本發明屬于畜牧業動物營養技術研究領域，涉及一種以丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌為飼料添加劑的飼料配方，更具體的說是一種提高斷奶仔豬腸道上皮細胞因子表達，促進腸道黏膜發育和調節血清炎癥因子含量等方面的應用。
背景技術：
保障仔豬健康、提高其抗病力等方面一直是近年來豬營養與飼料研究領域的熱點和難點，飼料添加劑的研究正在向著無殘留、無耐藥性和對人類健康和環境無危害的方向發展。飼料添加劑丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌因為其特有的多能性、益生作用及不易產生耐藥性等優點在動物生產中被廣泛應用。
嗜酸乳桿菌主要存在小腸中，釋放乳酸、乙酸和一些對有害菌起作用的抗生素，抑制腸道不良微生物飼喂增殖，但是益菌作用比較弱。嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌聯用可以迅速使腸道內的菌群恢復平衡，抑制腐敗菌繁殖。而丁酸梭菌可以維持或恢復宿主腸道優勢菌群，促進腸道乳酸菌、雙歧桿菌等益生菌的生長繁殖，并抑制沙門氏菌、大腸桿菌等有害菌的生長。
抗生素類生長促進劑是通過干擾細胞壁的結構物質肽聚糖的生物合成從而抑制細菌的繁殖，但其在飼料工業中的大量使用導致諸多問題出現，如病原菌產生耐藥性、動物免疫機能下降、體內菌群失調、畜禽產品中的藥物殘留等。而丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌作為外源益生菌，在維持腸上皮的完整性、促進動物腸道發育方面發揮著重要作用。丁酸梭菌具有耐熱、耐酸和耐多種抗生素等生物學特性，嗜酸乳桿菌適合在動物腸道生存，對腸道致病菌產生拮抗作用，二者可共同調節腸道微生態平衡、產生益生物質、提高機體免疫力及促進動物生長，同時具有無污染、無有害殘留等特點，逐漸成為熱門的抗生素替代品之一。目前國內外研究結果表明：在動物日糧中單獨添加一定量丁酸梭菌或單獨添加一定量的嗜酸乳桿菌可以增加胃腸道有益菌數量，改善小腸形態，提高動物免疫力，從而提高動物的抗病力。查閱近年來文獻表明：斷奶仔豬營養一直是豬營養領域的研究熱點和難點，仔豬抗病力這一領域的創新性有待于提高。通過丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌調節機體的腸上皮細胞因子表達、腸道形態發育等功能，我們研究了一種斷奶仔豬抗病飼糧組方，以此來改善仔豬腸道發育和抗病力的營養調控，在一定程度上提高養殖業的經濟效益。
技術實現要素：
本發明的一個目的是公開了一種斷奶仔豬抗病飼糧的組方及應用。
本發明的另一個目的是公開了所配制的飼糧對斷奶仔豬腸上皮細胞NLRPs表達、腸道黏膜發育和血清炎癥因子含量的應用效果。
為實現上述目的，本發明公開了如下的技術內容
一種調節斷奶仔豬抗病力的飼糧，其特征在于在飼料原料中使用丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌飼料添加劑，進行合理配制日糧，由下述重量份數的原料組成：
玉米58-63豆粕16-24全脂奶粉2-5
魚粉4-9小麥麩1-5葡萄糖1-3
酸化劑0.1-0.5 磷酸氫鈣0.5-1.5石粉0.5-1.1
食鹽0.1-0.5 L-賴氨酸鹽酸鹽0.3-0.7DL-蛋氨酸0.2-0.7
蘇氨酸0.2-0.6 仔豬預混料1-4
丁酸梭菌添加劑0.001-0.01（凍干粉中活菌含量為1×109CFU/g，飼糧中濃度為1×104~1×105CFU/g）
嗜酸乳桿菌添加劑0.001-0.01（凍干粉中活菌含量為1×109CFU/g，飼糧中濃度為1×104~1×105CFU/g）；
其中所述的仔豬預混料是指每千克預混料中含有：14,600 mg鐵，630 mg銅，410 mg 錳，10,400 mg鋅，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg煙酸，8 mg生物素。
本發明所述酸化劑指的是上海美農飼料有限公司產品，主要成分是乳酸、正磷酸、檸檬酸、富馬酸、甲酸。
本發明所述的斷奶仔豬配合飼料的制備方法：將玉米、豆粕兩種原料粉碎，其他原料均不需要粉碎，按照重量比例分別進行稱量，在小型混合機中混勻即可。
本發明一個優選的配方（重量份數）：
玉米60豆粕19全脂奶粉4
魚粉6小麥麩2.5葡萄糖3
酸化劑0.4 磷酸氫鈣1.2石粉0.5
食鹽0.3 L-賴氨酸鹽酸鹽0.4 DL-蛋氨酸0.4
蘇氨酸0.3 仔豬預混料2
丁酸梭菌添加劑0.001（飼糧中丁酸梭菌濃度為1 × 104 CFU/g）
嗜酸乳桿菌添加劑0.001（飼糧中嗜酸乳桿菌濃度為1 × 104 CFU/g）；
其中所述的仔豬預混料是指每千克預混料中含有：14,600 mg鐵，630 mg銅，410 mg 錳，10,400 mg鋅，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg煙酸，8 mg生物素。
本發明另一個優選的配方（重量份數）：：
玉米59.5豆粕18.5全脂奶粉3.48
魚粉6小麥麩5葡萄糖3
酸化劑0.4 磷酸氫鈣1.3石粉0.7
食鹽0.4L賴氨酸鹽酸鹽0.3 DL-蛋氨酸0.2
蘇氨酸0.2 仔豬預混料1
丁酸梭菌添加劑0.01（飼糧中丁酸梭菌濃度為1 × 105 CFU/g）
嗜酸乳桿菌添加劑0.01（飼糧中嗜酸乳桿菌濃度為1 × 105 CFU/g）；
其中所述的仔豬預混料是指每千克預混料中含有：14,600 mg鐵，630 mg銅，410 mg 錳，10,400 mg鋅，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg煙酸，8 mg生物素。
本發明在斷奶仔豬飼料中添加丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌能顯著提高空腸NLRPs的相對表達，顯著提高空腸中段和回腸各腸段絨毛高度，顯著降低十二指腸、空腸中段和回腸隱窩深度；降低了血清中IL-1β因子含量，提高了血清中IL-10因子含量，從而提高仔豬抗病力。
本發明的斷奶仔豬抗病飼糧組方試驗結果表明：
（1）日糧中添加丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌，顯著提高了空腸中NLRPs的表達，表明該飼料配方能有效增加有益菌的數量，提高腸道黏膜屏障功能；
（2）日糧中添加丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌顯著提高了十二指腸、空腸中段和回腸各腸段絨毛高度，顯著降低了十二指腸和回腸隱窩深度，并提高了絨毛高度與隱窩深度的比值，表明這種飼料配方能促進斷奶仔豬腸道健康發育，利于營養物質的吸收。
（3）日糧中添加丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌降低了血清中促炎因子IL-1β的含量，提高了抗炎因子IL-10的含量。
為了更進一步說明本發明的積極效果，提供如下的試驗：
1．試驗動物及分組
采用單因子試驗設計，選取體重6.97 ± 0.48 kg的健康“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬48頭，隨機分為2個處理，每個處理分為4個重復，每個重復6頭豬。每個處理組分別飼喂不同日糧：飼喂基礎日糧(NC)、飼喂基礎日糧+0.01%丁酸梭菌（濃度為1 × 105 CFU/g）+0.01%嗜酸乳桿菌（濃度為1 × 105 CFU/g）（試驗組）。丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌為市售產品。
2．基礎飼糧配方及營養水平
根據NRC（1998）配制豬基礎日糧配方及營養水平如表1所示；
表1 基礎飼糧組成及營養水平（飼喂基礎）
a 每千克預混料中含有：14,600 mg鐵，630 mg銅，410 mg 錳，10,400 mg鋅，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg煙酸，8 mg生物素。
b 根據NRC（1998）飼料成分表計算。
3．試驗規程
試驗在一個商品萬頭豬場進行，試驗期28天。飼喂、管理、免疫按豬場規定程序進行。飼喂4周后，從每個處理的每個重復組中隨機選取3頭斷奶仔豬采血、屠宰，取十二指腸、空腸中段和回腸，進行腸上皮細胞NLRPs表達分析、并制作組織切片分析腸絨毛高度和隱窩深度的生長情況。整個試驗過程中觀察仔豬的健康狀況，記錄死、淘仔豬以及腹瀉、用藥情況。
4．測定指標
空腸上皮細胞NLRPs表達和血清指標測定：試驗結束后，從每個重復中隨機選3頭仔豬，用真空促凝管進行采血，前腔靜脈采血后處死，無菌條件下迅速打開腹腔，分離并采集空腸中段5 cm左右腸管，用PBS沖洗后分裝于凍存管中于-80 ℃保存，用于NLRP3、NLRP6和NLRP12的測定。采用ELISA試劑盒測定血清中促炎因子IL-1β和抗炎因子IL-10的含量；
小腸黏膜形態的測定：于十二指腸、空腸中段和回腸切取1cm腸斷，用生理鹽水沖洗后迅速放入預先配制好的福爾馬林溶液中固定。按常規方法制作石蠟切片，蘇木精-伊紅染色，測量絨毛高度和隱窩深度。
5．統計分析
采用SAS統計軟件下的Compare Means模塊中的One-Way ANOVA進行方差分析，并采用Duncan’s多重比較進行組間差異顯著性檢驗，P<0.05為差異顯著。
本發明公開的斷奶仔豬抗病飼糧組方在斷奶仔豬飼料中的應用效果，主要包括：
（1）腸道上皮細胞NLRPs的表達：
由表2可知，試驗組極顯著（P <0.01）提高了空腸上皮細胞NLRP12的相對表達，顯著（P<0.05）提高了NLRP3和NLRP6的相對表達；
表2 對空腸上皮細胞中NLRPs表達的影響
注：同行肩注小寫字母不同表示差異顯著P <0.05，肩注大寫字母不同表示差異極顯著P <0.01，無肩注字母表示差異不顯著P >0.05。**表示P <0.01。下表同。
（2）小腸發育：
由表3可知，絨毛高度：試驗組的十二指腸和空腸絨毛高度極顯著高于對照組（P ＜0.01），試驗組回腸絨毛高度比對照組提高了6.84%；隱窩深度：試驗組的十二指腸和空腸隱窩深度均顯著低于對照組（P ＜0.05），試驗組回腸隱窩深度比對照組降低了16.67%；絨毛高度/隱窩深度：試驗組十二指腸絨毛高度/隱窩深度比極顯著（P ＜0.01）高于對照組、試驗組空腸和回腸絨毛高度/隱窩深度比顯著（P ＜0.05）高于對照組；
表3 對仔豬小腸發育的影響
注：同行肩注小寫字母不同表示差異顯著P <0.05，肩注大寫字母不同表示差異極顯著P <0.01，無肩注字母表示差異不顯著P >0.05。**表示P <0.01。
（3）血清因子含量：
由表4可知，試驗組的促炎因子IL-1β含量降低了5.95%，抗炎因子IL-10含量提高了21.78%；
表4 對仔豬血清細胞因子含量的影響
試驗結果表明：
（1）日糧中添加丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌，極顯著（P <0.01）提高了空腸上皮細胞NLRP12的相對表達，顯著（P <0.05）提高了NLRP3和NLRP6的相對表達，表明該飼糧組方能有效增加腸道黏膜屏障功能。
（2）日糧中添加丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌，極顯著提高了十二指腸和空腸中段絨毛高度，顯著降低了十二指腸和空腸中段隱窩深度。并且試驗組中的絨毛高度與隱窩深度的比值比對照組均顯著提高，表明該飼糧組方能促進斷奶仔豬腸道健康發育，利于營養物質的吸收。
（3）日糧中添加丁酸梭菌（濃度為1 × 105 CFU/g）和嗜酸乳桿菌（濃度為1 × 105CFU/g）（菌濃度比1:1）降低了血清中促炎因子IL-1β含量，提高了抗炎因子IL-10含量，表明該飼糧組方能有效幫助益生菌順利定居腸道，增強機體免疫力。
本發明對以丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌為飼料添加劑的飼料配方進行了安全性和生長性能實驗，其方法如下：
（1）步驟：
材料和方法：選擇6.59±0.61 kg斷奶的“杜×長×大”仔豬168頭，臨床健康、發育正常，按隨機區組設計分為7個處理，每個處理4個重復，每個重復6頭仔豬，飼養于專用代謝籠中，試驗期4周。7個處理組分別飼喂：
1）對照組：基礎飼糧（不含菌）；
2）試驗2組：基礎飼糧＋0.001丁酸梭菌添加劑（濃度為1 × 104 CFU/g）；
3）試驗3組：基礎飼糧＋0.001嗜酸乳桿菌添加劑（濃度為1 × 104 CFU/g）；
4）試驗4組：基礎飼糧＋0.0005丁酸梭菌添加劑（濃度為0.5 × 104 CFU/g）＋0.0005嗜酸乳桿菌添加劑（濃度為0.5 × 104 CFU/g）；
5）試驗5組：基礎飼糧＋0.001丁酸梭菌添加劑（濃度為1 × 104 CFU/g）＋嗜酸乳桿菌添加劑0.001（濃度為1 × 104 CFU/g）；
6）試驗6組：基礎飼糧＋0.01丁酸梭菌添加劑（濃度為1 × 105 CFU/g）＋0.01嗜酸乳桿菌添加劑（濃度為1 × 105 CFU/g）；
7）試驗7組：基礎飼糧＋0.015丁酸梭菌添加劑（濃度為1.5 × 105 CFU/g）＋0.015嗜酸乳桿菌添加劑（濃度為1.5 × 105 CFU/g）。試驗期內隨時觀察中毒表現及死亡情況。
（2）飼喂的仔豬基礎飼料原料組成：
包括玉米62.66、豆粕19、全脂奶粉2.7、魚粉6、小麥麩3、葡萄糖2、酸化劑0.3、磷酸氫鈣0.6、石粉0.6、食鹽0.3、L-賴氨酸鹽酸鹽0.3、DL-蛋氨酸0.3、蘇氨酸0.2、仔豬預混料2。
結果：給斷奶仔豬飼喂上述試驗飼糧，連續飼喂28天，未見明顯中毒現象，觀察期內無死亡，隨機尸檢第7組中一頭仔豬，各主要臟器未見明顯異常。生長性能結果見表5；
表5不同劑量的丁酸梭菌對斷奶仔豬生長性能的影響
注：同行之間肩注，無字母或小寫字母相同表示差異不顯著（P＞0.05），小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。下表同。
結論：
1)由此可知，與對照組相比，除試驗2和試驗3組外，試驗組均顯著提高了仔豬平均日增重（ADG）（P＜0.05），但試驗2組和試驗3組的ADG和ADFI均比對照組有所提高，F/G均比對照組有所下降，因此，添加丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌是能促進生長性能的，但是兩菌單獨在飼糧中為濃度為1 × 104 CFU/g時效果不顯著（P＞0.05）；
2)組合總添加量與各菌單獨添加量相同，試驗4組兩菌的組合ADG和ADFI顯著（P＜0.05）優于試驗2組和試驗3組，F/G低于試驗2組和試驗3組，由此表明，組合效果優于單獨添加，但飼糧中濃度分別為0.5 × 104 CFU/g時還不是最優組合；
3)試驗5組、試驗6組、試驗7組的F/G均顯著高于試驗4組（P＜0.05），試驗5組和試驗7組生長性能差異不顯著（P＞0.05），因此在飼糧中丁酸梭菌濃度為1 × 104 CFU/g~1.5 × 105 CFU/g＋飼糧中嗜酸乳桿菌濃度為1 × 104 CFU/g~1.5 × 105 CFU/g時均可顯著提高仔豬生長性能；
4)試驗6組：基礎飼糧＋0.01丁酸梭菌添加劑（濃度為1 × 105 CFU/g）＋0.01嗜酸乳桿菌添加劑（濃度為1 × 105 CFU/g）的料重比（F/G）顯著（P＜0.05）低于其它各組，因此，綜合考慮飼喂效果和成本因素，此組為最佳添加量。
⑤因此，此組方給出的丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌添加量范圍均為0.001~0.01（飼糧中濃度為1 × 104 CFU/g~1 × 105 CFU/g）。
具體實施方式
通過以下實施例對本發明作一步說明，但不作為本發明的限制。本發明的實施例中所述的重量份數原料指的是克、公斤或噸，可根據生產實際的需要加以調整。本發明所用到的各種原料例如：玉米、豆粕、全脂奶粉、小麥麩、磷酸氫鈣、石粉、食鹽、L-賴氨酸鹽酸鹽、DL-蛋氨酸、蘇氨酸、酸化劑、預混料、丁酸梭菌、嗜酸乳桿菌等對外均有售；其中下面的產品均有市售：
酸化劑指的是上海美農飼料有限公司產品；
全脂奶粉指的是湖南百宜飼料科技有限公司；
1-4%仔豬預混料和豆粕購買于正大預混料（天津）有限公司；
丁酸梭菌添加劑指的是鄭州金百合生物工程有限公司產品；
嗜酸乳桿菌添加劑指的是武漢遠城科技發展有限公司產品；
玉米指的是天津玉米世紀科技有限公司產品；
魚粉指的是進口秘魯魚粉；
小麥麩和葡萄糖指的是天津市鼎圣飼料有限公司產品。
實施例1
斷奶仔豬的配合飼料原料組成：
包括玉米61.59、豆粕20、全脂奶粉2.5、魚粉6、小麥麩2、葡萄糖3、酸化劑0.4、磷酸氫鈣0.7、石粉0.7、食鹽0.3、L-賴氨酸鹽酸鹽0.4、DL-蛋氨酸0.2、蘇氨酸0.2、仔豬預混料2、丁酸梭菌0.01（飼糧中濃度為1 × 105 CFU/g）、嗜酸乳桿菌0.001（飼糧中濃度為1 × 104 CFU/g）。其中所述的仔豬預混料是指每千克預混料中含有：14,600 mg鐵，630 mg銅，410 mg 錳，10,400 mg鋅，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg煙酸，8 mg生物素。
制備方法：將玉米、豆粕兩種原料粉碎，其他原料均不需要粉碎，按照重量比例分別進行稱量，在小型混合機中混勻即可。
實施例2
斷奶仔豬的抗病配合飼料原料組成：
包括玉米60、豆粕19.49、全脂奶粉4、魚粉6、小麥麩3.9、葡萄糖3、酸化劑0.3、磷酸氫鈣0.7、石粉0.6、食鹽0.3、L-賴氨酸鹽酸鹽0.3、DL-蛋氨酸0.2、蘇氨酸0.2、仔豬預混料1、丁酸梭菌0.001（飼糧中濃度為1×104CFU/g）、嗜酸乳桿菌0.01（飼糧中濃度為1×105CFU/g）。
其中所述的仔豬預混料是指每千克預混料中含有：14,600 mg鐵，630 mg銅，410 mg 錳，10,400 mg鋅，15,000μg碘，17,000μg硒，227,600 IU VA，22,800 IU VD3，1,100 mg VE，30 mg VK3，700 mg VB2，200 mg VB6，1,340 mg泛酸，2,300 mg煙酸，8 mg生物素。
制備方法：將玉米、豆粕兩種原料粉碎，其他原料均不需要粉碎，按照重量比例分別進行稱量，在小型混合機中混勻即可。
實施例3
一種斷奶仔豬的抗病配合飼料由下述重量份數的原料組成：
包括玉米58、豆粕21、全脂奶粉3.08、魚粉5、小麥麩4、葡萄糖3、酸化劑0.4、磷酸氫鈣0.7、石粉0.7、食鹽0.4、L-賴氨酸鹽酸鹽0.3、DL-蛋氨酸0.2、蘇氨酸0.2、仔豬預混料3、丁酸梭菌0.01（飼糧中濃度為1×105CFU/g）、嗜酸乳桿菌0.01（飼糧中濃度為1×105CFU/g）。
制備方法：將玉米、豆粕兩種原料粉碎，其他原料均不需要粉碎，按照重量比例分別進行稱量，在小型混合機中混勻即可。
實施例4
采用斷奶仔豬的配合飼料飼喂斷奶仔豬的方法：
此系列配方適用斷奶仔豬，適用期為30~45天，根據情況讓仔豬自由采食即可，必須提供充足的飲水，其他按正常的飼養管理進行。
實施例5
比較試驗
常規的仔豬飼料：
方法：配制玉米-豆粕型仔豬飼糧，不添加丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌。選擇4頭7±0.52 kg仔豬，試驗期28天。試驗結束后對4頭仔豬進行屠宰，取十二指腸、空腸和回腸。
步驟：采用HE染色，測定十二指腸、空腸和回腸絨毛高度和隱窩深度。
結果：三個腸段絨毛高度分別為314μm、325μm、226μm；隱窩深度分別為399μm、287μm、193μm。
日糧中添加丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌后飼料：
方法：配制玉米-豆粕型仔豬日糧，添加0.01%丁酸梭菌和0.01%嗜酸乳桿菌。選擇4頭7.02±0.62kg仔豬，試驗期28天。試驗結束后對4頭仔豬進行屠宰，取十二指腸、空腸和回腸。
步驟：采用HE染色，測定十二指腸、空腸和回腸絨毛高度和隱窩深度。
結果：十二指腸、空腸和回腸絨毛高度分別為384μm、358μm、279μm；隱窩深度分別為286μm、241μm、172μm。
結論：日糧中添加丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌能提高仔豬小腸絨毛長度、降低隱窩深度。通過比較試驗說明：日糧中添加丁酸梭菌和嗜酸乳桿菌能調節仔豬腸道發育，提高仔豬抗病力。