本發明屬于基因工程領域，公開了小麥-簇毛麥易位系6VS/6AL南農9918中一個NLR類基因NLR1-V及其表達載體和應用。
背景技術：
：：小麥(Triticumaestivum)的整個生育期受到多種病蟲的危害，其中由小麥白粉病菌(Blurmeriagraminisf.sp.tritici，Bgt)侵染引起的小麥白粉病是小麥最嚴重的真菌病害之一。由于小麥白粉病菌生理小種多、毒力變異快，一旦產生新的毒性小種或小種種群發生變化，會導致小麥白粉病的大爆發，給農業生產帶來災難性后果。廣譜、持久抗病基因的發掘和利用對白粉病防治具有重要意義。簇毛麥(Haynaldiavillosa，2n＝2x＝14，VV)攜帶的抗白粉病基因Pm21對小麥白粉病具有廣譜、高抗特性，該基因定位于6V染色體短臂上。南京農業大學細胞遺傳研究所利用四倍體圓錐小麥與二倍體簇毛麥雜交，再與普通小麥回交多代后，選育出了普通小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系，將含有Pm21基因的6VS導入普通小麥。普通小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系自1994年進入國內育種利用以來，在白粉病常發區進行了多年種植，對白粉病表現出了廣譜、高抗特性，以之為親本已經選育出一批高抗白粉病的小麥新品種，南農9918即選育出的其中一個品種，Pm21在育種中得到廣泛應用。分析Pm21介導的廣譜抗性機理和克隆其候選基因對于利用基因工程手段培育具有白粉病廣譜抗性的小麥品種具有重要意義。技術實現要素：本發明的目的是針對現有技術的上述缺陷，提供一個NLR類基因NLR1-V的表達載體和應用。本發明的目的可通過如下技術方案實現：NLR類基因NLR1-V來自普通小麥(TriticumasetivumL.)南農9918，其核苷酸序列為SEQIDNO.1。該NLR類基因NLR1-V的蛋白質為NLR1-V，其氨基酸序列為SEQIDNO.2。含有所述的NLR類基因NLR1-V的重組表達載體pBI220:NLR1-V。所述的NLR類基因NLR1-V的重組表達載體優選以pBI220為出發載體，將NLR1-V基因插入pBI220的BamHI和StuI酶切位點間所得。所述的NLR類基因NLR1-V的表達載體在構建抗白粉病小麥品種中的應用。有益效果：本發明從小麥-簇毛麥易位系6VS/6AL南農9918的6VS染色體臂上克隆獲得小麥中克隆得到了一個NLR類基因NLR1-V及其所編碼的蛋白質NLR1-V，將其插入表達載體pBI220，得到的該基因的過量表達載體導入感病小麥品種中，可以提高感白粉病小麥品種對白粉病的抗性。NLR1-V的超量表達載體用于基因工程育種，將其導入易感白粉病小麥品種中，能夠獲得具備白粉病抗性的小麥種質。附圖說明圖1NLR1-V在抗白粉病南農9918中受白粉菌誘導表達圖2pBI220:NLR1-V超量表達載體圖譜圖3與白粉菌互作的表達GUS基因的表皮細胞A圖:白粉菌侵入GUS表達的表皮細胞后未形成吸器；B圖:白粉菌侵入GUS表達的表皮細胞后形成吸器；其中，co:分生孢子；pp:侵入釘；ha:吸器；hy:菌絲圖4利用瞬間表達研究NLR1-V基因對吸器形成的影響和抗白粉病效應具體實施方式實施例1小麥-簇毛麥易位系6VS/6AL南農9918中一個NLR類基因NLR1-V的克隆小麥-簇毛麥易位系6VS/6AL南農9918是南京農業大學細胞遺傳所育成的含有廣譜抗白粉病基因Pm21的小麥品種(公知公用，陳佩度，張守忠，王秀娥，王蘇玲，周波，馮祎高，劉大鈞.抗白粉病高產小麥新品種南農9918.南京農業大學學報,2002,25(4):1438-1444)。前期已經在南農9918的6VS上開發了多個6VS的轉化序列，進一步利用小片段插入易位系NAU418將Pm21限定在6EST258和CINAU15之間，并且在Pm21所在染色體區間還有6EST243和6EST238兩個標記(公知公用，Radiation-inducedtranslocationswithreducedHaynaldiavillosachromatinatthePm21locusforpowderymildewresistanceinwheat.Molecularbreeding,2013,31:477–484)。將6EST258、CINAU15、6EST243、6EST238序列與水稻(http://rice.plantbiology.msu.edu)、大麥(http://webblast.ipk-gatersleben.de/barley/viroblast.php)、短柄草(http://plants.ensembl.org/Brachypodium_distachyon/Info/Index)的序列數據庫進行Blastn比對分析，分別提取出水稻、大麥、短柄草中位于6EST258和CINAU15所在染色體區間的序列。根據其中一個大麥的序列設計引物，在南農9918受白粉菌誘導的cDNA樣品中進行擴增，獲得NLR1-V全長序列。cDNA樣品準備及擴增流程如下：具體流程如下：(1)將抗白粉病小麥南農9918的種子播于培養皿中發芽，露白后移栽到盆缽，一葉期把從感白粉病小麥材料上搜集的白粉菌孢子接種到苗上進行誘導，并于接種不同時間段取樣(0h,1h,6h,12h,24h)，分別提取RNA(用Invitrogen公司的Trizol試劑提取)，并且反轉錄成cDNA樣品(用Takara公司的AMV反轉錄酶反轉)。(2)以南農9918經白粉菌誘導24小麥的cDNA為模板，以NLR1-V基因引物P1(ATTGAGATGTCTGCACCGGTCGT,SEQIDNO.3)和P2(CTCTCTTCGTTACATAATGTAGTGCC,SEQIDNO.4)為引物進行RT-PCR，獲得NLR1-V基因的cDNA全長片段。對該基因片段進行測序和比對，發現該基因為一個NLR類基因，命名為NLR1-V。對NLR1-V進行生物信息學分析，發現ORF(開放閱讀框)2730bp，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，編碼909個氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。實施例2NLR類基因NLR1-V在小麥-簇毛麥易位系6VS/6AL南農9918中受白粉菌誘導表達以小麥-簇毛麥易位系6VS/6AL南農9918受白粉菌誘導不同時間段的cDNA樣品為模板，以根據NLR1-V設計的引物P3(ACGGGCTTATTCCAAGTCCT,SEQIDNO.5)和P4(ACGCTTCTGAAGGCAGACTC，SEQIDNO.6)為引物進行Q-PCR分析。PCR程序為：PCR反應在實時熒光定量PCR儀(MyIQ，Bio-Rad公司，美國)上擴增并檢測熒光。20uLPCR反應體系中含2×SYBRGreenPCRMasterMix10uL，0.5μM引物P3和P4，反轉錄cDNA模板2uL。擴增參數為：95℃10分鐘，然后95℃15秒、60℃30秒，72℃1分鐘，共40個循環。反應結束后，進行熔解曲線的測定。檢測基因表達水平用MyiQ系統軟件進行分析。結果表明：在南農9918中，NLR1-V在小麥-簇毛麥易位系6VS/6AL南農9918受白粉菌誘導上調表達，12h小時表達水平最高，24h后表達水平開始下降(圖1)。實施例3NLR1-V基因瞬間表達載體的構建以經白粉菌誘導的南農9918中克隆的NLR1-V基因cDNA為模板，使用引物對NLR1-V-BamHI-F(GGAGAGAACACGGGGGATCCATGTCTGCACCGGTCGTCAG，SEQIDNO.7)和NLR1-V-StuI-R(AACGTCGTATGGGTAAGGCCTTTAAAGTAAAACTGGGACCACATTCATAG，SEQIDNO.8)進行PCR擴增，回收擴增片段。用BamHI和StuI對擴增產物進行雙酶切，將酶切產物插入到BamHI和StuI雙酶切后的載體pBI220(JeffersonRA,KavanaghTA,BevanMW.GUSfusions:beta-glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplants.EMBOJ.1987,6:3901-3907.)，將NLR1-V置于35S啟動子后面的多克隆位點處。由此將目標基因NLR1-V克隆到強啟動子35S的下游，獲得表達載體pBI220:NLR1-V(圖1)。經測序驗證，表明載體構建成功。實施例4利用瞬間表達方法將NLR1-V基因轉入小麥葉片瞬間表達方法是一種可靠且快速鑒定基因功能的方法(Schweizer,Pokornyetal.ATransientAssaySystemfortheFunctionalAssessmentofDefense-RelatedGenesinWheatMolecularPlant-MicrobeInteractions.1999,12:647-654.)。本研究利用瞬間表達方法，將質粒DNA包裹到金屬微粒外層，借助基因槍將金屬微粒和基因轟擊到小麥葉片的表皮細胞，然后統計轟擊NLR1-V細胞的白粉菌吸器指數與未轟擊NLR1-V細胞的白粉菌吸器指數，明確目標基因是否具有白粉病抗病功能。載體DNA與金屬微粒包裹的程序如下：制備鎢粉：稱取30mg的鎢粉于1.5mleppendorf管中，加入1ml70％酒精，渦旋3-5min后靜置15min，使鎢粉完全沉淀。12000rpm離心1min后棄上清。加入1mlddH2O水，渦旋混勻后，離心棄上清(重復三次)。最后加入500μl50％甘油渦旋混勻，以備用。包裹子彈：吸取5μl渦旋均勻的鎢粉于1.5ml的eppendorf管中，加入5μl質粒DNA(總量應為1μg)。邊渦旋邊向eppendorf管內滴加50μl2.5MCaCl2，然后加入20μl0.1M亞精氨(現配先用)，渦旋3min。靜置1min后離心2s，棄上清。加入140μl70％酒精，充分渦旋，離心2s，棄上清。然后加入140μl100％酒精，充分渦旋，離心2s，棄上清。最后加入15μl100％酒精，充分渦旋，以備使用。實施GUS基因單轉化時，將含有GUS基因表達載體pAHC25(ChristensenAH,QuailPH.Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch,1996,5:213-218.)的質粒DNA與鎢粉包裹；當實施NLR1-V與GUS基因共轉化時，將含有NLR1-V基因表達載體pBI220:NLR1-V的質粒DNA與含有GUS基因表達載體pAHC25的質粒DNA按摩爾濃度1:1的比例混合，包裹鎢粉。當GUS基因與NLR1-V基因進行共轉化時，Marker基因GUS轉入的細胞也是NLR1-V轉入的細胞。因GUS基因表達的細胞經染色整個細胞呈現藍色，所以本研究以藍色細胞作為NLR1-V的表達細胞?；驑屴Z擊程序如下：剪下長約6cm的小麥幼苗葉片端部，平行貼在載玻片上，每張玻片貼6片葉片左右。基因槍使用PDS1000/He系統，采用1350psi的可裂膜片，真空度為28inHg。轟擊后將葉片置于墊有潤濕濾紙的瓷盤內，罩以打有小孔的保鮮膜，保濕并透氣，18-20℃恢復培養4h后，高密度接種白粉菌分生孢子。接種48h后用GUS染液(配方為：0.1mol/LNa2HPO4/NaH2PO4緩沖液(pH7.0)，含10mmol/LEDTA，5mmol/L鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀，0.1mg/mlX-Gluc，0.1％TritonX-100，20％甲醇)真空滲透10min,37℃染色12h，然后用70％酒精脫色2天直至葉片變成白色為止，最后利用濃度為0.6％的考馬斯亮藍對白粉菌孢子染色。實施例5NLR1-V抗病功能的分析白粉菌侵入小麥葉片表皮細胞后，在表皮細胞中產生的指狀物稱為吸器。吸器不能正常產生是葉片細胞對白粉菌具有抗性的重要指標。在GUS表達的細胞中，吸器會被GUS染色液染成藍色，在顯微鏡下容易辨認(圖3)。在GUS基因轉化細胞后，通過統計與白粉菌互作的GUS表達細胞中，吸器形成的細胞所占的比例(％)，即為“吸器指數”(Schweizer,Pokornyetal.ATransientAssaySystemfortheFunctionalAssessmentofDefense-RelatedGenesinWheatMolecularPlant-MicrobeInteractions.1999,12:647-654.)。吸器指數越小，表明抗病性越強。本研究利用“吸器指數”作為抗病強弱的衡量指標。當單轉化GUS基因時，感病小麥揚麥158的吸器指數為41.33％(統計了675個互作細胞)，當GUS基因與NLR1-V共轉化感病小麥揚麥158后，統計了GUS基因表達(即NLR1-V表達)且有白粉菌互作的細胞的吸器指數，結果表明當NLR1-V轉入后，揚麥158的吸器指數從41.33％降到19.23％(統計了603個細胞)(圖4)。該結果說明，NLR1-V能顯著降低吸器指數，對白粉菌具有抗病作用。<110>南京農業大學<120>一個NLR類基因NLR1-V及其表達載體和應用<160>8<210>1<211>2730<212>DNA<213>普通小麥（TriticumasetivumL.）南農9918<220><223>NLR1-V<400>1atgtctgcaccggtcgtcagcgccaccatgggggcgatgaaccccctcatcggcaagctc60gccgcactgattggtgacgagtacaagaaactcacaggggtgaggagacaggcctccttc120ctcaaggatgagcttagcgccatgaaagctctccttgagaagcttgagctcatggatgaa180ctggatcccttggccaagaactggagggattatgtccgggagatgtcctacgacatggag240aattgcattgatgacttcatgcgagaccttggaggtgccgatgcaaagacgggctttatc300aagaagacggctaaacgtctcaagacgttgcggaagcgtcatcgtattgctgatcggatg360gaagagctcaaggggcttgctttgcaagcaaatgaacgacgcatgaggtacaagattgat420gattgcgccaattctaccaatcgtgtcgttcccatcgatactcggatgttggcaatctac480aagcaggcaacggggcttgttggtattgatggcccaaagaaagagcttgtaagttggttg540acagatactcaggaaaaactcaaggtggtggctattgttggatttggaggccttggtaaa600actacacttgccaaacaagtatatgatacgattggagggcaattcagctgtaaaatattt660ttctctgtttctcaaagacctgatatgtcaagcctccttcgtggtctccaatcggagctt720aatatggaagaggagttaactcagcctcacgaggtgcaacacatcattggccgtcttaga780gaatatctcacacataagaggtaccttattgttgttgatgacttgtggtatcaatcaaca840tggaatatcatgagttgtatctttccagaagtcgggaatggaagtagagtaatagtaact900acacgagtggaggatgtggctatttgggcatgtcgtgatgaccatgagtgtgtttataga960atggaacccctcaaagaacaagactcaagaatgctgttctgtaatagagtatttggttcc1020ggatatgcctgtccactgccgttaaaaaaagtttcagatgaaattttgaagaagtgtgga1080gggttgccacttgcaattatcactatagctagtctattagcaagtcgtcaagcaagatca1140gacgagtgggagagcataagaaattgtttgggcgctaagcttgccataaattccaccttg1200gaagagatgaggagtatactgaaccttagctacatgcatcttcctcttcatctccgtcca1260tgtctcctgtactttggcatgtatccagaagacaaaattatcaggaggcgtgacatggtt1320ctacagtgggtagccgaaggctttgtcaataattctcatggatctaatctagaggatgtt1380gcagagagttatttcaatgagcttatcaatagaagtctaattcagcctggagaatccata1440gatggaaagattgagtcttacaaagtacacgatatgatgcttgatttgatcctcagcaag1500tgtgcagaaaataattttataagtgtggcatataattgtgaagacgtggcaagaatgcat1560ggccgcgaatacaaggtccgtagattgtccttgacttcaagtgctaacgatgcaacatca1620gaaaacattcatactagcatgcaacaaattcgctcattttcatgctttggagagcctaaa1680tacacacctcctcttttgctatttaaataccttcgggtgctagtgtttatatcctcagac1740gcgtttggtccgatagtggaccttactgctattggtcaattgtttcagctaaggtatgtc1800aaggtttctgcttcatacggaatagattttcctaccgaatttcgcaagcttgttcatttg1860gagacgctggaagtatctggtttttcaccaagcatcccgtcagatattgtttgcttgcca1920cggttatctcgtctgatccttccgtgtcttacacgtcttcctcaagggattgccaacata1980aaatcattgcgtgcattgcactgtatggagcacatctcgctagaggatattaatggcctt2040ggcgagctgaccagtctgagggagctgaggctttacactaaaatggtggcgggtgaagtt2100gatgctttggtatccctaattggaaagctccatgacctaaaatacctcgcggtctctgtt2160gagtcttctaaacatcattgcgacccgttgtactcattatcaaaccctcctctccatatc2220gaggaacttgatctgtacgggtggacactgaagagagttcccacatggattggtgacctc2280catttccttcggatcctggatttgtgtgtctacaacttgttgaacgacgaggttcatgtt2340gtgggaaatcttccctgcctcgtccatctgcgtctaagggtgttcgctgaaggcggggcc2400gtaatctgcacgggcttattccaagtcctgaaagtccttcgtctcttctctcatgatgtg2460gaagacatgcagtttcagatagggctaatgcccagcctgcgacagctcactctagaagta2520aataatggctggggtggtgctgtgcctcgaggcatggagcacctattggccctcgatcac2580atctctgtatttgccagacgcggcgtcaatcaccgtgatgtcgagtctgccttcagaagc2640gtcttcgatgtgcacccaagacaaccttccttagaaataatacctgatgttcccctcagt2700tctatgaatgtggtcccagttttactttaa2730<210>2<211>909<212>PRT<213>普通小麥（TriticumasetivumL.）南農9918<220><223>蛋白NLR1-V<400>2MetSerAlaProValValSerAlaThrMetGlyAlaMetAsnProLeu151015IleGlyLysLeuAlaAlaLeuIleGlyAspGluTyrLysLysLeuThr202530GlyValArgArgGlnAlaSerPheLeuLysAspGluLeuSerAlaMet354045LysAlaLeuLeuGluLysLeuGluLeuMetAspGluLeuAspProLeu505560AlaLysAsnTrpArgAspTyrValArgGluMetSerTyrAspMetGlu65707580AsnCysIleAspAspPheMetArgAspLeuGlyGlyAlaAspAlaLys859095ThrGlyPheIleLysLysThrAlaLysArgLeuLysThrLeuArgLys100105110ArgHisArgIleAlaAspArgMetGluGluLeuLysGlyLeuAlaLeu115120125GlnAlaAsnGluArgArgMetArgTyrLysIleAspAspCysAlaAsn130135140SerThrAsnArgValValProIleAspThrArgMetLeuAlaIleTyr145150155160LysGlnAlaThrGlyLeuValGlyIleAspGlyProLysLysGluLeu165170175ValSerTrpLeuThrAspThrGlnGluLysLeuLysValValAlaIle180185190ValGlyPheGlyGlyLeuGlyLysThrThrLeuAlaLysGlnValTyr195200205AspThrIleGlyGlyGlnPheSerCysLysIlePhePheSerValSer210215220GlnArgProAspMetSerSerLeuLeuArgGlyLeuGlnSerGluLeu225230235240AsnMetGluGluGluLeuThrGlnProHisGluValGlnHisIleIle245250255GlyArgLeuArgGluTyrLeuThrHisLysArgTyrLeuIleValVal260265270AspAspLeuTrpTyrGlnSerThrTrpAsnIleMetSerCysIlePhe275280285ProGluValGlyAsnGlySerArgValIleValThrThrArgValGlu290295300AspValAlaIleTrpAlaCysArgAspAspHisGluCysValTyrArg305310315320MetGluProLeuLysGluGlnAspSerArgMetLeuPheCysAsnArg325330335ValPheGlySerGlyTyrAlaCysProLeuProLeuLysLysValSer340345350AspGluIleLeuLysLysCysGlyGlyLeuProLeuAlaIleIleThr355360365IleAlaSerLeuLeuAlaSerArgGlnAlaArgSerAspGluTrpGlu370375380SerIleArgAsnCysLeuGlyAlaLysLeuAlaIleAsnSerThrLeu385390395400GluGluMetArgSerIleLe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