％，與其它幾種相似物(苯乙醇胺A、沙丁胺醇、妥布特羅、鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、西馬特羅)無(wú)交叉反應(yīng)；

上述福莫特羅單克隆抗體在用于配制檢測(cè)生物樣品中的福莫特羅的非診斷目的檢測(cè)產(chǎn)品中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用，所述非診斷目的檢測(cè)產(chǎn)品為酶聯(lián)免疫試劑盒或膠體金層析試紙條。

進(jìn)一步的，一種檢測(cè)福莫特羅的酶聯(lián)免疫試劑盒，該試劑盒中含有所述的抗福莫特羅的單克隆抗體。

一種檢測(cè)福莫特羅的膠體金層析試紙條，該試紙條中含有所述的抗福莫特羅的單克隆抗體。

一種制備上述福莫特羅單克隆抗體的方法，包括如下步驟：

(1)制備福莫特羅抗原工作液：

(a)活化對(duì)氨基苯甲酸的制備：稱取6mg亞硝酸鈉，溶在0.35mL蒸餾水中，然后稱取10mg對(duì)氨基苯甲酸，溶入1.1mL 1mol/L的鹽酸中，冰浴攪拌，將上述亞硝酸鈉溶液逐滴加入到對(duì)氨基苯甲酸溶液中，避光反應(yīng)1h，得到活化對(duì)氨基苯甲酸；

(b)帶有羧基的福莫特羅活性中間體的制備：稱取福莫特羅30mg溶在5mL、0.05mol/L冰冷的硼砂緩沖溶液中(pH＝9，含0.15mol/L的氯化鈉)，冰浴攪拌，將此溶液逐滴加入到活化對(duì)氨基苯甲酸溶液中，4℃避光反應(yīng)3h，得到帶有羧基的福莫特羅活性中間體溶液；

(c)免疫原的合成：在上述帶有羧基的福莫特羅活性中間體溶液中加入0.1mol/LNaOH調(diào)pH至7.4，將EDC 140mg、NHS 60mg溶解在2mL PBS中，少量多次加到溶液中室溫?cái)嚢?h。稱取BSA 200mg溶解在1mL 0.01mol/L的PBS中，邊攪拌邊加入上述溶液中，反應(yīng)過(guò)夜后，將偶聯(lián)物溶液轉(zhuǎn)移至透析袋，在PBS緩沖液中4℃透析72h，然后改用蒸餾水4℃透析48h，每天換液2次。透析后的溶液于6000rmp離心30min，取上清-20℃保存。標(biāo)記為Formoterol-BSA；

(d)檢測(cè)原的合成：在上述帶有羧基的福莫特羅活性中間體溶液中加入0.1mol/LNaOH調(diào)pH至7.4，將EDC 140mg、NHS 60mg溶解在2mL PBS中，少量多次加到溶液中室溫?cái)嚢?h。稱取OVA 150mg溶解在1mL 0.01mol/L的PBS中，邊攪拌邊加入上述溶液中，反應(yīng)過(guò)夜后，將偶聯(lián)物溶液轉(zhuǎn)移至透析袋，在PBS緩沖液中4℃透析72h，然后改用蒸餾水4℃透析48h，每天換液2次。透析后的溶液于6000rmp離心30min，取上清-20℃保存。標(biāo)記為Formoterol-OVA。

(2)制備福莫特羅單克隆抗體：

(a)動(dòng)物免疫：選擇載體蛋白為牛血清白蛋白的免疫原，免疫6-8周齡的雌性Balb/c小鼠，間隔2周免疫1次，3次免疫后斷尾取血測(cè)定效價(jià)和抑制率，選擇結(jié)果最佳的小鼠準(zhǔn)備融合；

(b)細(xì)胞融合：取步驟(a)選定的小鼠的脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，間接ELISA法測(cè)定上清液選取陽(yáng)性高的孔，通過(guò)有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行亞克隆，直至建立產(chǎn)生單一抗福莫特羅的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；

(c)單克隆抗體的大量制備：選取個(gè)體較大的雌性Balb/c小鼠，采用體內(nèi)誘生腹水法，大量制備腹水，并通過(guò)辛酸-硫酸銨沉淀純化腹水，分成小管，-20℃保存，獲得福莫特羅單克隆抗體。

一種鑒定上述福莫特羅單克隆抗體特性的方法，包括如下步驟：

(a)效價(jià)測(cè)定

以1：40000稀釋包被原包被檢測(cè)板，將純化后的單克隆抗體進(jìn)行1:2000，1:4000，1:8000，……1:1024000稀釋，加入到酶標(biāo)板孔內(nèi)，反應(yīng)后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，最后用TMB顯色，結(jié)果顯示純化后的福莫特羅單克隆抗體濃度為1mg/mL時(shí)的效價(jià)達(dá)1：512000。

(b)亞型測(cè)定

采用購(gòu)自Sigma公司的鼠源單抗亞型鑒定試劑盒進(jìn)行亞型測(cè)定，結(jié)果顯示福莫特羅單克隆抗體亞型為IgG1。

(c)親和力測(cè)定

采用非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法測(cè)定福莫特羅單克隆抗體的親和常數(shù)，結(jié)果顯示親和常數(shù)Ka＝7.24×10⁸L/mol。

(d)抑制率測(cè)定

采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定抑制率，以吸光度百分比B/B0％(B代表不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液的A450，B0代表零濃度標(biāo)準(zhǔn)液的A450)為縱坐標(biāo)，以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液的對(duì)數(shù)[Lg(formoterol)]為橫坐標(biāo)，繪制抗體的抑制曲線。結(jié)果顯示該抗體對(duì)福莫特羅抑制率IC₅₀為1.1μg/L。

(f)特異性測(cè)定

用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定該抗體與福莫特羅及其類似物(苯乙醇胺A、沙丁胺醇、妥布特羅、鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、西馬特羅)的交叉反應(yīng)率，結(jié)果該抗體與福莫特羅CR(％)為100％，與其類似物CR(％)均小于0.1％。

本發(fā)明提供的單克隆抗體可應(yīng)用于檢測(cè)樣品中福莫特羅，主要是將其應(yīng)用于制備福莫特 羅檢測(cè)的酶聯(lián)免疫試劑盒和膠體金試條紙。本發(fā)明提供的抗福莫特羅單克隆抗體的質(zhì)量具有很強(qiáng)的可控性和可重復(fù)性，并通過(guò)對(duì)所得抗體特性的初步分析及鑒定，為特異、靈敏的免疫測(cè)定方法的進(jìn)一步建立和應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明所述福莫特羅單克隆抗體效價(jià)測(cè)定圖

圖2本發(fā)明所述福莫特羅單克隆抗體亞型測(cè)定圖

圖3本發(fā)明所述福莫特羅單克隆抗體親和力測(cè)定圖

圖4本發(fā)明所述福莫特羅單克隆抗體抑制率測(cè)定圖

本發(fā)明所述的抗福莫特羅單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株Formoterol-3E6，已于2016年10月26日送交中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC，地址：武漢大學(xué)，中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，郵編：430072)保藏，保藏編號(hào)CCTCC NO:C2016182。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，所列舉的實(shí)施例不對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容和保護(hù)范圍構(gòu)成任何限制。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例一 本發(fā)明所述福莫特羅抗原的制備

(1)活化對(duì)氨基苯甲酸的制備：稱取6mg亞硝酸鈉，溶在0.35mL蒸餾水中，然后稱取10mg對(duì)氨基苯甲酸，溶入1.1mL 1mol/L的鹽酸中，冰浴攪拌，將上述亞硝酸鈉溶液逐滴加入到對(duì)氨基苯甲酸溶液中，避光反應(yīng)1h，得到活化對(duì)氨基苯甲酸；

(2)帶有羧基的福莫特羅活性中間體的制備：稱取福莫特羅30mg溶在5mL、0.05mol/L冰冷的硼砂緩沖溶液中(pH＝9，含0.15mol/L的氯化鈉)，冰浴攪拌，將此溶液逐滴加入到活化對(duì)氨基苯甲酸溶液中，4℃避光反應(yīng)3h，得到帶有羧基的福莫特羅活性中間體溶液；

(3)免疫原的合成：在上述帶有羧基的福莫特羅活性中間體溶液中加入0.1mol/LNaOH調(diào)pH至7.4，將EDC 140mg、NHS 60mg溶解在2mL PBS中，少量多次加到溶液中室溫?cái)嚢?h。稱取BSA 200mg溶解在1mL 0.01mol/L的PBS中，邊攪拌邊加入上述溶液中，反應(yīng)過(guò)夜后，將偶聯(lián)物溶液轉(zhuǎn)移至透析袋，在PBS緩沖液中4℃透析72h，然后改用蒸餾水4℃透析48h，每天換液2次。透析后的溶液于6000rmp離心30min，取上清-20℃保存。標(biāo)記為Formoterol-BSA；

(4)檢測(cè)原的合成：在上述帶有羧基的福莫特羅活性中間體溶液中加入0.1mol/LNaOH調(diào)pH至7.4，將EDC 140mg、NHS 60mg溶解在2mL PBS中，少量多次加到溶液中室溫?cái)嚢?h。稱取OVA 150mg溶解在1mL 0.01mol/L的PBS中，邊攪拌邊加入上述溶液中，反應(yīng) 過(guò)夜后，將偶聯(lián)物溶液轉(zhuǎn)移至透析袋，在PBS緩沖液中4℃透析72h，然后改用蒸餾水4℃透析48h，每天換液2次。透析后的溶液于6000rmp離心30min，取上清-20℃保存。標(biāo)記為Formoterol-OVA。

實(shí)施例二 本發(fā)明所述福莫特羅單克隆抗體的制備

(1)動(dòng)物免疫：載體蛋白為牛血清白蛋白的免疫原免疫6-8周齡的雌性Balb/c小鼠，間隔2周免疫1次，免疫流程見(jiàn)表1，三免后斷尾取血測(cè)定效價(jià)和抑制率，選擇結(jié)果最佳的小鼠準(zhǔn)備融合；

表1免疫流程圖

(2)細(xì)胞融合：融合小鼠摘眼球放血，將血清作為陽(yáng)性對(duì)照，脫頸處死后無(wú)菌條件下取出脾臟，制備脾細(xì)胞，與SP2/0細(xì)胞按5:1的比例通過(guò)PEG融合，將融合后的細(xì)胞懸液加入已鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板，放入37℃、5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

(3)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的篩選：融合后的細(xì)胞，次日檢查有無(wú)污染，融合后第10天換用HT培養(yǎng)基。換液后2-3d用間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA進(jìn)行陽(yáng)性孔篩選，盡量挑選出強(qiáng)陽(yáng)性、抑制率高、單個(gè)克隆、細(xì)胞狀態(tài)好的孔，通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存，直至建立單一分泌抗體的單克隆細(xì)胞株。

(4)單克隆抗體的大量制備：采用小鼠體內(nèi)誘生腹水的方法，取健康的Balb/c雌性小鼠，每只小鼠體內(nèi)注射石蠟油0.5mL，7d后調(diào)整克隆化陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞10⁶/mL，每只小鼠腹腔注射1mL，7-9天取腹水，離心棄脂肪，經(jīng)辛酸-硫酸銨純化，凍干后-20℃保存，獲得福莫特羅單克隆抗體。

實(shí)施例三 本發(fā)明所述福莫特羅單克隆抗體特性鑒定

(1)效價(jià)測(cè)定

采用間接ELISA法，具體步驟如下：包被：用碳酸鹽緩沖液稀釋包被原至濃度為2μg/mL，96孔酶標(biāo)板100μL/孔，4℃過(guò)夜；洗滌：包被板恢復(fù)至室溫，傾去包被液，每孔加洗液300μL，每次靜置l min，洗滌3次，最后一次拍干；封閉：每孔加200μL含10％小牛血清的洗液，37℃1h；傾去封閉液，洗滌3次，拍干；加一抗：用洗液將單抗以1:2000倍開(kāi)始倍比稀釋，每孔加入100μL，并設(shè)置空白對(duì)照孔(PBS)和陰性對(duì)照(陰性血清)，37℃放置45min；傾 去一抗，洗滌3次，拍干；加酶標(biāo)二抗：每孔加入100μL的l:10000倍稀釋的HRP酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，37℃放置30min；傾去二抗，洗滌3次，拍干；顯色：每孔加底物顯色液100μL，37℃避光反應(yīng)15min；終止：每孔加入50μL終止液，終止反應(yīng)；檢測(cè)：測(cè)定波長(zhǎng)為450nm處的吸光度值(A450nm)。

結(jié)果判定：(A樣品孔－A空白對(duì)照)/(A陰性對(duì)照－A空白對(duì)照)≧2.1，且陰性對(duì)照的A450nm小于0.2時(shí)，此時(shí)抗體的稀釋倍數(shù)即為抗體效價(jià)。結(jié)果見(jiàn)圖1，抗福莫特羅單克隆抗體3E6濃度為1mg/ml時(shí)的效價(jià)達(dá)1：512000。

(2)亞型測(cè)定

采用購(gòu)自Sigma公司的鼠源單抗亞型鑒定試劑盒進(jìn)行亞型測(cè)定。雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體與不同亞類的二抗顯色有明顯差異，其中與IgG1二抗的A450nm值最高，與IgM的二抗顯色微弱，而與IgG2a、IgG2b、IgG3和IgA二抗幾乎不顯色，該細(xì)胞分泌的抗體類型以IgG1為主。結(jié)果見(jiàn)圖2所示，福莫特羅單克隆抗體亞型為IgG1。

(3)親和力測(cè)定

采用非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定親和常數(shù)(Ka)。具體步驟如下：包被：用碳酸鹽緩沖液稀釋包被原至濃度為1、0.5、0.1、0.05μg/mL，96孔酶標(biāo)板100μL/孔分別包被，4℃過(guò)夜；傾去包被液，洗滌3次，拍干；封閉：每孔加200μL含10％小牛血清的洗液，37℃1h；傾去封閉液，洗滌3次，拍干；加單抗：用洗液將單抗以100μg/mL開(kāi)始倍比稀釋，每孔加入100μL，37℃保溫保濕45min；傾去一抗，洗滌3次，拍干；加酶標(biāo)二抗：每孔加入100uL的l:10000倍稀釋的HRP酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，37℃放置30min；傾去二抗，洗滌3次，拍干；顯色：每孔加底物顯色液100μL，37℃避光反應(yīng)15min；終止：每孔加入50μL終止液，終止反應(yīng)；檢測(cè)：測(cè)定波長(zhǎng)為450nm處的吸光度值(A450nm)。按下列公式計(jì)算Ka

Ka＝(n-1)/2(n Ab’-Ab)

式中：Ab為抗原濃度為Ag時(shí)，產(chǎn)生半數(shù)吸光度值的抗體濃度；Ab’為抗原濃度為Ag’時(shí)，產(chǎn)生半數(shù)吸光度值的抗體濃度；n為Ag和Ag’之間的稀釋倍數(shù)采用非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法測(cè)定福莫特羅單克隆抗體的親和常數(shù)，結(jié)果如圖3所示，親和常數(shù)Ka＝7.24×10⁸L/mol。

(4)抑制率測(cè)定

采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，具體步驟如下：包被：用碳酸鹽緩沖液稀釋包被原至濃度為2μg/mL，96孔酶標(biāo)板100μL/孔，4℃過(guò)夜；傾去包被液，洗滌3次，拍干；封閉：每孔加200μL含10％小牛血清的洗液，37℃1h；傾去封閉液，洗滌3次，拍干；加單抗和標(biāo)準(zhǔn)品：將標(biāo)準(zhǔn)品母液用PBS稀釋成8.1、2.7、0.9、0.3、0.1、0μg/L，每孔加入50μL，再加入一定稀釋倍數(shù)的單抗，每孔50μL，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照孔(PBS)和陰性對(duì)照(50μL單抗+50μL洗液)，37℃ 保溫保濕45min；傾去一抗，洗滌3次，拍干；加酶標(biāo)二抗：每孔加入100uL的l:10000稀釋的HRP酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，37℃放置30min；傾去二抗，洗滌3次，拍干；顯色：每孔加底物顯色液100μL，37℃避光反應(yīng)15min；終止：每孔加入50μL終止液，終止反應(yīng)；檢測(cè)：測(cè)定波長(zhǎng)為450nm處的吸光度值(A450nm)。

以吸光度百分比B/B0％(B代表不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液的A450，B0代表零濃度標(biāo)準(zhǔn)液的A450)為縱坐標(biāo)，以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液的對(duì)數(shù)[Lg(formoterol)]為橫坐標(biāo)，繪制抗體的抑制曲線。結(jié)果見(jiàn)圖4，該抗體對(duì)福莫特羅抑制率IC₅₀為1.1μg/L。

(5)特異性測(cè)定

用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定該抗體與福莫特羅及其類似物(苯乙醇胺A、沙丁胺醇、妥布特羅、鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺、西馬特羅)的交叉反應(yīng)率，結(jié)果見(jiàn)表2，該抗體與福莫特羅CR(％)為100％，與其類似物CR(％)均小于0.01％。

表2抗福莫特羅單克隆抗體與類似物交叉反應(yīng)結(jié)果

實(shí)施例四 本發(fā)明所述福莫特羅單克隆抗體的應(yīng)用

本實(shí)施例是本發(fā)明福莫特羅單克隆抗體在建立檢測(cè)福莫特羅殘留的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒或膠體金層析試紙條方法后的應(yīng)用舉例，可以用于動(dòng)物組織、尿液和飼料中福莫特羅的檢測(cè)。

(1)樣品前處理

(a)尿樣：取尿樣室溫5000rpm離心5min，取上清100μL用樣品稀釋液稀釋4倍，取上清進(jìn)行檢測(cè)；

(b)(肉類、腎臟、肝臟等)組織：稱取肉樣組織2.0g±0.05g，加入5mL乙酸乙酯，振蕩1min，5000rpm離心10min；移取上層乙酸乙酯層溶液于另一離心管中，水相再用5mL乙酸乙酯重復(fù)萃取，合并有機(jī)相氮?dú)獯蹈桑患尤?mL復(fù)溶工作液溶解，取50μL用于分析；

(c)飼料：稱取飼料2.0g±0.05g，加入5mL乙酸乙酯，振蕩1min，5000rpm離心10min；移取上層乙酸乙酯層溶液于另一離心管中，水相再用5mL乙酸乙酯重復(fù)萃取，合并有機(jī)相氮?dú)獯蹈桑患尤?mL復(fù)溶工作液溶解，取50μL用于分析。

(2)該抗體應(yīng)用于酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒方法檢測(cè)

本發(fā)明中試劑盒的檢測(cè)原理是間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。

檢測(cè)：將福莫特羅包被原包被于微孔板上，按需要取出板條，放置在酶標(biāo)板上；按需要的量將福莫特羅單克隆抗體工作液和酶標(biāo)記抗抗體工作液按5:1比例混合；向孔內(nèi)依次加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品50μL、福莫特羅單克隆抗體工作液和酶標(biāo)記抗抗體工作液的混合液50μL，輕輕振蕩混勻，25℃避光孵育30min；將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液(用去離子水將20×濃縮洗滌液20倍稀釋)250μL/孔，洗滌4次，拍干；將顯色液A和顯色液B按1:1比例混合，100μL/孔加入顯色，25℃避光孵育15min；加終止液50μL終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450nm下采用雙波長(zhǎng)450nm/630nm測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量或定性。

結(jié)果判定：(a)定量分析：分別計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品的平均吸光度值，標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的吸光度值(B)除以0標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值再乘以100％，即為百分吸光度值，百分吸光度值＝(B/B₀)×100％。以百分吸光度值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待測(cè)樣本的百分吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求出對(duì)應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即為樣本的實(shí)際含量。(b)定性分析：用待測(cè)樣本的平均吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值相比較，即可得出待測(cè)樣本的濃度范圍，測(cè)試范圍為0.1μg/ml-8.1μg/ml。

(3)該抗體應(yīng)用于膠體金層析試紙條方法檢測(cè)

反應(yīng)原理采用競(jìng)爭(zhēng)法對(duì)福莫特羅進(jìn)行半定量檢測(cè)，樣品中存在的福莫特羅在沿試紙條上移過(guò)程中先與金顆粒標(biāo)記的抗體結(jié)合，固定在NC膜上的包被原與福莫特羅同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合金標(biāo)抗體，T位置(檢測(cè)線)的顯色強(qiáng)弱與樣品中殘留福莫特羅的含量成反比，若樣品中無(wú)福莫特羅殘留，則金標(biāo)抗體全部與包被原反應(yīng)，試紙條的T線顯色。

檢測(cè)：取出福莫特羅膠體金層析試紙條，將樣品端插入待測(cè)樣品液中，插入深度不超過(guò)標(biāo)記線，約10-20秒鐘取出檢測(cè)試紙條，水平放置，3-5分鐘觀察判定檢測(cè)結(jié)果，10分鐘以后結(jié)果無(wú)效。

結(jié)果判定：包被膜上對(duì)應(yīng)的質(zhì)控區(qū)C位置(質(zhì)控線)顯示一條棕紅色線，檢測(cè)區(qū)T位置不顯示棕紅色線，表示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明在待測(cè)樣品中含有福莫特羅；在包被膜上T、C位置顯示有兩條棕紅色線，表示結(jié)果為陰性，說(shuō)明在待測(cè)樣品中不含福莫特羅；當(dāng)質(zhì)控區(qū)C不顯示出棕紅色條帶，則無(wú)論檢測(cè)區(qū)T顯示出棕紅色條帶與否該試紙均判為無(wú)效。

上述實(shí)施例只為說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思和優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明也可以具有其它的形式變化，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，上述實(shí)施例僅僅起到對(duì)上述發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)的示范作用，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在本發(fā)明所限定的保護(hù)范圍內(nèi)還有很多常規(guī)變形和其它實(shí)施例，這些變形和實(shí)施例都將在本發(fā)明待批的保護(hù)范圍之內(nèi)。