本發明屬于分子遺傳學領域，具體涉及與仔豬斷奶重和抗腹瀉病相關的分子標記的制備、檢測方法和應用。

背景技術：

仔豬斷奶重是衡量豬生產性能的重要指標。有研究表明，仔豬斷奶重和其出欄日齡以及日增重顯著相關，隨著仔豬斷奶重的增加，生豬日增重增加、出欄日齡下降。在生豬現代集約化生產中，仔豬腹瀉是仔豬生產中最常見的問題之一，腹瀉會導致仔豬生長發育緩慢，甚至脫水死亡，嚴重制約養豬業的經濟效益。

如何提高仔豬斷奶重，降低仔豬腹瀉發病率一直是困擾養豬業的問題。雖然采用加強飼養管理和疫苗免疫等措施，能在一定程度上提高仔豬斷奶重，降低仔豬腹瀉發病率。但是從遺傳角度出發，采用現代育種技術，選育出抗腹瀉能力強、斷奶重高的仔豬，才能從本質上解決問題。傳統的豬育種方法是通過對目的個體本身、同胞、祖先或后裔進行性能測定來評估個體育種值，這種選擇方法準確性較高，成效顯著，但存在測定成本高、費時耗力、無法進行早期選種等缺點。現在生物技術的飛速發展，使得育種工作者可以開發出針對目標性狀的經濟、快捷、準確的分子標記，進行分子標記輔助選擇，進而加快育種工作。

豬的抗病力性狀和斷奶重都是受多基因控制的復合性狀，目前關于這兩種性狀的分子標記研究已經取得一定的成果，但是獲得的標記數目仍無法滿足豬育種的需要，仍需不斷開發和研制出新的分子標記。白細胞介素6(Interleukin6，IL-6)是具有多種功能的細胞因子，研究發現IL-6可通過不同的信號通路參與多種疾病的發生發展過程。人類醫學研究發現IL-6基因的遺傳變異與炎癥反應綜合癥、冠心病、前列腺癌等疾病的患病風險相關。最近的研究發現，IL-6基因除了在免疫細胞、組織、器官表達外，也在版納微型豬的肌肉組織大量表達，說明該基因在豬肌肉組織發揮重要的生理功能(王配等，2015)。鑒于此，本發明通過尋找豬IL-6基因遺傳變異，提供與仔豬斷奶重和抗腹瀉病相關的分子標記及其檢測方法，并應用于豬育種。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供與仔豬抗腹瀉病和斷奶重相關的分子標記方法并應用于豬育種中。

為了達到上述目的，本發明采用了以下技術手段：

本發明在IL6基因中發現兩個SNP位點，其中，與仔豬斷奶重和抗腹瀉病相關的SNP位點為1753T/C，位于IL6基因序列的第1753個核苷酸處。與仔豬斷奶重相關的SNP位點為3789A/T，位于IL6基因序列的第3789個核苷酸處，所述的IL6基因的Gene bank登錄號為NC_010451.3REGION:complement(101081042..101085451)GPC_000000591(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_010451.3？from＝101081042&to＝101085451&report＝genbank&strand＝true)，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

進一步的，本發明還提出了基于所述的SNP位點開發的分子標記，優選的，所述的分子標記為PCR-RFLP分子標記。

用于將所述的SNP位點轉化為PCR-RFLP分子標記的引物對也在本發明的保護范圍之內，其中用于將所述的1753T/C SNP位點轉化為PCR-RFLP分子標記的引物對序列如下所示：

IL6-3F：5'TGCGAATGGGTTCTGACT 3'；

IL6-3R：5'AATCGCTCTTCCCTCTGG 3'。

用于將3789A/T SNP位點轉化為PCR-RFLP分子標記的引物對序列如下所示：

IL6-5F：5'CAAATGTGAACCTCCTCC 3'，

IL6-5R：5'AACAACCTGGCTCTGAAA 3'。

再進一步的，本發明還提出了所述的SNP位點、分子標記以及引物序列在豬育種中的應用。

更進一步的，本發明提出了一種評價仔豬斷奶重和抗腹瀉病能力的方法，其包括以下步驟：

(1)從豬耳組織中提取基因組DNA；

(2)PCR擴增

以豬基因組DNA為模板，采用以下引物對進行PCR擴增：

IL6-3F：5'TGCGAATGGGTTCTGACT 3'；

IL6-3R：5'AATCGCTCTTCCCTCTGG 3'；

其中，優選的，PCR擴增程序如下：94℃預變性4min；然后94℃變性35s、53℃退火35s、72℃延伸40s，共35個循環；最后72℃延伸8min；

(3)HpaII PCR-RFLP檢測

將步驟(2)擴增得到的產物用HpaII限制性內切酶進行酶切，酶切完畢后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，擴增產物經HpaII酶切后出現3種帶型，分別代表3種不同的基因型：當擴增片段無法被HpaII識別時，記作TT基因型；當擴增片段被HpaII酶切為兩條短片段時，記作CC基因型；當擴增片段被HpaII酶切為三條短片段時，記作TC基因型，在豬育種中，選擇TT和TC基因型個體，淘汰CC基因型個體，可提高豬群的平均斷奶重和抗腹瀉病能力。

以及一種評價仔豬斷奶重的方法，其包括以下步驟：

(1)從豬耳組織中提取基因組DNA；

(2)PCR擴增

以豬基因組DNA為模板，采用以下引物對進行PCR擴增：

IL6-5F：5'CAAATGTGAACCTCCTCC 3'，

IL6-5R：5'AACAACCTGGCTCTGAAA 3'

其中，優選的，PCR擴增程序如下：94℃預變性4min；然后94℃變性35s、50℃退火35s、72℃延伸40s，共35個循環；最后72℃延伸8min；

(3)DraI PCR-RFLP檢測

將步驟(2)擴增得到的產物用DraI限制性內切酶進行酶切，酶切完畢后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，擴增產物經DraI酶切后出現3種帶型，分別代表3種不同的基因型：當擴增片段被DraI酶切為兩條片段別時，記作AA基因型；當擴增片段被DraI酶切為三條片段時，記作TT基因型；當擴增片段被DraI酶切為四條短片段時，記作AT基因型，在豬育種中，選擇AA和AT基因型個體，淘汰TT基因型個體，可提高仔豬群的平均斷奶重。

綜上，本發明在IL6基因中發現兩個與仔豬斷奶重和抗腹瀉病相關SNP位點，其中一個SNP位點為1753T/C，位于IL6基因序列的第1753個核苷酸處，其與仔豬斷奶重和抗腹瀉病相關，當該位點處為T時，仔豬具有較高的斷奶重以及抗腹瀉能力，并且無法被HpaII識別，因此通過PCR-RFLP分子標記技術能夠將仔豬分為三種基因型：TT基因型、TC基因型和CC基因型。在豬育種中，選擇TT和TC基因型個體，淘汰CC基因型個體，可提高豬群的斷奶重和抗腹瀉病能力，在豬育種過程中，有意識地降低CC基因型頻率，對提高豬群的抗腹瀉病、提高仔豬斷奶重而言是個有益的育種措施。

另一個SNP位點為3789A/T，位于IL6基因序列的第3789個核苷酸處，與仔豬斷奶重相關，當該位點處為A時，仔豬具有較高的斷奶重，并且無法被DraI識別，因此通過PCR-RFLP分子標記技術能夠將仔豬分為三種基因型：AA基因型、AT基因型和TT基因型。在豬育種中，淘汰該位點TT基因型個體，可提高仔豬群的平均斷奶重。在豬育種過程中，有意識地降低TT基因型頻率，對提高仔豬斷奶重而言是個有益的育種措施。

附圖說明

圖1為實施例1豬IL6-3引物擴增片段瓊脂糖凝膠電泳圖譜；

其中，M泳道：DNA Marker DL2,000；泳道1為引物擴增片段；

圖2為實施例1豬IL6-5引物擴增片段瓊脂糖凝膠電泳圖譜；

其中，M泳道：DNA Marker DL2,000；泳道1為引物擴增片段；

圖3為本發明豬IL6-3引物擴增序列比對結果和SNP位點顯示；

圖4為本發明豬IL6-5引物擴增序列比對結果和SNP位點顯示；

圖5為實施例2的IL6基因HpaII PCR-RFLP檢測結果；

圖中，M泳道：DNA Marker DL2,000；泳道1為CC基因型；泳道2為TT基因型；泳道3為TC基因型。

圖6為實施例3的IL6基因DraI PCR-RFLP檢測結果。

圖中，M泳道：DNA Marker DL2,000；泳道1為TT基因型；泳道2為AA基因型；泳道3為AT基因型。

具體實施方案

以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。

本發明實施案例中所用的品種資源來源于黑龍江省蘭西縣種豬場。

實施例1：與仔豬抗腹瀉病和斷奶重相關的分子標記的獲得:

1)豬IL6基因的引物設計與部分DNA序列擴增

從NCBI下載豬IL6基因mRNA序列(GeneBank登錄號：NM_214399.1)和基因組序列(GeneBank登錄號：NC_010451.3REGION:complement(101081042..101085451)GPC_000000591，SEQ ID NO.1所示)。將兩序列進行比對，以下載序列為(NC_010451.3REGION:complement(101081042..101085451)GPC_000000591，SEQ ID NO.1所示)模本序列，利用Primer5軟件設計引物IL6-3用于擴增IL6基因部分Inron2、Intron3和完整的Exon3區域，設計引物IL6-5用于擴增IL6基因部分Intron4和部分Exon5區域，所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列如下表1所示：

表1.豬IL6基因擴增引物

2)PCR擴增反應

利用Genomic DNA Kit試劑盒(購自生工生物工程(上海)股份有限公司)從民豬和長白豬耳組織中提取基因組DNA，具體操作方法參照Genomic DNA Kit試劑盒說明書進行。

以民豬和長白豬基因組DNA為模板，利用引物IL6-3和IL6-5分別進行PCR擴增。PCR反應體系為25μL，其中模板DNA為1μL，上下游引物各0.5nmol/μL，PCRmix 12.5μL(寶生物)，加去離子水至總體積25μL。PCR程序如下：94℃預變性4min；然后94℃變性35s、退火35s(IL6-3為53℃，IL6-5為50℃)、72℃延伸40s，共35個循環；最后72℃延伸8min。PCR的擴增產物經1.2％的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。IL6-3引物擴增片段為698bp(圖1以及SEQ ID NO.2所示)，IL6-5引物的擴增片段為565bp(圖2以及SEQ ID NO.3所示)。

3)PCR產物純化、測序和序列比對

IL6-3和IL6-5引物擴增產物經1.2％瓊脂糖電泳分離后切取目的條帶，使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京天根)純化PCR產物，并送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。利用ClusterW軟件進行多重序列比對，檢索IL6-3和IL6-5引物擴增片段內的核苷酸突變位點。IL6-3引物擴增片段為698bp，共存在3處核苷酸突變，其中位于該片段302bp處的T/C變異(NC_010451.3序列1753bp處)引起了HpaII酶切位點(C↓CGG)的變化(圖3)。IL6-5引物擴增片段為565bp，存在1處核苷酸突變，位于該片段64bp處的A/T變異(NC_010451.3序列3789bp處)引起了DraI酶切位點(TTT↓AAA)的變化(圖4)。

實施例2：HpaII位點的檢測方法，其步驟如下:

1)引物序列

用于PCR擴增的引物為IL6-3引物，引物序列如下

IL6-3F:5'TGCGAATGGGTTCTGACT 3'；

IL6-3R:5'AATCGCTCTTCCCTCTGG 3'

2)PCR反應條件

利用IL6-3引物在豬基因組DNA中進行擴增，PCR反應體系為25μL，其中模板DNA為1μL，上下游引物各0.5nmol/μL，PCRmix 12.5μL(寶生物)，加去離子水至總體積25μL。PCR程序如下：94℃預變性4min；然后94℃變性35s、53℃退火35s、72℃延伸40s，共35個循環；最后72℃延伸8min。

3)HpaII PCR-RFLP檢測

PCR產物酶切反應總體系為10μl，其中PCR產物8.5μl，0.5μl(10U/μl)HpaII內切酶，10×buffer為1μl。將樣品混勻后離心，37℃水浴鍋內放5h，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，記錄基因型，在紫外燈下拍照(圖5)。在序列302bp處存在SNP突變，該突變產生HpaII酶切位點。如圖5所示，IL6-3引物擴增產物經HpaII酶切后出現3種帶型，分別代表3種不同的基因型。其中，1泳道為TC基因型(698bp，397bp和301bp)；2泳道為TT基因型(698bp)；3泳道為CC基因型(397bp和301bp)，4泳道為DL2000Marker；

實施例3：DraI位點的檢測方法，其步驟如下：

1)引物序列

用于PCR擴增的引物為IL6-5引物，引物序列如下

IL6-5F:5'CAAATGTGAACCTCCTCC 3'

IL6-5R:5'AACAACCTGGCTCTGAAA 3'

2)PCR反應

利用IL6-5引物在豬基因組DNA中進行擴增，PCR反應體系為25μL，其中模板DNA為1μL，上下游引物各0.5nmol/μL，PCRmix 12.5μL(寶生物)，加去離子水至總體積25μL。PCR程序如下：94℃預變性4min；然后94℃變性35s、50℃退火35s、72℃延伸40s，共35個循環；最后72℃延伸8min。

3)DraI PCR-RFLP檢測

PCR產物酶切反應總體系為10μl，其中PCR產物8.5μl，0.5μl(10U/μl)DraI內切酶，10×buffer為1μl。將樣品混勻后離心，37℃水浴鍋內放5h，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，記錄基因型，在紫外燈下拍照(圖6)。

IL6-5引物566bp的擴增序列中存在兩個DraI酶切位點，一個固有酶切位點位于413bp處，另外一個由于64bp處SNP突變產生的酶切位點。

如圖6所示，IL6-5引物擴增產物經DraI酶切后出現3種帶型，分別代表3種不同的基因型。其中，1泳道為AT基因型(415bp，351bp，151bp和64bp)；2泳道為AA基因型(415bp和151bp)；3泳道為TT基因型(351bp，151bp和64bp)，1泳道為DL2000Marker。

實施例4本發明的分子標記在群體多態性檢測中的應用：

本實施案例的民豬和長白豬試驗群體來自黑龍江省蘭西縣種豬場。在民豬和長白豬群體中，利用HpaII PCR-RFLP技術檢測SNP(302C/T)位點的基因頻率和基因型頻率；由表2可見，該位點在民豬群體中存在三種基因型，其中TT型個體為68個，TC型個體為176個，CC型個體為37個，T等位基因頻率為0.56。在長白豬群體中也檢測到三種基因型，其中TT型個體為8個，TC型個體為50個，CC型個體為47個，T等位基因頻率為0.31(表2)，說明本發明的檢測方法可用于群體遺傳學分析。

表2 IL6基因HpaII位點在不同豬種基因型頻率和等位基因頻率

在民豬和長白豬群體中，利用DraI PCR-RFLP技術檢測SNP(64bp T/A)位點的基因頻率和基因型頻率；由表3可見，該位點在民豬群體中存在三種基因型，其中AA型個體為52個，AT型個體為129個，TT型個體為32個，A等位基因頻率為0.55。在長白豬群體中也檢測到三種基因型，其中AA型個體為8個，AT型個體為49個，TT型個體為43個，A等位基因頻率為0.33(表3)，說明本發明的檢測方法可用于群體遺傳學分析。

表3 IL6基因DraI位點在不同豬種基因型頻率和等位基因頻率

實施例5：本發明的分子標記在仔豬腹瀉和斷奶重關聯分析中的應用

本實施案例的試驗豬群來自黑龍江省蘭西縣種豬場。以2013年秋季同期出生的民豬哺乳仔豬為試驗材料。所有試驗動物在相同條件下按常規生產要求飼養管理與防疫。仔豬出生至35日齡斷奶，每天早上和下午各一次觀察各圈舍內仔豬的排糞情況，并逐頭檢查肛門有無紅腫和糞便污染以及豬圈內仔豬糞便狀況，然后進行仔豬腹瀉評分并記錄，評分標準如下：糞便外觀呈條狀或粒狀，為正常腹瀉，評分為0；糞便外觀呈軟便、能成形，為輕度腹瀉，評分為1；糞便外觀呈稠狀糞水無分離現象、稀便，為中度腹瀉，評分為2；糞便外觀呈液體、不成形、糞水分離，粘液便或膿便，為重度腹瀉，評分為3。腹瀉指數為仔豬出生開始至35日齡糞便狀況評分之和。在試驗期間，同時稱量仔豬的初生重、7日齡重、14日齡重、21日齡重、28日齡重和35日齡斷奶重，并進行記錄。

發明人采用實施例1所建立的HpaII PCR-RFLP技術和DraI PCR-RFLP技術分別在民豬群體中進行多態性檢測，并分析兩種分子標記與仔豬腹瀉指數和部分生長性狀的相關性。采用SAS統計軟件(SAS Institute Inc,Version 8.0)GLM程序進行單標記方差分析，所采用模型為：

Yi＝μ+Gi+ei

其中Yi為性狀表型值，μ為平均值，Gi為基因型效應；ei為殘差效應。

民豬群體中HpaII位點不同基因型與仔豬腹瀉指數和部分生長性狀的關聯分析結果見表4?？梢钥闯觯琀paII基因型不同時，CC型個體的腹瀉指數顯著高于TT型個體(P<0.05)，CC型個體的7日齡體重、14日齡體重、21日齡體重、28日齡體重和35日齡斷奶體重均顯著低于TC型個體(P<0.05)，CC型個體的21日齡體重也顯著低于TT型個體(P<0.05)，因此，在育種過程中淘汰CC基因型個體可以提高仔豬群體平均抗腹瀉能力和斷奶體重。

民豬群體中DraI位點不同基因型與仔豬腹瀉指數和部分生長性狀的關聯分析結果見表5?？梢钥闯?，DraI基因型不同時，TT型個體的14日齡體重顯著低于AA型個體(P<0.05)，TT型個體的21日齡體重顯著低于AA型和AT型個體(P<0.05)，TT型個體的28日齡體重和35日齡體重均顯著低于AT型個體(P<0.05)。因此，在育種過程中淘汰TT基因型個體可以提高仔豬群體平均斷奶體重。

表4 IL6基因HpaII位點與民豬仔豬腹瀉指數和生產性狀的關聯分析表

表5 IL6基因DraI位點與民豬仔豬腹瀉指數和生產性狀的關聯分析表

注：以上數值為最小二乘均值±標準誤，數值上標的字母不同時，大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

序列表

<110> 東北農業大學

<120> 與仔豬斷奶重和抗腹瀉病相關的分子標記及其在豬育種中的應用

<130> KLPI161390

<160> 3

<170>PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 4410

<212> DNA

<213> Sus scrofa

<400> 1

cagtctgccc tcgagcccac caggaacgaa agagagctcc atctgccctc caggaaccca 60

gctatgaact ccctctccac aagtaagtga aggaaatccc tagccttgga actgcctggc 120

agccgtgcct ggcgagggag ggggtgtgta tccgctgctg cgagagctgg cgggcggcca 180

gcagccagaa gcacagctcc cccagtggtg cagtctgctc actggctgct ctcccttccc 240

tccggcacag gcgccttcag tccagtcgcc ttctccctgg ggctgcttct ggtgatggct 300

actgccttcc ctaccccggg acgcctggaa gaagatgcca aaggtgatgc cacctcagac 360

aaaatgctct tcacctctcc ggacaaaact gaagaactca ttaagtacat cctcggcaaa 420

atctctgcaa tgagaaagga ggtgggtagg ctcgcctgag ggagatgaag ggcccctgta 480

ggtggtcatc tcctcggcct tggatgtgaa cagcggctcc tgcttttggt ggggagggga 540

aggtctttgc tgggttctgg gacagcttcg atctgaagcc aaaggggcag gctgtgtttt 600

ttaatttctc ctctgctgct ggtctcaggt agttcctttt cctccgggga aaatatactg 660

cggggctgga atccatgcct caagtctcat tcgcatttcc atgcttggca tgagctgaga 720

gtcacactca ctgcctctca ggatttcctc ttctctaacc aaaaaataag gcctgtcaat 780

cttctttgcg ttccttggac ttggggggag catttaaaag caccactgaa atgactgttc 840

agcttctcag gacagtcact gtacttttag attacgccag ctcagtggtt agggactccc 900

cagagtcatt ccggcaaata agatgcatac ctgacagccc accaaagtgg caaaatccta 960

ggtaggttaa agcagctccc aagcttaaaa tgtaagggag tttggctctg tttggtagaa 1020

aggaaagaac acaggagagg agattgggag cctcaaattt ggttctgatc tgttgaacct 1080

gctttgtgat ctcgggcaaa ttccctacca cctgtgcgcc ccatctgcaa aattatggat 1140

ttagactaga tgatctgaaa ggctcttcca gctggcacat tctatggctc aaattatact 1200

cacccaatta tcatcaaaat tcctgtcatt tattaaggat ccactatgtg ccaggcactt 1260

tacagataaa tattatatta agatataaat attatatctt atcctcacag taaacttaca 1320

agggaggtgt ttcattatcc ccaactagga gagttagggg cactgagact tggaataggt 1380

aatatgcctg aaggcagagg ggaggtcaga atggaaccca ggggtgccca ttctccactt 1440

gtttgcctgg atgcgaatgg gttctgactc cacttttctt agagaacttc ctggccatgg 1500

tagatcatga atcagccctc tagtggtgtt cgttttggga gcacttatat gataacagct 1560

ctaatactct ttcccagatg tgtgagaagt atgagaagtg tgaaaacagc aaggaggtac 1620

tggcagaaaa caacctgaac cttccaaaaa tggcagaaaa agacggatgc ttccaatctg 1680

ggttcaatca ggtatggatg cattacattc acttttagct gctccccagt ccaaagttct 1740

tcttcttata accggtgtct gtacacatgt agaccaagca ggcatcaaaa gtaggggaga 1800

aatgtgaaga acatcaggta aatttcctga ggaggccaac ttaaatgtta ttaaaggcaa 1860

cttatttttg aatgacctgg tcagaggtag ctcctcggtg ttgggatttt cacagctgtc 1920

aaaggggtta gaacagccca caggtttagc tagttcatcc tgggtgtgat ggtccaggga 1980

ggtttatcct ccttggttgc ctgtagcagg atccagtcct aatctcccca ctgagaaagt 2040

tctctgcacc ctctccctcc agacagtgag ataacctgct tattccataa aacgaggttt 2100

cagtccaacc gtggcaaagg catgagggca gccagaggga agagcgattc agaggaagga 2160

tatttgccac agtctagcat ctgtggggct ttgggtaaaa tgaagtggtg cctctgcact 2220

gatcacatgt tttaaatggg gctgctgatg ctgtctgatg tctcaaagca tgatccctaa 2280

gaagtatttg aggctccctg gagcgacaca gggagaagtt gttgaattat ggcagtttta 2340

acttttaaaa tcacttatgt cttcctagca ataaccaatc ttcccaccat ctttcctctt 2400

aggagacctg cttgatgaga atcaccaccg gtcttgtgga gtttcagata tacctggact 2460

acctccagaa agagtatgag agcaataagg gaaatgtcga ggctgtgcag attagtacca 2520

aagcactgat ccagaccctg aggcaaaagg tgagtctcct tgtcccctca cttggcgcaa 2580

agaagtcagc ctagacaacc cgactgtgca aagtcaattc taagagatgg ccgcatgcaa 2640

gaaaagggtc taagtacttc ctgacagtta aaacttttgc tttttggttc ttttctgcaa 2700

aaggcatcaa taactatatt taaaactctg ttaaatgggg tgggttttaa tatcaacttt 2760

taaaagcttg aggaataagc aaaaaaaaaa tctgaagagg cagaagaaaa cacacccaat 2820

cctgcttagt gatccgtaat aacaaagaac agagagcaca aaaattatat tcatgttgcc 2880

aagtgacatt cttgttatta cagtagtttc cactcctttc ccttaatctt ttgccagcag 2940

agttaatgct gaaaaatggc taaaggctgg aagagcagta cttacaagtt ttggtcacta 3000

ccagctggcc actcaaacgc cacatggtag gggcttgatg gcacagggtg tggatgagcc 3060

ccagcaccaa cagaagggtc ctggttggag aagtgggcac atgggtgcta atcctgcctc 3120

tccctttttt tagccgtttg ccttaaatca ggcctgctcc cacattaatg tgcacatgag 3180

tttccctggg ggatcttgtt acaatgtgaa gtctgattca gtaggtctgg ggtgagacct 3240

gagactcata tttctaacaa gctcctcatg atgctgaggc tgcagtgttc caggatcacc 3300

cttagagggg caaggccttt cacaattact tggccccatg tcagtggttc tacaaaaaat 3360

actcccagcc tccttatact atcagagcag ttgactctta atagatgctg tatggatggt 3420

tgagagggaa accagagaca agtaattagg gttagagggc cctgaagaac ttattaaaaa 3480

cggctttaag taaaagttct tcatttatct actgaattcc aactatgtgc caggcattcc 3540

ttaggataac agaaaacaag taaggtacta tggctgccca cggatgctca atggcctaac 3600

agagatgggc agcaaaggga tgtgtagagc tcagttgcta tgggagagct gcaggctggg 3660

tgggctcaga ggagaggcac ctccccctgt ctgggcgagt cacagcccca gttcacacct 3720

tcccccaaat gtgaacctcc tcccacaggc cagagcatcc ctccactgca gaggattcat 3780

tcaatattta aacaattatt tgtgttttct tttcccttca gggaaagaat ccagacaaag 3840

ccaccacccc taaccccacc acaaatgccg gcctgctgga taagctgcag tcacagaacg 3900

agtggatgaa gaacacaaag atcattctca tcctgcgcag ccttgaggat ttcctgcagt 3960

tcagcctgag ggccattcgg ataatgtagc tggggcacct gagattgatg ccgtccacgg 4020

gcattccctc ctctggtcag aaacctgtcc actgggcaca taacttatgt tgttctctat 4080

gaagaactaa aagtatgagc gttaggacac tattttaatt attttaattt attgatattt 4140

aaatatgtga tgtcgagtta atttatataa gtgatagata tttatatttt tattaagtgc 4200

cacttgaaat attttatgta tttgttttga aaaagtaacg taaaatggct acacggcttg 4260

aagatccttg ttgtttcaga gccaggttgt ttcttggagt gtgtaggctt acctcaaata 4320

aattgctaac ttatacgtat ttttaaaaga aatatttata ttgtatttat ataaagttta 4380

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caaatgtgaa cctcctccca caggccagag catccctcca ctgcagagga ttcattcaat 60

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