本發(fā)明屬于禽病預防疫苗制備技術領域，具體涉及一種嵌合型新城疫病毒樣顆粒的制備方法的專利申請。

背景技術：

新城疫是由新城疫病毒引起的以感染禽類為主的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病，被OIE列為必報動物疫病，也是我國中長期規(guī)劃五大優(yōu)先防治的動物疫病之一。新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）在病毒學分類中屬于副黏病毒科、禽副黏病毒屬的一個種，即禽副黏病毒1型，是一種不分節(jié)段的單分子負鏈RNA病毒。新城疫病毒基因組結構模式為3’-NP-P-M-F-HN-L-5’，依次編碼六種結構蛋白：核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein，NP）、磷蛋白（Phosphor protein，P）、基質蛋白（Matrix protein，M）、融合蛋白（Fusion protein，F(xiàn)）、血凝素-神經氨酸酶蛋白（Heamagglutinin-Neuraminidase protein，HN）和大分子蛋白（Large protein，L）。新城疫病毒顆粒為有囊膜的病毒粒子，呈多形性，直徑約為120nm~300nm，囊膜表面覆蓋有8nm長的纖突，病毒粒子內部為一直徑17nm左右的卷曲核衣殼?；|蛋白M位于囊膜和核衣殼之間，既與膜結合又與核衣殼結合，是新城疫病毒粒子形成和出芽的主要驅動力。

雞新城疫自1946年在我國首次報道至今，已在中國存在60多年，表現(xiàn)出一定新的臨床及流行特點。流行病學數(shù)據(jù)充分證明基因VII型已經成為我國NDV流行的主要優(yōu)勢基因型，但也存在基因III、IX和VI型等散發(fā)，基因VII型NDV所占的比重呈逐年上升趨勢。與此同時，NDV經過世界范圍內四次大流行后，其宿主范圍也不斷擴大，迄今能自然或人工感染的禽類已超過250多種。過去認為，NDV一般不對鴨、鵝等水禽有致病性，而近十幾年，在鴨群、鵝群中常見新城疫的暴發(fā)與流行。大量流行病學調查數(shù)據(jù)顯示，當前我國NDV的優(yōu)勢流行株屬于基因VII型，而目前國內普遍使用的疫苗LaSota為基因II型，雖然它們同屬一個血清型，但在遺傳距離上相差較遠，對當前NDV強株的攻擊并不能提供理想的免疫保護效力。目前常用的生產活疫苗的毒株有Mukteswar株（I系苗）、Hitchner B1株（II系苗）、F株（III系苗）、LaSota株（IV系苗）以及V4弱毒苗。其中I系苗為中等毒力型，II、III、IV系疫苗毒力較弱。弱毒苗可大規(guī)模飲水、噴霧和氣霧免疫，能刺激黏膜免疫，而且疫苗毒可以從免疫禽傳播給未免疫禽。其不足之處在于污染環(huán)境，并且有毒力返強可能，在機體抵抗力下降時，可能引起發(fā)病。生產滅活苗的毒種一般包括LaSota、Ulster等，實際生產中多用來制造二聯(lián)或多聯(lián)疫苗。滅活苗產生抗體水平較高，持續(xù)時間較長，比較容易儲存，受母源抗體影響小，免疫不良反應小；但滅活苗的滅活、乳化及免疫時需要較大劑量，所以成本較高。鑒于新城疫的流行對我國整個養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經濟損失，加緊研制有效疫苗十分有必要。

病毒樣顆粒（Virus-like particles，VLPs）是由某種病毒的一個或多個結構蛋白自行裝配而成的高度結構化的空心蛋白顆粒，不含病毒核酸，無法自主復制，不存在基因重組或重配和毒力回復的可能，安全性高，在形態(tài)上與天然病毒顆粒相似，能夠通過與病毒感染一樣的途徑，以接近真實構象的形式遞呈給免疫細胞，更容易被機體免疫系統(tǒng)識別，從而有效誘導機體產生免疫保護反應。

病毒樣顆粒的制備可基于大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞以及昆蟲桿狀病毒這四種表達系統(tǒng)，而利用昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)制備的病毒樣顆粒種類已占到了30%以上，其主要原因是該系統(tǒng)具有不同于其他表達系統(tǒng)的獨特優(yōu)點：（1）承載量大，桿狀病毒可容納較大的外源DNA插入(約l0kb)而不影響病毒的復制與裝配；(2)高效表達，多角體基因和p10基因有非常強大的啟動子能驅動靶基因的高水平表達，外源基因表達量往往是其他系統(tǒng)的幾十到幾百倍；(3)表達產物后加工較完善，昆蟲細胞對蛋白質的后加工系統(tǒng)與哺乳動物細胞接近，具有表達產物能糖基化、磷酸化、脂肪酞化、酞胺化、切割信號膚和形成三級或四級高級結構的特點，所以在結構、生物活性、抗原性和免疫性等方面與天然蛋白有很高的相似性；(4)借助多元表達載體或借助幾個不同重組病毒的共感染，可以同時表達兩個或多個外源蛋白，便于研究肽鏈的裝配和蛋白寡聚體的結構和功能；(5)適合表達細胞毒性蛋白，應用晚期多角體蛋白基因啟動子表達外源基因，即使表達產物是細胞毒性蛋白，也不影響表達水平，因為在這些有毒產物表達之前，病毒已經完成復制并釋放出大量成熟的子代毒粒，不會干擾病毒的復制；(6)安全性好，桿狀病毒是昆蟲或者節(jié)肢動物病毒，對人畜無害，外源基因插入多角體蛋白基因位點引起其缺失或失活，因此重組病毒不能產生包涵體，這不僅為重組病毒提供了選擇標記，而且重組病毒無多角體蛋白形成，失去了病毒粒子的天然護物一多角體蛋白結晶體，極易在自然環(huán)境中失活，不能像野生病毒那樣在環(huán)境中長期存在，在自然界生存能力弱，所以更加安全；(7)桿狀病毒表達載體通用性廣，能用于表達來自病毒、細菌、真菌、植物和動物幾乎所有蛋白，并且能表達帶有內含子的外源基因。因此，用該系統(tǒng)生產病毒樣顆粒容易形成產業(yè)化。

嵌合病毒樣顆粒(chimeric VLPs，cVLPs)是一種改良型VLP，通過基因融合表達或以VLP為載體通過化學偶聯(lián)或基因融合的方法將外源抗原與其偶聯(lián)制備而成。嵌合型病毒樣顆粒在同一細胞中復合基因的共轉染及協(xié)同表達在許多方面還困難重重，cVLPs的組裝程度較低，同時還需要特定的結構蛋白，因此缺點十分明顯。

GPI錨定蛋白是一種新型真核細胞表面蛋白，它只通過GPI結構錨定于真核細胞膜表面而不跨越其磷脂膜雙層結構。與傳統(tǒng)跨膜型細胞表面蛋白不同，它只通過其梭基末端的GPI結構錨定于細胞膜表面，并不跨越其磷脂膜雙層結構。GPI錨定蛋白轉染法是指將目的蛋白編碼序列和GPI錨定信號肽編碼序列重組，制備該目的蛋白的GPI重組衍生物，當它在適宜的溫度下與靶細胞共同孵育時，可自動整合至真核細胞膜表面并表達活性。其優(yōu)點在于: ① 許多原始細胞，無論正常細胞或腫瘤細胞均不易在體外長期生長，且難以穩(wěn)定轉染(病毒性載體除外)，而蛋白轉化法則不依賴于細胞自身增殖潛能及可轉染性，可以錨定于難于轉染的細胞，故可用于原代細胞的轉化，與細胞類型無關。② 在同一細胞中復合基因的共轉染及協(xié)同表達在許多方面還困難重重，而蛋白轉化原則上可允許無限數(shù)量的蛋白同時或順序地傳遞至同一細胞，表達于細胞表面的蛋白含量可精確控制。③ 與基因轉化不同，蛋白轉化是另一個非常迅速的過程，可以減少細胞的培養(yǎng)時間而迅速改變細胞表面性狀，尤其適用于臨床治療。④G P I 錨定蛋白可在磷脂酶C的作用下由細胞表面分離，當它被非離子型去污劑由細胞表面洗脫后，可在一定條件下重新整合至細胞表面并恢復其功能，從而克服了傳統(tǒng)基因轉化法的不足。⑤不同種GPI錨定蛋白可以相繼或同時錨定于同一種細胞膜。

現(xiàn)有技術中，尚未見到較好的利用GPI錨定蛋白策略來構建新城疫病毒樣顆粒的有關報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種利用新的制備策略所提供的一種嵌合型新城疫病毒樣顆粒制備方法，利用該方法制備的新城疫病毒樣顆?？蔀橄嚓P新型新城疫疫苗的開發(fā)奠定良好基礎。

本發(fā)明所采取的技術方案詳述如下。

一種嵌合型新城疫病毒樣顆粒的制備方法，包括如下步驟：

（1）制備新城疫病毒樣顆粒，具體為：

將新城疫病毒基質基因（基質蛋白M對應M基因）和血凝素-神經氨酸酶基因（HN基因）分別克隆至T載體中，分別構建重組克隆質粒pT-M和pT-HN；

對pT-M和pFastBac Dual質粒分別進行SalI-NotI雙酶切，將酶切產物進行連接構建重組質粒pFastBac-M；

再將質粒pFastBac-M和pT-HN分別進行NheI-KpnI雙酶切，將酶切產物進行連接，最終構建穿梭質粒pFastBac-M+HN；

將所構建的穿梭質粒pFastBac-M+HN轉化DH10 Bac感受態(tài)細胞中，獲得重組桿粒rBacmid-M+HN；

將重組桿粒rBacmid-M+HN轉染昆蟲Sf 9細胞后得到重組桿狀病毒rBV-M+HN，經培養(yǎng)并純化處理后，得到新城疫病毒樣顆粒；

所述培養(yǎng)并純化處理，具體為，將重組桿狀病毒rBV-M+HN以MOI=5的條件感染昆蟲Sf9細胞，感染5天后，收集細胞培養(yǎng)上清；

經8000r/min離心30分鐘后，可初步去除大的細胞碎片；

對所收集的細胞培養(yǎng)上清采用蔗糖密度梯度進行純化，采用不連續(xù)20%-40%-60%蔗糖密度梯度離心，濃縮樣品在20%和40%蔗糖層的中間會形成白色條帶，而桿狀病毒則沉淀于底部，其他小的雜蛋白會停留在頂層，收集白色條帶層，最后收集所獲得的即為新城疫病毒樣顆粒；

所述新城疫病毒基質基因，具體例如為由新城疫病毒株Newcastle disease virus NA-1 strain（GenBank：DQ659677）中所提取的病毒基質基因；其中基質基因和血凝素-神經氨酸酶基因為新城疫病毒基因組上固定的結構基因，基質蛋白M為形成新城疫病毒樣顆粒的必須蛋白，血凝素-神經氨酸酶HN為新城疫病毒主要毒力蛋白，也是重要的保護性抗原；

（2）制備GM-CSF-GPI錨定蛋白，具體為：

人工合成融合序列（該序列包含依次連接的蜂素信號肽序列、His標簽序列、GM-CSF全長序列、TEV切割序列以及GPI信號肽序列，具體如SEQ ID NO.1所示）；

將該融合序列與pFastBac1 在T4 DNA連接酶的作用下進行連接；

將連接產物轉化至Escherichia coli DH5α中，用含有特定抗生素的（氨芐青霉素終濃度100μg/mL，慶大霉素終濃度100μg/mL）選擇培養(yǎng)基篩選陽性菌落并提取質粒，構建穿梭質粒pFastBac-GM-CSF-GPI；

將穿梭質粒pFastBac-GM-CSF-GPI轉化至DH10 Bac感受態(tài)細胞中，使其進行同源重組，經含有三抗（卡那霉素終濃度100μg/mL、慶大霉素終濃度50μg/mL、四環(huán)素終濃度70μg/mL）的IPTG條件篩選培養(yǎng)基（IPTG終濃度24mg/mL，X-gal終濃度20mg/mL，該篩選培養(yǎng)基可通過菌落形成顏色判定是否發(fā)生同源重組，白色菌落即代表重組成功，藍色菌落則未成功）篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，挑取白斑，篩選獲得重組桿粒rBacmid-GM-CSF-GPI；

將重組桿粒rBacmid-GM-CSF-GPI轉染（例如利用Roche公司的X-tremeGENE HP DNA transfection Reagent進行轉染）昆蟲Sf9細胞，得到重組桿狀病毒rBV-GM-CSF-GPI，經培育并純化處理后，得到GM-CSF-GPI錨定蛋白；

所述培育并純化處理，具體為：

將重組桿狀病毒rBV-GM-CSF-GPI以MOI=1的條件感染昆蟲Sf9細胞，感染3天后，收集培養(yǎng)懸液，8000轉離心30分鐘，棄上清液，收集細胞沉淀，用PBS（磷酸鹽緩沖液）重懸細胞后，采用超聲破碎的方式裂解細胞，此時再以8000轉離心30分鐘的條件處理，收集上清液進行后續(xù)；

對所收集的上清液，采用鎳柱（特異性結合His標簽）親和層析技術將含有His標簽蛋白純化收集，再經TEV蛋白酶處理，最后收集的產物即為GM-CSF-GPI錨定蛋白，此時將該蛋白濃度控制在1-5mg/ml，保存于-20℃；

（3）制備嵌合型新城疫病毒樣顆粒，具體為：

將步驟（1）中制備所得新城疫病毒樣顆粒和步驟（2）制備所得GM-CSF-GPI錨定蛋白，混合均勻后進行孵育，37℃孵育1~3小時，孵育的具體時間根據(jù)蛋白濃度所決定，例如：GM-CSF-GPI錨定蛋白濃度為1mg/ml時孵育3小時，GM-CSF-GPI錨定蛋白濃度為5mg/ml時孵育1小時，隨后將孵育的樣品經4℃、100000×g超速離心6小時，收集沉淀即為嵌合型新城疫病毒樣顆粒。

利用嵌合型新城疫病毒樣顆粒制備方法所制備的嵌合型新城疫病毒樣顆粒。

嵌合型新城疫病毒樣顆粒在新城疫疫苗制備中的應用。

本發(fā)明的總體設計思路為：

首先，將新城疫病毒基質蛋白和血凝素-神經氨酸酶基因序列克隆、重組至昆蟲桿狀病毒基因組中，得到能夠表達這兩種結構蛋白的重組桿狀病毒，重組桿狀病毒高效表達蛋白并形成完整的病毒樣顆粒，收集細胞培養(yǎng)上清經純化后獲得大量新城疫病毒樣顆粒；

其次，將粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）序列與糖基化磷脂酰肌醇（GPI）序列進行融合拼接，并將融合序列重組至昆蟲桿狀病毒基因組中，經表達純化后獲得GM-CSF-GPI蛋白；

最后，將GM-CSF-GPI蛋白與制備的新城疫病毒樣顆粒在37℃下孵育后，獲得嵌合型新城疫病毒樣顆粒。

總體而言，本發(fā)明的主要技術優(yōu)勢體現(xiàn)在如下幾個方面：

（1）具有較好的安全性和免疫原性，本發(fā)明通過較為成熟的昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)所制備的新城疫病毒樣顆粒，可形成與真實病毒相類似的結構，其不含有核酸等遺傳物質，保留了病毒原有的保護性抗原，因此具有良好的安全性和免疫原性；

（2）制備了新的GM-CSF-GPI蛋白，所制備的GM-CSF-GPI蛋白可通過GPI錨羧基末端的磷酸基團與膜中的磷脂相連，以共價鍵形式結合于細胞膜表面，而不跨越其磷脂雙層結構，最終達到嵌合至新城疫病毒樣顆粒表面的目的；同時，所制備的GM-CSF-GPI蛋白，一定程度上提高了新城疫病毒樣顆粒的免疫原性；

（3）蛋白嵌合穩(wěn)定且嵌合蛋白可被定量，本發(fā)明中制備嵌合病毒樣顆粒時，是將新城疫病毒樣顆粒和GM-CSF-GPI蛋白在適宜溫度條件下孵育方式的嵌合，這種嵌合方式充分考慮了GM-CSF-GPI蛋白的特殊性，避免了基因水平轉染不穩(wěn)定的問題，而且嵌合的蛋白可被準確定量；

（4）可作為新型滅活疫苗應用，利用本發(fā)明所提供的嵌合型新城疫病毒樣顆粒制備方法所制備的嵌合型新城疫病毒樣顆粒，可作為新型滅活疫苗應用，在免疫雞后可誘導機體產生特異性免疫反應。

需要解釋的是，新城疫病毒樣顆粒其表面為真核細胞膜，具有真核細胞膜多特征的磷脂雙分子層，因此可以被GPI錨定蛋白所嵌合。本申請的主要目的之一在于改良新城疫病毒樣顆粒的組裝策略，并且提高其裝載外源蛋白的能力以及對外源蛋白進行準確定量。

總之，利用本發(fā)明所提供的嵌合型新城疫病毒樣顆粒制備方法所制備的嵌合型新城疫病毒樣顆粒，其基于蛋白水平的修飾策略，可避免基因水平轉染不穩(wěn)定的缺陷，并且嵌合的蛋白可被準確定量；同時該嵌合型新城疫病毒樣顆?？捎行岣呙庖邞?，因而具有廣闊的應用前景。

附圖說明

圖1為重組桿狀病毒rBV-M+HN的構建圖譜；

圖2為重組桿狀病毒rBV-M+HN的PCR驗證電泳圖；其中泳道1為Trans2K DNA分子量標準，泳道2為M基因引物的PCR結果（1100bp），泳道3為HN基因引物的PCR結果（1700bp）；

圖3為新城疫病毒樣顆粒的透射電鏡圖；

圖4為人工合成的融合序列的酶切鑒定電泳圖；其中泳道1為DL 10000 ladder DNA分子量標準，泳道2為GM-CSF-GPI經EcoRI和HindIII酶切的電泳結果（662bp）；

圖5為重組穿梭質粒pFastBac-GM-CSF-GPI的構建圖譜；

圖6為不同孵育時間對GM-CSF-GPI蛋白的鑒定圖；其中泳道1為蛋白分子量標準，泳道2為孵育1小時的結果，泳道3為孵育2小時的結果，泳道4為孵育3小時的結果；

圖7為嵌合型新城疫病毒樣顆粒的透射電鏡圖；

圖8為免疫雞血清抗體HI效價消長規(guī)律檢測圖。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的解釋說明，在介紹具體實施例前，對下述實施例中所涉及部分實驗原理、實驗設備情況簡要介紹說明如下。

生物材料：

下面結合實施例對本申請做進一步的解釋說明，在介紹具體實施例前，就下述實施例中涉及部分生物材料、實驗試劑、實驗設備等情況簡要介紹說明如下。

生物材料：

pFastBac1質粒、sf9昆蟲細胞、DH10Bac感受肽細胞、DH5α感受態(tài)細胞等均為Thermo公司產品；

T載體，購自大連寶生物有限公司；

實驗試劑：

Taq聚合酶，購自北京全式金公司；

脂質體轉染試劑，為Roche公司產品；

質粒提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒，購自康寧公司；

昆蟲無血清培養(yǎng)基SFM-II，為Thermo公司產品；

實驗設備：

實驗過程中所用超純水由超純水發(fā)生裝置（Christ Spetron Line）制備；

低溫臺式高速離心機，美國ICE公司產品；

PCR儀，Thermo Fisher Scientific公司產品；

紫外凝膠成像儀，Alpha Innotech Corporation公司產品；

蛋白純化用柱子，美國GE公司產品。

還需說明的是，文本簡要期間，下述實施例中未具體描述操作，參考現(xiàn)有技術及相關產品說明書進行操作即可，不再贅述。

實施例1

本實施例僅就新城疫病毒樣顆粒的制備過程簡要介紹如下。

（1）構建穿梭質粒pFastBac-M+HN

第一，提取新城疫病毒株NA-A1的基因組RNA，反轉錄為cDNA；

第二，設計引物，并以第一步中所制備的cDNA為模板進行PCR擴增獲得基質基因M基因序列和血凝素-神經氨酸酶基因HN基因序列，引物序列具體為：

M上游引物5’-ATGGACTCATCTAGGACTATTGGACT-3’，

M下游引物：5’-TTATTTACGGAAGGGGTTGTATTTAGC-3’；

HN上游引物：5’-ATGGACCGCGCCGTGAA-3’，

HN下游引物：5’-TTACACTCTATCGTCCTTCAGAATCT-3’；

第三，將克隆獲得的病毒基質基因M基因序列和血凝素-神經氨酸酶基因HN基因序列分別克隆至T載體中，測序驗證，獲得構建正確的重組克隆質粒pT-M和pT-HN；

第四，先對pT-M和pFastBac Dual質粒分別進行SalI-NotI雙酶切，然后對酶切產物進行檢測鑒定，并分別回收酶切產物；對所回收酶切產物采用T4 DNA連接酶16℃連接過夜，次日轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性菌落并提取質粒備用，所提取質粒命名為pFastBac-M；

第五，將pFastBac-M和pT-HN進行NheI-KpnI雙酶切，然后對酶切產物進行檢測鑒定，并分別回收酶切產物；對所回收酶切產物采用T4 DNA連接酶16℃連接過夜，次日轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑取陽性菌落并提取質粒檢測鑒定，最終所制備質粒命名為pFastBac-M+HN。

整個過程是依次將基質基因M基因序列和血凝素-神經氨酸酶基因HN基因重組至pFastBacDual載體中，最終構建獲得穿梭質粒pFastBac-M+HN。

（2）構建重組桿粒rBacmid-M+HN

將將步驟（1）中構建所得穿梭質粒pFastBac-M+HN轉化Escherichia coli DH10 Bac 感受態(tài)細胞，并進行抗性篩選，最終構建獲得重組桿粒rBacmid-M+HN，具體過程如下：

將步驟（1）中構建所得穿梭質粒pFastBac-M+HN加入Escherichia coli DH10 Bac 感受態(tài)細胞中，輕輕混勻；

在冰上放置30分鐘，接著42℃熱浴90秒，然后立即加入無抗性培養(yǎng)基；

30℃培養(yǎng)箱內震蕩培養(yǎng)3小時，取100 μL轉化液涂布于含有卡那霉素（100μg/mL）、慶大霉素（50μg/mL）、四環(huán)素（70μg/mL）、IPTG（24mg/mL）和X-gal溶液（20mg/mL）的固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)2天，挑取白色單菌落提取桿粒，PCR鑒定獲得重組正確的重組桿粒rBacmid-M+HN；PCR鑒定用引物及PCR程序參考步驟（1）中PCR擴增過程即可。

（3）制備重組桿狀病毒rBV-M+HN

采用脂質體介導轉染法，將步驟（2）中所得重組桿粒rBacmid-M+HN進行轉染（利用Roche公司的X-tremeGENE HP DNA transfection Reagent），具體過程如下：

將轉染試劑恢復室溫，吸取4μL轉染試劑與2μL重組桿粒（用無血清Grace稀釋至2μg/100μL）輕輕混合，室溫孵育30min；

將混合物加入已準備好的昆蟲sf9細胞六孔板；

28℃培養(yǎng)96小時，待細胞病變后，收集細胞上清液即為第一代重組桿狀病毒rBV-M+HN；

將第一代重組桿狀病毒接種昆蟲Sf9細胞，同樣條件培養(yǎng)下，收集第二代重組桿狀病毒；以此類推，收集至第四代重組桿狀病毒；

為便于檢測分析，可將每一代重組桿狀病毒于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

所構建的重組桿狀病毒rBV-M+HN的圖譜結構如圖1所示。

對所收集的含有第四代重組桿狀病毒的上清液，提取病毒基因組DNA，同時進行PCR檢測驗證，以確保重組桿狀病毒構建正確，PCR檢測鑒定時，設計一對通用性引物序列如下：

M13上游引物：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’，

M13下游引物：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’。

PCR驗證結果如圖2所示，對圖2分析可以看出，針對M基因的鑒定條帶為泳道2，約1100bp；針對HN基因的鑒定條帶為泳道3，條帶約為1700bp，分子量結果與理論值相符。

（4）制備并純化獲得新城疫病毒樣顆粒

將步驟（3）中所收集的第四代重組桿狀病毒rBV-M+HN感染懸浮培養(yǎng)的昆蟲Sf9細胞，28℃120r/min搖床培養(yǎng)，感染復數(shù)為5，感染時間為96小時；

培養(yǎng)過程中，病毒結構蛋白在表達后會自行組裝，最終所形成的病毒樣顆粒會分泌到細胞培養(yǎng)上清中；

培養(yǎng)結束后，取培養(yǎng)上清，8000r/min離心30分鐘，初步去除大的細胞碎片；

然后采用不連續(xù)20%-40%-60%蔗糖密度梯度離心，濃縮樣品在20%和40%蔗糖層的中間會形成白色條帶，而桿狀病毒則沉淀于底部，其他小的雜蛋白會停留在頂層，收集白色條帶層，即為病毒樣顆粒。

對所制備的新城疫病毒樣顆粒進行電子透射電鏡觀察，結果如圖3所示，可見病毒粒子具有完整的結構，其表面有明顯的囊膜突起，直徑大小約為100nm左右。

同時，參照國家標準《GB/T 16550-2008 新城疫診斷技術》，對所制備的新城疫病毒樣顆粒進行血凝效價檢測，檢測結果顯示未純化的新城疫病毒樣顆粒血凝效價為2⁷，純化后的新城疫病毒樣顆粒血凝效價為2¹⁰，純化步驟可明顯提高樣品純度以及血凝效價濃度。

需要解釋的是，上述新城疫病毒樣顆粒制備過程中所涉及的新城疫病毒的結構蛋白的編碼基因高度保守（因而相關引物序列具有通用性），可采用多種病毒株進行制備，本實施例僅以特定的新城疫病毒株NA-1為例，對相關制備過程進行介紹，不應理解為本發(fā)明中新城疫病毒樣顆粒制備時必須依賴于特定的病毒株。

實施例2

參考圖5所示構建過程示意圖，本實施例就GM-CSF-GPI蛋白的制備過程簡要介紹如下。

（1）人工合成制備GM-CSF-GPI融合序列

GM-CSF-GPI融合序列如SEQ ID NO.1所示，該序列結構中包括蜂素信號肽序列（用于蛋白的分泌表達）、His標簽序列（用于純化蛋白）、GM-CSF全長序列（主要功能性蛋白）、TEV切割序列（被蛋白酶識別，用于切除His標簽序列）以及GPI信號肽序列（用于將功能性蛋白與細胞膜錨定），委托南京金斯瑞公司將人工合成的序列插入pUC57載體上。

對人工合成制備的的融合序列進行EcoRI和HindIII雙酶切，酶切產物進行電泳，電泳結果如圖4所示，可見泳道有2條明顯條帶，一條約為660bp為人工合成的GM-CSF-GPI融合序列，另一條為約2700bp的pUC57載體序列，與理論值相符。

（2）構建穿梭質粒pFastBac-GM-CSF-GPI

將pFastBac1質粒采用EcoRI和HindIII進行雙酶切，然后將酶切產物與步驟（1）中融合序列的雙酶切產物進行連接，連接時，采用T4 DNA連接酶16℃連接過夜；

次日轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，涂于含有氨芐霉素和慶大霉素（氨芐青霉素終濃度100μg/mL，慶大霉素終濃度100μg/mL）的固體培養(yǎng)基上，挑取陽性菌落并提取質粒備用；

對所提取質粒進行雙酶切鑒定及PCR鑒定，將鑒定正確的穿梭質粒命名為pFastBac-GM-CSF-GPI。

（3）構建重組桿狀病毒rBV-GM-CSF-GPI

將步驟（2）所得穿梭質粒pFastBac-GM-CSF-GPI轉染Escherichia coli DH10 Bac 感受態(tài)細胞，具體過程如下：

將步驟（2）所得穿梭質粒pFastBac-GM-CSF-GPI加入到Escherichia coli DH10 Bac 感受態(tài)細胞中，輕輕混勻；

在冰上放置30分鐘，接著42℃熱浴90秒，然后立即加入無抗性的LB培養(yǎng)基；

在30℃培養(yǎng)箱內震蕩培養(yǎng)3小時后，取100μL涂于含有卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素、IPTG和X-gal溶液（卡那霉素終濃度100μg/mL、慶大霉素終濃度50μg/mL、四環(huán)素終濃度70μg/mL、IPTG終濃度24mg/mL、X-gal終濃度20mg/mL）的固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)2天，挑取白色單菌落提取桿粒，進行PCR鑒定，鑒定正確的命名為重組桿粒rBacmid-GM-CSF-GPI；

利用脂質體介導轉染法（具體過程參考實施例1即可），將重組桿粒rBacmid-GM-CSF-GPI轉染昆蟲Sf9細胞，28℃培養(yǎng)96小時，待細胞病變后，收集細胞上清液即為第一代重組桿狀病毒rBV-GM-CSF-GPI；繼續(xù)將第一代重組桿狀病毒接種昆蟲Sf9細胞，同樣條件培養(yǎng)下，收集第二代重組桿狀病毒，以此類推，收集至第四代獲得重組桿狀病毒rBV-GM-CSF-GPI。

（4）GM-CSF-GPI蛋白的表達與純化

將步驟（3）中所得重組桿狀病毒rBV-GM-CSF-GPI以MOI=1的條件感染昆蟲Sf9細胞，感染3天后，收集培養(yǎng)懸液；

8000轉離心30分鐘，棄上清液，收集細胞沉淀，用PBS（磷酸鹽緩沖液）重懸細胞；

采用超聲破碎的方式裂解細胞，再以8000轉離心30分鐘的條件處理，收集上清液；

對所收集的上清液，采用親和層析技術將含有His標簽蛋白純化收集（具體步驟為：

將上清液調節(jié)至pH8.0并添加終濃度為20mM咪唑，隨后預先處理蛋白純化柱子后，以3滴/10秒的速度使上清液經過蛋白純化柱子，再將PBS液處理蛋白純化柱子以去除未吸附的雜蛋白，配制洗脫液（PBS液基礎上添加終濃度為300mM咪唑）沖洗蛋白純化柱子并收集）；

再進行TEV蛋白酶處理，最后收集的產物即為GM-CSF-GPI錨定蛋白，此時將該蛋白濃度控制在1~5mg/ml，保存于-20℃；

實施例3

在實施例1、2基礎上，本實施例主要介紹嵌合型新城疫病毒樣顆粒的制備工作。

（1）嵌合型新城疫病毒樣顆粒的組裝

將實施例1所制備的新城疫病毒樣顆粒和實施例2所制備的GM-CSF-GPI蛋白，37℃條件下孵育1~3小時，具體為：

10mg/mL濃度的新城疫病毒樣顆粒與1mg/mL濃度的GM-CSF-GPI錨定蛋白分別孵育1小時、2小時、3小時，隨后將孵育的樣品經4℃、100000×g超速離心6小時，收集沉淀即為嵌合型新城疫病毒樣顆粒。

（2）嵌合型新城疫病毒樣顆粒的鑒定

采用Western blot法，分別對上述孵育1小時、2小時、3小時的嵌合型新城疫病毒樣顆粒進行GM-CSF蛋白的特異性鑒定，過程為：

先將樣品進行SDS-PAGE，之后半干轉至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉封閉1小時；

PBS洗滌，加入一抗4℃過夜；

PBS洗滌，加入辣根過氧化物酶標記的二抗孵育1小時；

PBS洗滌，采用BAD溶液進行顯色觀察。

顯色結果如圖6所示，圖中：泳道2為孵育1小時的嵌合型新城疫病毒樣顆粒，泳道3為孵育2小時的嵌合型新城疫病毒樣顆粒，泳道4為孵育3小時的嵌合型新城疫病毒樣顆粒，其中泳道3和泳道4的條帶灰度明顯大于泳道2，說明孵育2小時的嵌合型新城疫病毒樣顆粒即可達到最大載量。

對所制備的嵌合型新城疫病毒樣顆粒顆粒形態(tài)的電子透射電鏡觀察結果如圖7所示，可見有完整的病毒粒子結構，形態(tài)與未嵌合的新城疫病毒樣顆粒（圖3）相似，并且嵌合了GM-CSF-GPI蛋白后不影響其病毒粒子的結構。同時，參照國家標準《GB/T 16550-2008 新城疫診斷技術》，對所制備的嵌合型新城疫病毒樣顆粒進行血凝效價檢測，檢測結果顯示未純化的新城疫病毒樣顆粒血凝效價為2⁷，純化后的新城疫病毒樣顆粒血凝效價為2¹⁰，純化步驟可明顯提高樣品純度以及血凝效價濃度。

實施例4

本實施例主要是對實施例3所制備的嵌合型新城疫病毒樣顆粒作為疫苗使用時的免疫效果進行評價，相關實驗過程簡要介紹如下。

（1）免疫方案

取30只SPF雞，隨機分3組，每組10羽；

新城疫病毒樣顆粒組：新城疫病毒樣顆粒，每羽注射100μL體積，其中包含有30μg的新城疫病毒樣顆粒（根據(jù)實施例1結果，30μg新城疫病毒樣顆粒的血凝效價為2⁹）；

嵌合新城疫病毒樣顆粒組：嵌合新城疫病毒樣顆粒，每羽注射100μL體積，其中包含有30μg的新城疫病毒樣顆粒（根據(jù)實施例3結果，30μg新城疫病毒樣顆粒的血凝效價為2⁹）；

陰性對照組：生理鹽水，100μL/只；

7日齡首免（胸部肌肉注射），14日齡加強免疫一次。

免疫過程中，雞自由飲食。

（2）通過血凝抑制試驗和血清IgG抗體檢測對效價進行評價

從免疫后第一周開始，每隔一周翅下靜脈采血，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參照國家標準《GB/T 16550-2008 新城疫診斷技術》，以新城疫血凝抑制試驗陽性抗原作為檢測抗原，倍比稀釋血清樣品后，加入25μL四單位抗原等體積混合，于37℃作用30分鐘，再加入25μL的1%雞紅細胞，冰上作用30-45分鐘，HI效價為發(fā)生紅細胞完全凝集抑制的最高血清稀釋倍數(shù)。

結果如圖8所示，從圖中可以看出，第3周開始，新城疫病毒樣顆粒組和嵌合新城疫病毒樣顆粒組的血凝抑制效價≥4log2，并且在第3周后，嵌合新城疫病毒樣顆粒組相比于新城疫病毒樣顆粒組血清中HI效價明顯提升。這一結果說明經新城疫病毒樣顆粒和嵌合型新城疫病毒樣顆粒免疫后，能夠刺激機體產生特異性免疫反應。

綜上結果可以看出，實施例3所制備的嵌合型新城疫病毒樣顆粒較原始新城疫病毒樣顆粒具有更好免疫效果，可作為新型高效的疫苗候選，以達到預防禽新城疫的目的。

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林大學

<120> 一種嵌合型新城疫病毒樣顆粒的制備方法

<130> none

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 662

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

gaattcgcca ccatgaaatt cttagtcaac gttgcccttg tttttatggt cgtatacatt 60

tcttacatct atgcggatcg atggggacat caccatcacc atcacgatta cgatatccca 120

acgaccgaaa acctgtattt tcagggcaag ggctctgtcg acatggcacc cacccgctca 180

cccatcactg tcacccggcc ttggaagcat gtagaggcca tcaaagaagc cctgaacctc 240

ctggatgaca tgcctgtcac gttgaatgaa gaggtagaag tcgtctctaa cgagttctcc 300

ttcaagaagc taacatgtgt gcagacccgc ctgaagatat tcgagcaggg tctacggggc 360

aatttcacca aactcaaggg cgccttgaac atgacagcca gctactacca gacatactgc 420

cccccaactc cggaaacgga ctgtgaaaca caagttacca cctatgcgga tttcatagac 480

agccttaaaa cctttctgac tgatatcccc tttgaatgca aaaaaccagg ccaaaaaggt 540

accccaaata aaggcagcgg caccaccagc ggcaccaccc gcctcctgag cggcatgacc 600

tgcttcaccc tgaccggcct gctgggcacc ctggtgacca tgggcctgct gacctgaagc 660

tt 662