本發明涉及生物醫藥技術領域，涉及肽聚糖識別蛋白-SA的結構及其獲得方法、新的生理功能以及在生物醫藥領域中的應用。具體地說，本發明涉及肽聚糖識別蛋白-SA及其類似物、活性片段的結構及其制備生產方法與功能，以及其在微生物及其相關分子模式檢測診斷、促進昆蟲血淋巴黑色素產生、誘導昆蟲合成抗菌肽等生物醫藥領域中的應用，制備肽聚糖識別蛋白-SA及其類似物或活性片段抗體及其在生物醫藥領域的應用。

背景技術：
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肽聚糖識別蛋白(Peptidoglycan recognition protein，PGRP)是一種能夠特異性識別微生物細胞壁表面多糖類病原相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMPs)，并能夠進一步激活宿主體內的免疫分子，引起免疫應答的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRRs)。PGRP家族(PGRP family)成員眾多，并且成員之間分子量差異較大，在組織細胞中所處位置也不盡相同。根據分子量大小不同，PGRP一般分為兩種類型，短型類免疫球蛋白(PGRP-S)和長型肽聚糖識別蛋白(PGRP-L)。PGRP-S含有信號肽，是一類小分子(18-20KD)的胞外蛋白。PGRP-L存在形式比較多樣，可以是胞內蛋白，或胞外蛋白，或是跨膜蛋白，其基因要比PGRP-S復雜。

1996年，日本科學家Ashida在家蠶體內發現了一種對肽聚糖(Peptideglycan，PGN)具有高度親和力，并能夠介導PGN依賴的酚氧化酶原級聯反應(Prophenoloxidase Cascade)從而使局部傷口愈合或黑化的19kDa蛋白質，命名為肽聚糖識別蛋白。此后，研究者們先后在蛾、果蠅、大鼠、小鼠及人類等生物當中得到PGRP的基因和蛋白，并對它們的功能和結構有了進一步的發現。PGRPs的空間結構具有高度保守性，均由3個外圍的α螺旋(α1～α3)和5個中心的β折疊片組成，其中4個平行β折疊片(β3，β4，β6和β7)，1個反平行β折疊片(β5)，在空間上形成一個非常對稱的花籃狀結構。大多數PGRPs在PGRP結構域中部都具有兩個空間位置相近并且保守的半胱氨酸(Cys)殘基，它們可以形成二硫鍵，這是PGRPs活性所必須的。所有的具有酰胺酶活性的PGRPs都具有保守的Zn²⁺結合位點。對PGRPs功能的研究在昆蟲、貝類、哺乳動物等生物中普遍展開，隨著研究的深入，研究者發現PGRPs能夠特異性識別PGN，這種特異性識別作用能夠啟動下游信號通路，有些成員還具有酰胺酶活力，甚至還可作為效應分子殺死或抑制外源微生物。

綜上所述，肽聚糖識別蛋白是為數不多的從低等動物到高等動物都非常保守的模式識別蛋白。作為模式識別受體，PGRP可以識別PGN，有些成員還具有酰胺酶活力。

目前尚未見對鱗翅目(Lepidoptera)的天(大)蠶蛾科昆蟲肽聚糖識別蛋白的結構、制備、模式識別學功能及其應用的相關研究。

技術實現要素：
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本發明所解決的技術問題是提供一系列肽聚糖識別蛋白-SA及其制備方法。

所述的肽聚糖識別蛋白-SA的氨基酸序列如SEQ ID：1所示；

編碼所述肽聚糖識別蛋白-SA的氨基酸序列的基因序列如SEQ ID：2所示。

本發明還提供了所述天然肽聚糖識別蛋白-SA、重組肽聚糖識別蛋白-SA或其類似物或活性片段。

所述的肽聚糖識別蛋白-SA類似物或活性片段包括SEQ ID：1或SEQ ID：2所述的序列。

所述的肽聚糖識別蛋白-SA類似物或活性片段的序列如SEQ ID：3-16所示。

本發明進一步提供了所述天然肽聚糖識別蛋白-SA，重組肽聚糖識別蛋白-SA及其類似物或活性片段，以天然肽聚糖識別蛋白-SA、重組肽聚糖識別蛋白-SA及其類似物或活性片段作為抗原的抗體在生物領域中的應用，包括1.針對微生物的預防、檢測診斷、治療等生物醫藥領域應用；2.針對微生物相關分子模式的預防、檢測診斷、治療等生物醫藥領域應用；3.針對天然肽聚糖識別蛋白-SA、重組肽聚糖識別蛋白-SA、重組肽聚糖識別蛋白-SA類似物或活性片段的檢測與追蹤等生物醫藥領域應用；4.誘導昆蟲抗菌肽合成及其獲得的抗菌肽在生物醫藥領域應用。

本發明是針對鱗翅目的天(大)蠶蛾科昆蟲體內的PGRP-SA，研究天然PGRP-SA的制備方法、一級結構(基因和蛋白質)、生物學功能以及其應用，利用基因工程技術獲得重組PGRP-SA及其類似物或活性片段以及其生物學功能和應用。此外，利用天然、重組PGRP-SA及其類似物或活性片段作為抗原，刺激機體產生抗體，同時研究了該抗體的應用。

本發明是通過如下技術方案實現的：

首先利用蛋白提取、分離、純化技術，從鱗翅目天(大)蠶蛾科昆蟲中分離、純化獲得天然PGRP-SA。其次，利用蛋白質化學技術以及分子生物學技術，解析PGRP-SA的一級結構(基因和蛋白質)并獲得其基因。再次，利用基因工程技術，實現PGRP-SA基因在宿主細胞的表達，結合蛋白提取、分離、純化技術獲得重組PGRP-SA。同時，利用基因重組技術，獲得PGRP-SA的類似物或部分片段。天然、重組PGRP-SA以及其類似物或部分片段，能特異性識別脂多糖、β-1,3-葡聚糖、肽聚糖、脂磷壁酸、甘露聚糖等多種微生物相關分子模式以及細菌、真菌等微生物。上述結合，一方面激活昆蟲體液免疫中的酚氧化酶原激活系統，另一方面激活昆蟲細胞免疫，誘導抗菌肽的合成。本發明的天然、重組PGRP-SA以及其類似物或部分片段以及其抗體的生物學功能，可廣泛應用于針對微生物的預防、檢測診斷、治療等生物醫藥領域；同時，利用本發明的天然、重組PGRP-SA以及其類似物或部分片段誘導昆蟲大量表達抗菌肽，由此制備獲得的抗菌肽可應用于微生物的預防、檢測診斷、治療等生物醫藥領域。

本發明的PGRP-SA，其氨基酸序列如SEQ ID：1所示。

其制備方法如下：

一、天然PGRP-SA的制備

本發明所獲得天然PGRP-SA是通過如下技術方案實現的，包括：

以昆蟲血淋巴作為原料，分別通過親和層析、疏水層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、鹽析、超濾或上述方法的不同組合，分離純化得到不同純度乃至電泳純或HPLC純的PGRP-SA。

其中，昆蟲血淋巴(簡稱血淋巴)，是昆蟲血液(或血細胞裂解物)和淋巴液的混合物或/和昆蟲壓榨或勻漿的體液，用緩沖溶液或酸性溶液或堿性溶液溶解提取，離心除去不溶雜質得到的抽提液。

PGRP-SA的提取、分離、純化體系基本條件的特征：(1)溶液的酸堿度在pH2～pH10，優選pH4-pH9；(2)調節溶液酸堿度的化學試劑是常規、通用的酸或堿及其溶液。酸及其溶液優選HCl、HAc、磷酸、檸檬酸、硫酸、硼酸。堿及其溶液優選NaOH、KOH、Tris、檸檬酸鈉或鉀鹽、磷酸鈉或鉀鹽、硼砂；(3)緩沖液是常規、通用緩沖離子對緩沖液，優選檸檬酸根緩沖離子對、HCl-Tris緩沖離子對、檸檬酸根-磷酸根緩沖離子對、磷酸根緩沖離子對、醋酸根緩沖離子對、硼酸根緩沖離子對、硼酸-Tris緩沖離子對、上述各緩沖離子的組合；(4)溶液或緩沖液的離子強度在0.001mol/L～0.8mol/L，優選0.01mol/L～0.3mol/L。上述條件既不破壞提取、分離、純化所采用介質的理化性質，又不影響PGRP-SA的生物活性。

昆蟲血淋巴的收集：將昆蟲用蒸餾水或去離子水反復清洗，采用常規方法，如蠟盤法、離心法、背血管取血法、灌注法、壓榨、勻漿法、反射流血法、撕裂法、切割法、剪開法、穿刺法等，在10℃至～5℃條件下收集昆蟲血淋巴。

本發明的分離分析方法包含如下中的兩種或兩種以上的組合：

1.離子交換層析分離純化PGRP-SA

取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按PGRP-SA提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調pH至要求條件范圍下。將處理好的樣品上樣于預先用緩沖液平衡好的離子交換層析，先用緩沖液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白。洗脫方式，可以采用鹽濃度階段方式，分別用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L鹽溶液進行階段洗脫；也可以采用鹽濃度梯度方式，梯度為0.00mol/L～3mol/L。利用抗PGRP-SA抗體檢測目的蛋白的存在情況，將含有PGRP-SA的洗脫液合并儲存備用；也可以采用常規、通用透析或超濾方法，除去洗脫合并液的鹽，或再進一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲存上述樣品溶液備用。

離子交換層析分離純化的特征：(1)層析介質選擇陽離子交換層析填料，如CM-離子交換層析填料或SP-離子交換層析填料或S-離子交換層析填料等陽離子交換層析填料，此時緩沖液酸堿度選擇在pH2-pH7；(2)層析介質選擇陰離子交換層析填料，如Q-離子交換層析填料或DEAE-離子交換層析填料或QAE-離子交換層析填料等離子交換層析填料，此時緩沖液酸堿度選擇在pH7-pH12；(3)緩沖液及其濃度選擇，按上述PGRP-SA提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征；(4)洗脫的鹽溶液可以選擇要求濃度的緩沖液或在緩沖液中加中性鹽到需要的濃度；(5)中性鹽選擇(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄或NaCl或KCl，優選NaCl；(6)分離純化操作溫度按上述PGRP-SA提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征。上述條件既不影響PGRP-SA的生物活性，又不影響活性成分的分離純化。

2.親和層析分離純化PGRP-SA

取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按PGRP-SA提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調pH至PGRP-SA的提取、分離、純化體系基本條件特征的要求條件范圍內。將處理好的樣品液上樣于預先用緩沖液平衡好的親和層析，先用緩沖液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白。洗脫方式，可以采用鹽(或化學試劑)濃度梯度(0.0mol/L～3.0mol/L或0.0mol/L～6.0mol/L或0.0mol/L～8.0mol/L)方式洗脫；也可以采用鹽(或化學試劑)階段濃度洗脫方式，分別采用0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L、1mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L、7mol/L、8mol/L鹽溶液進行階段方式洗脫。利用抗PGRP-SA抗體檢測目的蛋白的存在情況，將含有PGRP-SA的洗脫液合并儲存備用；也可以采用常規、通用透析或超濾方法，除去洗脫合并液的鹽(或化學試劑)或再進一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲存上述樣品溶液備用。

親和層析分離純化的特征：(1)親和填料的配基選擇PGRP-SA抗體、肝素、刀豆素、甲醛固定后的細菌或真菌、絲氨酸蛋白酶抑制劑(如苯甲咪)、sepharose CL-4B、甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖胺、肽聚糖、脂磷壁酸、脂多糖、葡聚糖等；(2)分離純化操作溫度、緩沖液、酸堿度選擇，是按PGRP-SA提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征；(3)洗脫的鹽(或化學試劑)溶液可以選擇要求濃度的緩沖液或在緩沖液中加鹽(或化學試劑)到需要的濃度；(4)洗脫用鹽(或化學試劑)可以選擇(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄或NaCl或KCl或尿素或鹽酸胍；(5)洗脫用鹽(或化學試劑)選擇(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄或NaCl或KCl的最高濃度為3.0mol/L，選擇尿素的最高濃度為8.0mol/L，選擇鹽酸胍的最高濃度為6.0mol/L；(6)如果洗脫用鹽(或化學試劑)選擇了尿素或鹽酸胍而使PGRP-SA發生變性作用，可以通過常規、通用的蛋白質復性方法進行復性而獲得PGRP-SA。

3.疏水層析分離純化PGRP-SA

取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按PGRP-SA提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調pH至PGRP-SA的提取、分離、純化體系基本條件特征的要求條件范圍內。加中性鹽至2mol/L濃度，上樣于預先用2mol/L中性鹽-緩沖液溶液平衡的疏水層析柱，先用2mol/L中性鹽-緩沖液溶液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白。洗脫方式，可以采用中性鹽濃度梯度(2.0mol/L～0.0mol/L)方式洗脫；也可以采用鹽濃度階段洗脫方式，分別采用1.5mol/L、1.0mol/L、0.5mol/L、0.25mol/L、0.2mol/L、0.1mol/L、0.0mol/L中性鹽溶液進行階段方式洗脫。利用抗PGRP-SA抗體檢測目的蛋白的存在情況，將含有PGRP-SA的洗脫液合并儲存備用；也可以采用常規、通用透析或超濾方法，除去洗脫合并液的鹽或再進一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲存上述樣品溶液備用。

疏水層析分離純化的特征：(1)疏水層析介質選擇苯基-疏水層析填料或正辛烷-疏水層析填料-或己烷-疏水層析填料-或丁烷-疏水層析填料；(2)中性鹽選擇(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄或NaCl；(3)分離純化操作溫度、緩沖液、酸堿度選擇，是按PGRP-SA提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征。

4.凝膠層析分離純化PGRP-SA

取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按PGRP-SA提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調pH至PGRP-SA的提取、分離、純化體系基本條件特征的要求條件范圍內。樣品液上樣于預先用緩沖液平衡好的凝膠過濾層析柱并進行分離純化洗脫，利用抗PGRP-SA抗體檢測目的蛋白的存在情況，將含有PGRP-SA的洗脫液合并儲存備用；也可以采用常規、通用透析或超濾方法，除去洗脫合并液的鹽或再進一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲存上述樣品溶液備用。

凝膠層析分離純化的特征：(1)層析介質可以選擇Sephacryl S-100HR或Sephacryl S-200HR或Sephadex G-50或Sephadex G-75或Sephadex G-100或Sephadex G-150或Superose 12prep grade或Superose 6prep grade或Superdex 30prep grade或Superdex 75prep grade或Superose 12HR或Superose 6HR或Superdex Peptide HR或Superdex75HR或Superdex Peptide PE等凝膠層析填料；(2)分離純化操作溫度、緩沖液、酸堿度選擇，是按PGRP-SA提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征，此外洗脫液的濃度，優選在離子濃度大于0.15M及以上。

5.鹽析分離純化PGRP-SA

取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按PGRP-SA提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調pH至PGRP-SA的提取、分離、純化體系基本條件特征的要求條件范圍內。在樣品溶液中加入蛋白質鹽析常規、通用的中性鹽，至濃度達到PGRP-SA仍處于溶解狀態，而一些雜蛋白處于沉淀。離心取其上清溶液繼續加入鹽析常規、通用的中性鹽至濃度達到PGRP-SA沉淀狀態。離心棄上清，沉淀溶于PGRP-SA提取、分離、純化體系基本條件特征的溶液或緩沖液儲存備用；沉淀的溶解液，也可以采用常規、通用透析或超濾方法，除去其中的鹽或再進一步用需要的低濃度緩沖液透析或超濾處理，儲存上述樣品溶液備用。

鹽析分離純化的特征：(1)分離純化的緩沖液、酸堿度選擇，是按PGRP-SA提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征；(2)鹽析使用的中性鹽，選擇(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄或NaCl，優選(NH₄)₂SO₄或Na₂SO₄；(3)在使PGRP-SA處于溶解狀態時，選擇中性鹽在5％—45％，優選10％—40％；(4)在使PGRP-SA處于沉淀狀態時，選擇中性鹽在40％—90％，優選45％—75％。

6.超濾分離純化PGRP-SA以及處理PGRP-SA溶液

取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按PGRP-SA提取、分離、純化體系基本條件的特征，用酸性溶液或堿性溶液調pH至PGRP-SA的提取、分離、純化體系基本條件特征的要求條件范圍內。利用常規、通用超濾方法，分離純化PGRP-SA。一種方案，選擇一定規格的超濾膜，使PGRP-SA透過超濾膜，而一些雜蛋白則被超濾膜截留，從而使PGRP-SA得以分離純化；透過超濾膜的PGRP-SA溶液，再選擇一定規格的超濾膜，使PGRP-SA被截留，而一些雜蛋白則透過超濾膜，從而使PGRP-SA得以分離純化。另一種方案，是選擇一定規格的超濾膜，使PGRP-SA先被超濾膜截留，隨后再選擇一定規格的超濾膜，使PGRP-SA透過超濾膜，從而使PGRP-SA得以分離純化。

超濾處理PGRP-SA溶液的目的，是除去PGRP-SA溶液中的鹽或小分子雜質或更換緩沖液。此外，對PGRP-SA溶液進行濃縮。處理方法同上所述，選擇一定規格的超濾膜，使PGRP-SA被超濾膜截留，而鹽或小分子雜質或緩沖液的緩沖離子對則透過超濾膜，從而實現去除鹽、小分子雜質或更換緩沖液或濃縮的目的。

超濾分離純化和處理的特征：(1)透過PGRP-SA的超濾膜選擇分子量為20kDa或30kDa或40kDa或50kDa或60kDa規格的超濾膜，優選20kDa～50kDa的超濾膜，大于或小于優選規格的超濾膜，其收率或超濾效率均受影響；(2)截留PGRP-SA的超濾膜選擇是分子量為3kDa或10kDa或20kDa或30kDa的超濾膜，優選10kDa～30kDa的超濾膜，大于或小于優選規格的超濾膜，其收率或超濾效率均受影響；(3)超濾分離純化或處理的操作溫度、緩沖液及其酸堿度或濃度選擇，是按PGRP-SA提取、分離、純化體系基本條件所描述的特征。

通過上述任何一種方法所獲得的PGRP-SA純度，有時無法滿足相應需要。

本發明是從昆蟲血淋巴中分離純化高純度PGRP-SA，并可以達到電泳純乃至HPLC純度。其特征在于，將上述六種分離純化方法(離子交換柱層析、親和柱層析、疏水柱層析、凝膠過濾柱層析、鹽析、超濾)，進行兩種分離純化方法自由組合及其順序重排組合，或三種分離純化方法自由組合及其順序重排組合，或四種分離純化方法自由組合及其順序重排組合，或五種分離純化方法自由組合及其順序重排組合，純化方法自由組合及其順序重排組合，直至樣品純度得到預期要求。

本發明所指昆蟲是鱗翅目昆蟲，鱗翅目昆蟲優選天(大)蠶蛾科(Saturniidae)昆蟲，選自柞蠶、蓖麻蠶、天蠶、印度柞蠶、琥珀蠶、美國柞蠶、樗蠶、大山蠶、美洲天蠶、樟蠶、楓蠶，昆蟲為任何地域的天然或人工放養或人工飼養的昆蟲。為使本專業技術人員更全面、清晰理解本發明，以柞蠶作為代表來描述下面的內容，而選擇柞蠶作為代表來描述并不是以任何方式限制本發明權利要求的范圍。

本發明所述的肽聚糖識別蛋白-SA、肽聚糖識別蛋白-SA類似物或活性片段是利用基因工程表達獲得，包括(1)原核生物系統的表達載體，表達宿主細胞為大腸桿菌細胞或枯草桿菌細胞，(2)酵母細胞系統的表達載體，表達宿主細胞為酵母細胞，(3)昆蟲細胞系統的表達載體，表達宿主細胞為昆蟲細胞，(4)哺乳動物細胞系統的表達載體，表達宿主細胞為哺乳動物細胞。上述表達形式為細胞內表達或分泌形式表達，上述表達體系中的表達產物作為制備肽聚糖識別蛋白-SA、肽聚糖識別蛋白-SA類似物或活性片段的來源。

所述“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞，常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞等。

本發明所指微生物以及其相關分子模式是真菌、革蘭陽性菌和革蘭陰性菌以及其相關分子模式。為使本專業技術人員更全面、清晰理解本發明，以畢赤酵母、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌等作為微生物(真菌、革蘭陽性菌和革蘭陰性菌)代表來描述下面的內容，以Lys-PGN、DAP-PGN、脂磷壁酸、甘露聚糖、β-1,3-葡聚糖、脂多糖等作為微生物相關分子模式代表來描述下面的內容，而選擇上述具體的微生物或具體的微生物相關分子模式作為代表來描述并不是以任何方式限制本發明權利要求的范圍。

二、PGRP-SA結構解析以及其基因序列解析

按照常規蛋白質化學與分子生物學的技術、方法、手段，對PGRP-SA進行結構解析。包括：(1)利用生物質譜測定天然PGRP-SA的分子量；(2)采用常規蛋白水解酶及其水解條件，針對發明內容所獲得PGRP-SA進行降解，通過HPLC分離降解片段，利用生物質譜或Edman降解方法解析部分氨基酸序列，從而獲得PGRP-SA分子內許多片段的氨基酸序列；(3)利用分子生物學技術、方法，從昆蟲脂肪體提取總RNA，利用RACE技術構建昆蟲cDNA pool。根據目的蛋白降解片段的氨基酸序列，設計引物，PCR擴增片段基因。隨后結合RACE技術獲得PGRP-SA基因—cDNA，通過基因序列測定分析獲得其堿基序列并由其開放閱讀框堿基序列推導獲得PGRP-SA全長一級結構；(4)利用分子生物學技術、方法等，從昆蟲脂肪體提取其染色體基因。設計PCR擴增上下游引物，以昆蟲染色體基因為模板，PCR擴增PGRP-SA染色體基因，通過基因序列測定分析獲得PGRP-SA染色體基因中的內含子、外顯子序列；(5)通過上述所獲得PGRP-SA的分子量、分子內部分氨基酸序列、cDNA開放閱讀框序列、染色體基因中的外顯子序列，彼此相互驗證上述結構信息，獲得PGRP-SA全長一級結構序列、天然PGRP-SA或稱成熟PGRP-SA一級結構序列(參見SEQ ID:1和ID:2)。

三、重組PGRP-SA及其部分片段或類似物的制備

本發明還包含具有PGRP-SA序列的重組PGRP-SA及其部分片段或類似物。

所述的重組PGRP-SA及其類似物或活性片段選自Met-PGRP-SA成熟肽氨基酸序列、Met-組氨酸標簽-PGRP-SA成熟肽氨基酸序列、Met-PGRP-SA成熟肽-His6標簽氨基酸序列、Met-His6標簽-凝血酶酶切位點-PGRP-SA成熟肽氨基酸序列、Met-GST標簽-凝血酶酶切位點-PGRP-SA成熟肽氨基酸序列、Met-PGRP-SA成熟肽-凝血酶酶切位點-GST標簽氨基酸序列、Met-His6標簽-PGRP-SA全序列氨基酸序列、Met-PGRP-SA全序列-His6標簽氨基酸序列、Met-GST標簽-凝血酶酶切位點-PGRP-SA全序列氨基酸序列、Met-PGRP-SA全序列-凝血酶酶切位點-GST標簽氨基酸序列、Met-PGRP-SA成熟肽-Flag標簽氨基酸序列、Met-Flag標簽-PGRP-SA成熟肽氨基酸序列、Met-PGRP-SA全序列-Flag標簽氨基酸序列、Met-Flag標簽-PGRP-SA全序列氨基酸序列(參見SEQ ID：3-16)。

本發明的重組PGRP-SA及其部分片段或類似物通過基因工程表達制備獲得，通過如下技術方案實現，包括：(1)將PGRP-SA及其部分片段或類似物編碼DNA重組至表達載體；(2)用步驟⑴的重組表達載體轉化適當的宿主細胞(原核或真核細胞)；(3)在適合的誘導表達條件下，培養步驟⑵的被轉化的宿主細胞；(4)收獲并純化所得到的目的蛋白。

本發明同時提供上述重組PGRP-SA及其部分片段或類似物的表達產物分離純化方法。可使用鹽析沉淀、超濾、親和層析、離子交換層析、疏水作用層析和凝膠過濾等方法以及上述方法的多種組合，從基因工程細胞的溶胞產物或培養液中分離并純化所需的表達產物。在表達產物的分離和純化過程中，可使用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)、酶聯免疫吸附法(ELISA)或蛋白免疫印跡法(Western)檢測表達產物的存在及相應分子大小。

四、PGRP-SA及其部分片段或類似物的結合特異性及其應用

本發明再一個目的是針對天然、重組PGRP-SA其部分片段或類似物的體外結合特異性、對微生物的結合與凝集作用以及對激活酚氧化酶原激活系統的激活情況、對抗菌肽合成的激活作用的對比，確定了天然、重組PGRP-SA及其部分片段或類似物的生物活性。同時，考察PGRP-SA在機體免疫應答過程的表達，也研究了天然、重組PGRP-SA及其部分片段或類似物的應用。

此外，本發明也研究了天然、重組PGRP-SA及其部分片段或類似物作為抗原刺激機體產生抗體、抗體的制備以及其應用。

本發明所述的天然、重組PGRP-SA及其部分片段或類似物獲得方法常規、簡單、產量高。

附圖說明：

圖1為分離純化天然PGRP-SA電泳圖譜

泳道1：實施例1中方法-1分離獲得天然PGRP-SA的電泳圖譜；

泳道2：實施例1中方法-2所獲天然PGRP-SA的電泳圖譜；

泳道3：實施例1中方法-3所獲天然PGRP-SA的電泳圖譜；

泳道4：實施例1中方法-4所獲天然PGRP-SA的電泳圖譜。

圖2為分離純化重組PGRP-SA(原核表達體系)電泳圖譜

泳道1：實施例2中方法-(1)所獲得重組PGRP-SA的電泳圖譜；

泳道2：實施例2中方法-(2)所獲重組PGRP-SA的電泳圖譜；

泳道3：實施例2中方法-(3)所獲重組PGRP-SA的電泳圖譜；

泳道4：實施例2中方法-(4)所獲重組PGRP-SA的電泳圖譜。

圖3為分離純化重組PGRP-SA(真核表達體系)電泳圖譜

泳道1：實施例3中方法-1所獲得重組PGRP-SA的電泳圖譜(昆蟲表達體系)；

泳道2：實施例3中方法-2所獲重組PGRP-SA的電泳圖譜(昆蟲表達體系)；

泳道3：實施例4中方法所獲得重組PGRP-SA的電泳圖譜(酵母表達體系)；

泳道4：實施例5中方法所獲天然PGRP-SA的電泳圖譜(哺乳動物細胞表達體系)。

圖4為天然PGRP-SA與微生物及其相關分子模式的結合特異性

4-A：天然PGRP-SA與微生物的結合特異性；

4-B：Western-blot方法檢測天然PGRP-SA與微生物相關分子模式的結合特異性；

4-C：ELISA方法檢測天然PGRP-SA與微生物相關分子模式的結合特異性。

圖5為重組PGRP-SA及其類似物、活性片段與微生物及其相關分子模式的結合特異性

5-A：重組PGRP-SA及其類似物、活性片段與微生物的結合特異性；

5-B：ELISA方法檢測重組PGRP-SA及其類似物、活性片段與微生物相關分子模式的結合特異性；

5-C：MST方法檢測重組PGRP-SA及其類似物、活性片段與微生物相關分子模式的結合特異性。

圖6為天然PGRP-SA以及重組PGRP-SA及其類似物、活性片段對酚氧化酶原激活系統的作用。

圖7為PGRP-SA對抗菌肽合成的影響

7-A：PGRP-SA干擾對金黃色葡萄球菌(革蘭陽性菌)誘導的抗菌肽合成的抑制作用；

7-B：PGRP-SA干擾對大腸桿菌(革蘭陰性菌)誘導的抗菌肽合成的抑制作用；

7-C：PGRP-SA干擾對白色念珠菌(真菌)誘導的抗菌肽合成的抑制作用。

具體實施方式：

下面的實施例可以使本專業技術人員更全面地理解本發明，而不是以任何方式限制本發明權利要求的范圍。

實施例1

天然PGRP-SA的分離純化

1.方法-1

收取血淋巴，迅速與pH6.5飽和硫酸銨混合并激烈震蕩，12000rpm離心20min后在沉淀中加入pH6.50.2M磷酸鉀(含有1mM EDTA，1mM鄰二氮雜菲，1mM PMSF，5mM苯硫脲和1％乙醇)，溶液流經PGN修飾的Sepharose 4B，按下列洗脫條件進行洗脫：0.1M磷酸鉀pH6.5；0.1M磷酸鉀pH6.5，0-2M KCl線性梯度；2M KCL，5mM MES pH5.5；2M KCl，5mM醋酸緩沖液pH3.5。目的組分經10mM甘氨酸/氫氧化鈉pH 8.5透析后流經羥基磷灰石HPLC，平衡緩沖液為10mM，pH8.5甘氨酸/氫氧化鈉緩沖液，10-150mM甘氨酸/氫氧化鈉pH8.5和150mM-1M甘氨酸/氫氧化鈉pH8.5兩次線性梯度洗脫。收集組分以10mM Tris-HCl pH7.0透析后流經Mono Q HPLC，使用0-0.1M NaCl進行線性梯度洗脫，獲得目的蛋白成分。

試驗結果如圖1泳道1，天然PGRP-SA的純度達到電泳純。

2.方法-2

將溶于昆蟲生理鹽水的真菌、革蘭陽性菌和革蘭陰性菌混合物(10ul)注射柞蠶體內，誘導24～48小時后收集菌誘導后的血淋巴，用50mM Tris-HCl緩沖液pH5.5稀釋10倍，流經Mono-Q離子交換層析柱，利用0-1M NaCl的50mM Tris-HCl緩沖液pH5.5進行線性梯度洗脫。收集目的組分，利用超濾膜分離濃縮至1mL后上樣至凝膠過濾層析(Toyopearl HW-55S，1×30cm)，平衡與洗脫體系均為50mM Tris-HCl150mMNaCl 3mM EDTA pH 7.5。將目的組分超濾濃縮至1mL，用10mM磷酸鈉緩沖液pH4.5稀釋10倍，流經Octyl-sepharose4-Fast Flow，利用10-500mM硫酸鈉緩沖液pH4.5進行線性洗脫，獲得目的蛋白成分。

試驗結果如圖1泳道2，天然PGRP-SA的純度達到電泳純。

3.方法-3

將溶于抗凝緩沖溶液的柞蠶體液離心去除血細胞，以不含有血細胞的柞蠶血淋巴作為純化PGRP-SA的樣品。將200ml樣品進行硫酸銨分級沉淀，取30～35％沉淀組分用硼砂-氫氧化鈉緩沖液(0.05mol/L，Ph9.0)溶解稀釋，上樣于SP-Sepharose陰離子交換柱，采用50mM-1MNaCl洗滌洗脫；將含有目的蛋白的組分上樣于Phenyl-sepharose6-Fast Flow洗滌洗脫；將含有目的物的組分用透析后，在相同條件下上樣于肝素層析柱，20mM Tirs-HCl，0.3M NaCl pH5.0洗脫；洗脫組分利用超濾除鹽，20mM Tirs-HCl，pH5.0上樣于DEAE-Sepharose陽離子交換柱，20mM Tirs-HCl，1M NaCl pH5.0洗滌洗脫，將含有目的片段的組分上樣于凝膠過濾層析柱Sepharose CL-6B column進一步的分離純化，從而獲得目的蛋白。

試驗結果如圖1泳道3，天然PGRP-SA的純度達到電泳純。

4.方法-4

收集柞蠶血淋巴，加入終濃度為0.5mM的絲氨酸蛋白酶抑制劑DFP處理1h。以50mM Tris，3mMEDTA，pH6.0作為透析緩沖液4℃透析12～14h，3000rpm離心20min后取上清。將血淋巴與甲醛固定后的細菌4℃共孵育30min，采用50mM Tris，3mMEDTA，3M NaCl pH6.0洗脫；將洗脫液利用20mM Tris，3mMEDTA，pH8.0透析，并上樣至凝膠過濾層析柱TSK gel G2000HPLC分離；將含有目的物的組分流經疏水層析柱Hydroxyl apatite柱分離，20mM-500mM NaCl洗脫收集目的蛋白。

試驗結果如圖1泳道4，天然PGRP-SA的純度達到電泳純。

實施例2：

PGRP-SA結構解析以及其基因序列解析

按照常規蛋白質化學與分子生物學的技術、方法、手段，對PGRP-SA進行結構解析。具體方法、手段按照發明內容二中所列內容實施。

獲得PGRP-SA完整核苷酸序列及其氨基酸序列(如SEQ ID:1和ID:2所示)。

實施例3：

利用原核生物表達系統獲得重組PGRP-SA及其類似物、活性片段

本實施例列舉描述原核生物表達系統表達本發明PGRP-SA及其類似物、活性片段基因的構建策略和基本方法。

原核生物表達系統的表達載體、表達宿主細胞以及表達策略，均為基因工程表達的常規、通用的表達載體、表達宿主細胞以及表達策略。

本實施是為使本專業技術人員更全面地理解本發明，而不是以任何方式限制本發明特批權利要求的范圍。

對于表達產物的分離純化方法，是采用實施例1的方法、原理、策略等。

1.PGRP-SA的表達載體構建

根據天然PGRP-SA的N末端和C末端氨基酸序列，分別設計相應寡核苷酸引物，同時在上述兩個寡核苷酸引物的5′端，分別加上限制性核酸內切酶水解位點序列；以昆蟲脂肪體cDNA pool為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測產物并進行核酸片段的凝膠回收；經過限制性核酸內切酶酶切后與同樣進行雙酶切表達質粒，在DNA連接酶的作用下進行重組連接，熱轉化大腸桿菌感受態細胞；經過菌落PCR和限制性核酸內切酶酶切驗證篩選獲得陽性轉化子后提交生物技術服務公司進行DNA序列測定。通過上述基因工程的方法，構建PGRP-SA基因的表達載體。

本實施例表達載體構建的特征：1。以大腸桿菌為宿主，表達載體可選擇pTYB11、pMAL-C2X、pET-28a、pGEX-2T、pBV220、pQE30、pET20b等；2.可以在PGRP-SA的N端前融合一段肽段作為親和層析的標簽(Tag)；3.可以在PGRP-SA的C段后融合一段肽段作為親和層析的標簽(Tag)；4.標簽可以選擇His-Tag(連續六個及以上組氨酸)、GST-Tag、Flag-Tag等；5.可以在親和層析標簽與PGRP-SA之間，添加蛋白水解酶水解位點的氨基酸序列，如凝血酶、腸激酶、凝血X因子等，以獲得與天然PGRP-SA蛋白結構一致的重組PGRP-SA蛋白。

2.重組PGRP-SA蛋白及其衍生物、類似物、活性片段的獲得

利用基因工程技術，將PGRP-SA基因表達載體轉化大腸桿菌，挑取單菌落后接種至含抗生素的LB，誘導PGRP-SA基因的表達，從而獲得含有PGRP-SA的培養液或菌體。含有PGRP-SA的菌體首先經裂解液裂解、超聲破碎，釋放目的蛋白后利用離心方法收集上清液作為重組PGRP-SA的原料液備用。

重組目的基因表達的特征：1.表達載體轉化進入宿主的方式可以選擇熱轉化法和電轉化方法；2.誘導表達的方式包括化學誘導—異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導和加溫誘導；3.PGRP-SA基因可表達于細胞內或細胞外；3.存在于細胞內的PGRP-SA需通過裂解液裂解、超速破碎等方式，將目的蛋白釋放至溶液中。

按照實施例1的方法、原理、策略等，從上述含PGRP-SA的原料液中分離純化重組PGRP-SA及其衍生物、類似物、活性片段至需要的純度，直至達到電泳純或HPLC純。

例如：(1)采用pTYB11構建無標簽PGRP-SA表達載體，采用電轉化方法將表達載體轉入宿主細胞，經IPTG誘導，PGRP-SA表達于細胞內。采用裂解緩沖液重懸菌體，進行超聲破碎，離心獲得上清液作為進一步分離純化PGRP-SA的原料液。按照實施例1的方法、原理、策略等，分離純化PGRP-SA至電泳純(圖2-泳道1)。

(2)采用pET-28a構建N端前融合組氨酸標簽的PGRP-SA基因，熱轉化大腸桿菌，經IPTG誘導，His-PGRP-SA表達于細胞內。采用裂解緩沖液(50m mol/LPBS,0.15mol/L NaCl,50m mol/L咪唑)重懸菌體，進行超聲破碎，離心獲得上清液作為進一步分離純化PGRP-SA的原料液。按照實施例1的方法、原理、策略等，分離純化PGRP-SA至電泳純(圖2-泳道2)。

(3)采用pGEX-2T構建C端后融合GST標簽的PGRP-SA表達載體，熱轉化大腸桿菌，經加溫誘導表達，PGRP-SA-GST表達于胞內。采用裂解緩沖液重懸菌體，進行超聲破碎，離心獲得上清液作為進一步分離純化PGRP-SA的原料液。按照實施例1的方法、原理、策略等，分離純化PGRP-SA至電泳純(圖2-泳道3)。

(4)采用pET20b構建C端后融合組氨酸標簽的PGRP-SA基因，采用電轉化方法將表達載體轉入宿主細胞，經加溫誘導表達，PGRP-SA-His表達于胞外。按照實施例1的方法、原理、策略等，分離純化PGRP-SA至電泳純(圖2-泳道4)。

上述表達重組的PGRP-SA結構如SEQ ID：3所示，分離純化獲得的重組表達產物，經過SDS-PAGE驗證其純度如圖2所示。

上述含標簽的純化后表達產物經過上述常規、通用的蛋白水解酶(如凝血酶、腸激酶、凝血X因子等)的水解作用，去除表達產物中的融合肽段，再經分離純化從而獲得PGRP-SA，該重組PGRP-SA的結構與天然的PGRP-SA的結構相同。

實施例3：

利用昆蟲細胞表達系統獲得重組PGRP-SA及其類似物、活性片段

本實施例列舉描述昆蟲細胞表達系統表達本發明PGRP-SA及其類似物、活性片段基因的構建策略和基本方法。

昆蟲細胞表達系統的表達載體、表達宿主細胞以及表達策略，均為基因工程表達的常規、通用的表達載體、表達宿主細胞以及表達策略。

本實施例是使本專業技術人員更全面地理解本發明，而不是以任何方式限制本發明特批權利要求的范圍。

對于表達產物的分離純化方法，采用實施例1的方法、原理、策略等。

1.利用pFastBac1-sf9昆蟲表達體系獲得重組PGRP-SA及其類似物、活性片段

將PGRP-SA及其類似物、活性片段基因連接到pFastBac1質粒中，構建pFastBac1-PGRP-SA重組表達質粒。轉座大腸桿菌DH10，Blu-gal和IPTG誘導后，藍白篩選獲得轉座重組bacmid。轉染昆蟲細胞sf9，Western blot驗證重組PGRP-SA在細胞內表達。

收集細胞，用裂解緩沖液(0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 8.0)重懸，超聲破碎后離心得到含有目的蛋白的原料液。直接上樣于抗PGRP-SA抗體—sepharose CL-6B為配基的親和層析柱，采用0mol/L-3mol/L NaCl的裂解緩沖液進行梯度洗脫，重組蛋白質獲得高效表達，達到電泳純度。表達產物的結構如SEQ ID：3所示，純化后的電泳鑒定結果如圖3-泳道1。

2.利用pMIB/V5-His-Sf21昆蟲表達體系獲得重組PGRP-SA及其類似物、活性片段

將PGRP-SA及其類似物、活性片段基因連接到pMIB/V5-His質粒中，構建pMIB/V5-His-PGRP-SA重組表達質粒。轉座大腸桿菌DH5，Blue-gal和IPTG誘導后，藍白篩選獲得轉座重組bacmid。轉染昆蟲細胞Sf21，Western blot驗證重組PGRP-SA在細胞內表達。

收集細胞，用裂解緩沖液(0.05mol/L Tris-HCl，0.5mol/L NaCl，pH 8.0)重懸，超聲破碎后離心得到含有目的蛋白的原料液。直接上樣于預先平衡好的金屬離子螯合層析柱，經過0.02mol/L咪唑(pH 8.0)充分洗滌去除大量雜蛋白后，用0.2mol/L咪唑(pH 8.0)進行洗脫，重組蛋白質獲得高效表達，達到電泳純度。表達產物的結構如SEQ ID：3所示，純化后的電泳鑒定結果如圖3-泳道2。

實施例4：

利用酵母表達系統獲得重組PGRP-SA及其類似物、活性片段

本實施例列舉描述酵母細胞表達系統表達本發明PGRP-SA及其類似物、活性片段基因的構建策略和基本方法。

酵母細胞表達系統的表達載體、表達宿主細胞以及表達策略，均為基因工程表達的常規、通用的表達載體、表達宿主細胞以及表達策略。

為使本專業技術人員更全面地理解本發明，而不是以任何方式限制本發明特批權利要求的范圍，本實施例以pPIC9K表達載體、畢赤酵母GS115為代表進行描述。

對于表達產物的分離純化方法，是采用實施例1的方法、原理、策略等。

利用常規、通用的基因工程技術，將PGRP-SA基因連接到pPIC9K表達載體中，構建pPIC9K-His₆-PGRP-SA(或pPIC9K-PGRP-SA)重組表達質粒，轉化大腸桿菌，挑取陽性重組菌中重組質粒，經酶切形成線性分子，利用電轉化方法將其轉入畢赤酵母GS115中與基因組同源重組，經過初篩、復篩及Mut表型鑒定，篩選出陽性重組子，進行發酵及誘導表達，經Western blot驗證，N末端帶有His₆-tag的重組PGRP-SA為分泌型表達。

將重組菌GS115/pPIC9K-His6-PGRP-SA(或GS115/pPIC9K-PGRP-SA)接種于50ml BMGY液體培養基中，于30℃，250rpm/min，震蕩培養過夜。3000g、4℃離心5min，收集菌體。用10ml BMMY培養基重懸菌體并開始甲醇誘導表達6h，重組蛋白以分泌表達形式存在于培養基中，12,000g、4℃離心4min，得上清液，并以此為純化初始液。

如果表達產物是His₆-PGRP-SA，直接將純化初始液上樣于0.05M Tris-HCl(pH 8.0)預先平衡好的金屬離子螯合層析柱，經過0.02mol/L咪唑(pH 8.0)充分洗滌去除大量雜蛋白后，用0.2mol/L咪唑(pH 8.0)進行洗脫并收獲該洗脫液。該表達產物為His₆-PGRP-SA。表達產物的結構如SEQ ID：3所示，純化后的電泳鑒定結果如圖3-泳道3。

如果表達產物是PGRP-SA，采用實施例1的方法、原理、策略等分離純化獲得重組PGRP-SA。

實施例5：

利用哺乳動物細胞表達系統獲得重組PGRP-SA及其類似物、活性片段

本實施例列舉描述哺乳動物表達系統表達本發明PGRP-SA及其類似物、活性片段基因的構建策略和基本方法。

哺乳動物細胞表達系統的表達載體、表達宿主細胞以及表達策略，均為基因工程表達的常規、通用的表達載體、表達宿主細胞以及表達策略。

為使本專業技術人員更全面地理解本發明，而不是以任何方式限制本發明特批權利要求的范圍，本實施例以pCDNA3.0(neo⁺)質粒、CHO-K1細胞為代表進行描述。

對于表達產物的分離純化方法，是采用實施例1和實施例2的方法、原理、策略等。

利用常規、通用的基因工程技術，將PGRP-SA基因連接到pCDNA3.0(neo⁺)質粒中，構建pCDNA3.0(neo⁺)-His₆-PGRP-SA(或pCDNA3.0(neo⁺)-PGRP-SA)重組表達質粒。將其轉染哺乳動物細胞株CHO-K1，對轉染成功細胞株于5％CO₂培養箱中，37℃貼壁培養72h，收集細胞及培養液，經Western blot驗證，N末端帶有His₆-tag的重組PGRP-SA得以表達。

用15ul重組質粒pCDNA3.0(neo⁺)-His₆-PGRP-SA(或pCDNA3.0(neo⁺)-PGRP-SA)轉染8ml IMDM medium(含有CHO-K1cell，2X10⁵cell/ml)，于37℃，15％CO₂培養箱中，37℃貼壁培養72h。用0.25％胰蛋白酶消化細胞2～3min，使細胞懸浮，收集細胞。用5ml裂解液(NP40)使細胞裂解，12,000g、4℃離心5min，得上清液作為純化初始液。

如果表達產物是His₆-PGRP-SA，直接將純化初始液上樣于0.05M Tris-HCl(pH8.0)預先平衡好的金屬離子螯合層析柱，經過0.02mol/L咪唑(pH 8.0)分別充分洗滌去除大量雜蛋白后，用0.2mol/L咪唑(pH8.0)進行洗脫并收獲該洗脫液。該表達產物為His₆-PGRP-SA。表達產物的結構如SEQ ID：3所示，純化后的電泳鑒定結果如圖3-泳道4。

如果表達產物是PGRP-SA，采用實施例1的方法、原理、策略等分離純化獲得重組PGRP-SA。

實施例6：

PGRP-SA抗體的獲得

按照常規、通用的抗體產生的技術，利用實施例1、3、4、5獲得的各種PGRP-SA作為抗原，刺激小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或馬或牛的免疫系統產生相應抗體。

利用常規、通用的抗體檢測方法，檢測被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或馬或牛的血清中PGRP-SA抗體產生情況。

當被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或馬或牛產生了PGRP-SA抗體后，采用常規、通用的動物血清采集與存儲方法，采集被免疫小鼠或大鼠或家兔或犬或羊或馬或牛的血清并存儲，該血清可以直接應用。

利用常規、通用的抗體分離純化技術，如鹽析、各種類型層析介質、抗體親和層析介質等，從存儲的含有PGRP-SA抗體的血清中分離純化不同純度的PGRP-SA抗體，直至獲得電泳純或HPLC純的PGRP-SA抗體，以適于不同要求的應用。

實施例7：

重組以及天然PGRP-SA及其類似物、活性片段的模式識別活性

為使本專業技術人員更全面地理解本發明，而不是以任何方式限制本發明特批權利要求的范圍。本實施例中天然PGRP-SA、重組PGRP-SA及其類似物、活性片段具有相同的生物活性。以柞蠶作為鱗翅目昆蟲的生物活性實驗昆蟲為代表進行描述。本專業技術人員可以以天然PGRP-SA、重組PGRP-SA及其類似物、活性片段的生物活性為核心與基礎，進一步拓展天然PGRP-SA、重組PGRP-SA及其類似物、活性片段的應用范圍。

1.天然PGRP-SA與微生物及其相關分子模式的結合特異性

(1)天然PGRP-SA與微生物的結合特異性

采用western blotting方法考察天然PGRP-SA與革蘭陽性菌(金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌)、革蘭陰性菌(大腸桿菌和綠膿桿菌)和真菌(白色念珠菌)的結合特性。利用天然PGRP-SA-S分別與等量的微生物孵育，充分洗滌去除未結合組分后，在高溫條件下2％SDS洗脫結合組分，利用PGRP-SA-S多克隆抗體間接檢測天然PGRP-SA-S與不同種類微生物的結合情況。結果如圖4-A所示，天然PGRP-SA-S與三種類別的微生物均具有結合特性。

(2)天然PGRP-SA與微生物相關分子模式的結合特異性

分別以革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和真菌的典型分子模式β-1,3-D-葡聚糖、Lys-PGN和DAP-PGN分別作為三類微生物的代表，按照上述western blotting方法進行試驗，結果如圖4-B所示，天然PGRP-SA-S對三種PAMPs均具有結合特性。

采用間接酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測天然PGRP-SA對6種可溶性的，分別來自不同種微生物的典型分子模式(PAMP)的識別能力。Lys-PGN和LTA屬于革蘭陽性菌的特異PAMPs，DAP-PGN和LPS屬于革蘭陰性菌的特異PAMPs，laminarin(可溶性β-1,3葡聚糖)和Mannan屬于真菌的特異PAMP。不同濃度的PAMPs被包被在96孔板上，依次將天然PGRP-SA，兔源抗PGRP-SA-S多克隆抗血清(一抗)以及偶聯有辣根過氧化酶的山羊抗兔IgG(二抗)加入96孔板孵育并徹底洗滌未結合組分，最后加入辣根過氧化酶底物，檢測在450nm下底物顯色的光吸收情況。如如圖4-C所示，天然PGRP-SA對6種可溶性PAMPs均有結合，并具有一定的濃度依賴性(依次選擇500ug/ml、100ug/ml、10ug/ml、1ug/ml、)，屬于特異性結合。

上述實驗說明，天然PGRP-SA能夠通過特異性識別典型分子模式而與革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和真菌發生特異性結合。

2.重組PGRP-SA及其類似物、活性片段與微生物及其相關分子模式的結合特異性

(1)重組PGRP-SA及其類似物、活性片段與微生物的結合特異性

按照實施例7中1-(1)中所述western blotting方法考察天然PGRP-SA與革蘭陽性菌(金黃色葡萄球菌和藤黃微球菌)、革蘭陰性菌(大腸桿菌和綠膿桿菌)和真菌(白色念珠菌)的結合特性。以重組PGRP-SA－GST為例，結果如圖5-A所示，重組PGRP-SA－GST與三種類別的微生物均具有結合特性。

(2)重組PGRP-SA及其類似物、活性片段與微生物相關分子模式的結合特異性

按照實施例7中1-(2)間接酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測重組PGRP-SA及其類似物、活性片段對上述6中PAMPs的結合特定。以重組PGRP-SA為例，如圖5-B所示，重組PGRP-SA對6種可溶性PAMPs均有結合，并具有一定的濃度依賴性，顯示重組PGRP-SA與天然PGRP-SA具有相同的生物學活性。采用實施例3、4、5中所述重組PGRP-SA類似物、活性片段可獲得相同的實驗結果。

采用微量熱泳動儀(MST)檢測重組PGRP-SA及其類似物、活性片段對上述除Mannan以外的5種代表性、可溶性微生物相關分子模式的識別能力。相同濃度的微生物相關分子模式被包被在探頭上，將重組PGRP-SA或其類似物、活性片段分別與探頭共孵育，通過測定樣品在微觀溫度梯度場中分子的定向運動，檢測重組PGRP-SA或其類似物、活性片段與可溶性微生物相關分子模式的結合情況。以重組His₆-PGRP-SA為例，如圖5-C所示，與陰性對照淀粉相比，重組His₆-PGRP-SA與5種可溶性PAMPs均有明顯的識別結合作用。采用實施例3、4、5中所述重組PGRP-SA類似物、活性片段可獲得相同的實驗結果。

3.天然PGRP-SA以及重組PGRP-SA及其類似物、活性片段對昆蟲酚氧化酶原激活系統的作用

以重組PGRP-SA－Flag為例，考察PGRP-SA對pro-PO系統的影響，如圖6所示：緩沖溶液、BSA與重組PGRP-SA－Flag與血淋巴孵育均對血淋巴pro-PO系統無影響，而加入重組蛋白后，PO活力激活程度均遠遠高于血淋巴被單純病原體相關分子模式激活產生PO活力的程度。說明，在微生物及微生物相關分子模式存在下，重組PGRP-SA－Flag能夠顯著提高pro-PO系統的激活程度。采用天然PGRP-SA或重組PGRP-SA及其類似物、活性片段可獲得相同的實驗結果。

4.PGRP-SA對抗菌肽合成的影響

分別將重組PGRP-SA、微生物細胞(大腸桿菌)以及重組PGRP-SA和大腸桿菌的共孵育混合物分別注射5齡期柞蠶幼蟲體內，經24h誘導后，提取各組柞蠶血淋巴，將誘導血淋巴與生長于固體LB培養基中的大腸桿菌共孵育，通過管碟法檢測誘導血淋巴產生抑菌圈的大小，從而鑒定各組誘導血淋巴中抗菌(抑菌)物質含量的多少。實驗結果顯示，作為陰性對照，單純柞蠶血淋巴及昆蟲生理鹽水誘導的血淋巴幾乎不存在抗菌物質；重組PGRP-SA和微生物細胞(大腸桿菌)分別誘導產生的血淋巴的抑菌活性與單純血淋巴產生的抑菌活力相比，均有明顯提高；而重組PGRP-SA和大腸桿菌的共孵育混合物所誘導產生的血淋巴抑菌活力與其他組產生的抑菌活力相比，抑菌效果更為顯著。

以dsEGFP為陰性對照，采用顯微注射法將PGRP-SA特異性dsRNA導入柞蠶幼蟲體內，再將微生物-金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌分別注射入柞蠶幼蟲體內，經24h誘導后，收集脂肪體，測定抗菌物質的mRNA含量以判斷PGRP-SA對抗菌肽合成的影響。如圖7-A、B、C所示，將PGRP-SA特異性dsRNA導入柞蠶幼蟲體內可顯著降低PGRP-SA的合成，且PGRP-SA表達量的降低能夠顯著抑制Attacin、Cecropin B、Lysozyme等抗菌物質的合成。

上述實驗結果表明：本發明專利的天然、重組PGRP-SA以及其類似物、活性片段作為昆蟲體內模式識別蛋白與微生物及其分子模式結合后，可以激活昆蟲體內酚氧化酶原激活系統，也可促進抗菌肽的合成。

實施例8：

天然、重組PGRP-SA以及其類似物、活性片段及其抗體的應用

為使本專業技術人員更全面地理解本發明，而不是以任何方式限制本發明特批權利要求的范圍，本實施例以PGRP-SA的生物活性為代表進行描述，PGRP-SA類似物、活性片段也具有相同的生物活性。同時也以柞蠶作為鱗翅目昆蟲的生物活性實驗昆蟲為代表進行描述。本專業技術人員可以以PGRP-SA及其類似物、活性片段及其抗體的生物活性為核心與基礎，進一步拓展PGRP-SA及其類似物、活性片段及其抗體的應用范圍。

1.PGRP-SA及其類似物、活性片段誘導昆蟲產生抗菌肽

如實施例7中所描述，利用微生物或結合了微生物相關分子模式的PGRP-SA及其類似物、活性片段可以誘導昆蟲產生抗菌肽。基于此，從產生抗菌肽的昆蟲體內制備相應的抗菌肽，該抗菌肽可以用于醫藥領域。

2.PGRP-SA及其類似物、活性片段用于微生物的檢測

如實施例7中所描述，PGRP-SA及其類似物、活性片段作為酚氧化酶原激活系統的成分—起始激活因子，與微生物或其分子模式結合后，能夠激活昆蟲體內酚氧化酶原激活系統(激活的酚氧化酶引發黑化)。

取任何待檢測真菌的樣品，首先與PGRP-SA包括及其類似物、活性片段混合，注入柞蠶幼蟲體內，在一定時間觀察柞蠶黑化程度和死亡率；對照組是將同樣劑量的待檢測微生物的樣品注入柞蠶幼蟲體內，在相同時間觀察柞蠶黑化程度和死亡率。實驗組與對照組具有顯著差異，表明檢測樣品中含有微生物或其相關分子模式。

同樣，利用柞蠶血淋巴替代柞蠶觀察血淋巴的黑化程度或酚氧化酶的活性強弱。在一定時間，實驗組與對照組的黑化程度及酚氧化酶的活性具有顯著差異；或血淋巴黑化程度達到同一程度所需時間縮短并具有顯著差異。表明，檢測樣品中含有微生物或其相關分子模式。

3.PGRP-SA及其類似物、活性片段抗體的應用

針對實施例6獲得的PGRP-SA及其類似物、活性片段作的抗體，利用免疫學以及分子生物學等常規、通用技術、方法等，通過PGRP-SA及其活性片段的抗體，用于鱗翅目昆蟲樣品的PGRP-SA免疫檢測。同樣，也適用于從鱗翅目昆蟲分離純化制備PGRP-SA過程中的免疫檢測跟蹤分析以及樣品的定性、定量檢測分析。此方面的實驗已經在上述的天然、重組PGRP-SA及其類似物、活性片段分離純化制備過程中的實施例應用。

將足夠劑量的PGRP-SA抗體首先注入柞蠶幼蟲體內，再將脂磷壁酸、脂多糖、DAP-肽聚糖、Lys-肽聚糖、葡聚糖、甘露聚糖等微生物分子模式分別注入該柞蠶幼蟲體內后，上述分子模式并不能引發柞蠶的黑化乃至死亡；同樣，用柞蠶血淋巴替代柞蠶，事先加入足夠劑量的PGRP-SA抗體也可以阻斷柞蠶血淋巴的黑化。同理，將充分結合PGRP-SA抗體的微生物分子模式注入柞蠶幼蟲體內，微生物分子模式不引發柞蠶的黑化乃至死亡；同樣，用柞蠶血淋巴替代柞蠶，充分結合PGRP-SA抗體的微生物分子模式也不引發柞蠶血淋巴的黑化。說明PGRP-SA抗體可以抑制由微生物及其相關分子模式誘導的酚氧化酶原激活系統的激活。

在任何待檢測微生物的樣品中，加入足夠劑量的PGRP-SA抗體。按照本實施例中的PGRP-SA及其衍生物、類似物、活性片段用于微生物的檢測所述方法，進行待檢測樣品的微生物檢測。同上結果，即便是樣品中有能夠被檢測出微生物的量也不能檢測出(陰性結果)，此實驗的設計作為樣品微生物檢測的陰性對照組加以應用。

上述結果表明：PGRP-SA及其類似物、活性片段的抗體，通過與PGRP-SA及其類似物、活性片段的結合而屏蔽了與微生物及其相關分子模式的結合生物活性，從而使PGRP-SA及其類似物、活性片段失去了原有的生物活性。基于這種結合屏蔽作用原理可以廣泛應用。

SEQUENCE LISTING

<110> 沈陽藥科大學

<120> 肽聚糖識別蛋白SA及其功能、制備方法和應用

<160> 16

<210> 1

<211> 690

<212> DNA

<213> 柞蠶（Antheraea pernyi）

<220>

<221> mRNA

<222> (1)...(690)

<220>

<221> CDS

<222> (32)...(613)

<220>

<221> 5'UTP

<222> (1)...(31)

<220>

<221> sig_peptide

<222> (32)...(94)

<220>

<221> mat_peptide

<222> (95)...(613)

<220>

<221> 3'UTP

<222> (614)...(690)

<220>

<221> PolyA_site

<222> (676)...(690)

<400> 1

cttgttctgt gtagctgtaa aaaataacaa a atg gag aat tta ttt tgt ttt gtc 55

Met Glu Asn Leu Phe Cys Phe Val

-20 -15

tgt atg tta ttt atc ata aaa tac gga gcg gtt aat gct gac tgc gga att 106

Cys Met Leu Phe Ile Ile Lys Tyr Gly Ala Val Asn Ala Asp Cys Gly Ile

-10 -5 1

gtt agc aaa gat gat tgg gac ggt ctg act ccg gtt cac gtg gaa tat cta 157

Val Ser Lys Asp Asp Trp Asp Gly Leu Thr Pro Val His Val Glu Tyr Leu

5 10 15 20

aac cgt cca gtg cag tta gtt ata atc cag cac acg gac act cct ccc tgc 208

Asn Arg Pro Val Gln Leu Val Ile Ile Gln His Thr Asp Thr Pro Pro Cys

25 30 35

ttg acg gac aat gca tgc tct gct cgt gtc agg agc atc cag gat tat cat 259

Leu Thr Asp Asn Ala Cys Ser Ala Arg Val Arg Ser Ile Gln Asp Tyr His

40 45 50 55

atg gat acc tta aaa tat tgg gat att ggt tca gca ttc cta att ggt gga 310

Met Asp Thr Leu Lys Tyr Trp Asp Ile Gly Ser Ala Phe Leu Ile Gly Gly

60 65 70

aac gca aaa gta tac gaa gga tct ggt tgg gtg cac gtt agt gtt cct act 361

Asn Ala Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Val His Val Ser Val Pro Thr

75 80 85

cac gcg tac aac aga aaa gct ctt aga atc aca ttg ata gga aac tac aat 412

His Ala Tyr Asn Arg Lys Ala Leu Arg Ile Thr Leu Ile Gly Asn Tyr Asn

90 95 100 105

tcc cat caa cca aca aca gag caa atc gac gca ctg aaa tct tta ctt aga 463

Ile Asp Ala Leu Lys Ser Leu Leu Arg Cys Gly Ser His Gln Pro Thr Thr

110 115 120

tgc gga gtg agt aat gga cat cta gat tca aat tac aaa ata gtg ggc cac 514

Glu Gln Val Ser Asn Gly His Leu Asp Ser Asn Tyr Lys Ile Val Gly His

125 130 135 140

aga caa cta atg gct act gat agt ccc ggg cga aaa ctt tac aac ttg atc 565

Arg Gln Leu Met Ala Thr Asp Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Leu Ile

145 150 155

aga cga tgg ccc gaa tgg ctc gaa aat gtt gac agt tat aaa caa 610

Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Tyr Lys Gln

160 165 170

taatttaact tctgttgaat tgaaagagga tgatcattat tatccaaata cattgaaaaa 670

aaacaaaaaa aaaaaaaaaa 690

<210> 2

<211> 516

<212> DNA

<213> 柞蠶（Antheraea pernyi）

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(516)

<220>

<221> mat_peptide

<222> (1)...(172)

<400> 2

gac tgc gga att gtt agc aaa gat gat tgg gac ggt ctg act ccg gtt cac 51

Asp Cys Gly Ile Val Ser Lys Asp Asp Trp Asp Gly Leu Thr Pro Val His

1 5 10 15

gtg gaa tat cta aac cgt cca gtg cag tta gtt ata atc cag cac acg gac 102

Val Glu Tyr Leu Asn Arg Pro Val Gln Leu Val Ile Ile Gln His Thr Asp

20 25 30

act cct ccc tgc ttg acg gac aat gca tgc tct gct cgt gtc agg agc atc 153

Thr Pro Pro Cys Leu Thr Asp Asn Ala Cys Ser Ala Arg Val Arg Ser Ile

35 40 45 50

cag gat tat cat atg gat acc tta aaa tat tgg gat att ggt tca gca ttc 204

Gln Asp Tyr His Met Asp Thr Leu Lys Tyr Trp Asp Ile Gly Ser Ala Phe

55 60 65

cta att ggt gga aac gca aaa gta tac gaa gga tct ggt tgg gtg cac gtt 255

Leu Ile Gly Gly Asn Ala Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Val His Val

70 75 80 85

agt gtt cct act cac gcg tac aac aga aaa gct ctt aga atc aca ttg ata 306

Ser Val Pro Thr His Ala Tyr Asn Arg Lys Ala Leu Arg Ile Thr Leu Ile

90 95 100

gga aac tac aat tcc cat caa cca aca aca gag caa atc gac gca ctg aaa 357

Gly Asn Tyr Asn Ile Asp Ala Leu Lys Ser Leu Leu Arg Cys Gly Ser His

105 110 115

tct tta ctt aga tgc gga gtg agt aat gga cat cta gat tca aat tac aaa 408

Gln Pro Thr Thr Glu Gln Val Ser Asn Gly His Leu Asp Ser Asn Tyr Lys

120 125 130 135

ata gtg ggc cac aga caa cta atg gct act gat agt ccc ggg cga aaa ctt 459

Ile Val Gly His Arg Gln Leu Met Ala Thr Asp Ser Pro Gly Arg Lys Leu

140 145 150

tac aac ttg atc aga cga tgg ccc gaa tgg ctc gaa aat gtt gac agt tat 510

Tyr Asn Leu Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Tyr

155 160 165 170

aaa caa 516

Lys Gln

<210> 3

<211> 173

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> INIT_MET

<223> 成熟肽序列以起始密碼子甲硫氨酸開始

<400> 3

Met Asp Cys Gly Ile Val Ser Lys Asp Asp Trp Asp Gly Leu Thr Pro

1 5 10 15

Val His Val Glu Tyr Leu Asn Arg Pro Val Gln Leu Val Ile Ile Gln

20 25 30

His Thr Asp Thr Pro Pro Cys Leu Thr Asp Asn Ala Cys Ser Ala Arg

35 40 45

Val Arg Ser Ile Gln Asp Tyr His Met Asp Thr Leu Lys Tyr Trp Asp

50 55 60

Ile Gly Ser Ala Phe Leu Ile Gly Gly Asn Ala Lys Val Tyr Glu Gly

65 70 75 80

Ser Gly Trp Val His Val Ser Val Pro Thr His Ala Tyr Asn Arg Lys

85 90 95

Ala Leu Arg Ile Thr Leu Ile Gly Asn Tyr Asn Ser His Gln Pro Thr

100 105 110

Thr Glu Gln Ile Asp Ala Leu Lys Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Ser

115 120 125

Asn Gly His Leu Asp Ser Asn Tyr Lys Ile Val Gly His Arg Gln Leu

130 135 140

Met Ala Thr Asp Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Leu Ile Arg Arg

145 150 155 160

Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Tyr Lys Gln

165 170

<210> 4

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> INIT_MET

<223> 成熟肽序列以起始密碼子甲硫氨酸開始

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (2)...(7)

<223> 人工增添組氨酸標簽

<400> 4

Met His His His His His His Asp Cys Gly Ile Val Ser Lys Asp Asp

1 5 10 15

Trp Asp Gly Leu Thr Pro Val His Val Glu Tyr Leu Asn Arg Pro Val

20 25 30

Gln Leu Val Ile Ile Gln His Thr Asp Thr Pro Pro Cys Leu Thr Asp

35 40 45

Asn Ala Cys Ser Ala Arg Val Arg Ser Ile Gln Asp Tyr His Met Asp

50 55 60

Thr Leu Lys Tyr Trp Asp Ile Gly Ser Ala Phe Leu Ile Gly Gly Asn

65 70 75 80

Ala Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Val His Val Ser Val Pro Thr

85 90 95

His Ala Tyr Asn Arg Lys Ala Leu Arg Ile Thr Leu Ile Gly Asn Tyr

100 105 110

Asn Ser His Gln Pro Thr Thr Glu Gln Ile Asp Ala Leu Lys Ser Leu

115 120 125

Leu Arg Cys Gly Val Ser Asn Gly His Leu Asp Ser Asn Tyr Lys Ile

130 135 140

Val Gly His Arg Gln Leu Met Ala Thr Asp Ser Pro Gly Arg Lys Leu

145 150 155 160

Tyr Asn Leu Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser

165 170 175

Tyr Lys Gln

<210> 5

<211> 179

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> INIT_MET

<223> 成熟肽序列以起始密碼子甲硫氨酸開始

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (174)...(179)

<223> 人工增添組氨酸標簽

<400> 5

Met Asp Cys Gly Ile Val Ser Lys Asp Asp Trp Asp Gly Leu Thr Pro

1 5 10 15

Val His Val Glu Tyr Leu Asn Arg Pro Val Gln Leu Val Ile Ile Gln

20 25 30

His Thr Asp Thr Pro Pro Cys Leu Thr Asp Asn Ala Cys Ser Ala Arg

35 40 45

Val Arg Ser Ile Gln Asp Tyr His Met Asp Thr Leu Lys Tyr Trp Asp

50 55 60

Ile Gly Ser Ala Phe Leu Ile Gly Gly Asn Ala Lys Val Tyr Glu Gly

65 70 75 80

Ser Gly Trp Val His Val Ser Val Pro Thr His Ala Tyr Asn Arg Lys

85 90 95

Ala Leu Arg Ile Thr Leu Ile Gly Asn Tyr Asn Ser His Gln Pro Thr

100 105 110

Thr Glu Gln Ile Asp Ala Leu Lys Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Ser

115 120 125

Asn Gly His Leu Asp Ser Asn Tyr Lys Ile Val Gly His Arg Gln Leu

130 135 140

Met Ala Thr Asp Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Leu Ile Arg Arg

145 150 155 160

Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Tyr Lys Gln His His His

165 170 175

His His His

<210> 6

<211> 193

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> INIT_MET

<223> 成熟肽序列以起始密碼子甲硫氨酸開始

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (5)...(10)

<223> 人工增添組氨酸標簽

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (14)...(19)

<223> 人工增添組凝血酶酶切位點

<400> 6

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Asp Cys Gly Ile Val Ser Lys Asp Asp Trp Asp

20 25 30

Gly Leu Thr Pro Val His Val Glu Tyr Leu Asn Arg Pro Val Gln Leu

35 40 45

Val Ile Ile Gln His Thr Asp Thr Pro Pro Cys Leu Thr Asp Asn Ala

50 55 60

Cys Ser Ala Arg Val Arg Ser Ile Gln Asp Tyr His Met Asp Thr Leu

65 70 75 80

Lys Tyr Trp Asp Ile Gly Ser Ala Phe Leu Ile Gly Gly Asn Ala Lys

85 90 95

Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Val His Val Ser Val Pro Thr His Ala

100 105 110

Tyr Asn Arg Lys Ala Leu Arg Ile Thr Leu Ile Gly Asn Tyr Asn Ser

115 120 125

His Gln Pro Thr Thr Glu Gln Ile Asp Ala Leu Lys Ser Leu Leu Arg

130 135 140

Cys Gly Val Ser Asn Gly His Leu Asp Ser Asn Tyr Lys Ile Val Gly

145 150 155 160

His Arg Gln Leu Met Ala Thr Asp Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn

165 170 175

Leu Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Tyr Lys

180 185 190

Gln

<210> 7

<211> 391

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> INIT_MET

<223> 成熟肽序列以起始密碼子甲硫氨酸開始

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (2)...(209)

<223> 人工增添GST-標簽

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (210)...(215)

<223> 人工增添組凝血酶酶切位點

<400> 7

Met Ala His Thr Arg Phe Val Tyr Phe Asp Gly Phe Gly Arg Gly Glu

1 5 10 15

Val Thr Arg Leu Ile Leu Lys His Leu Gly Gln Glu Phe Glu Asp Tyr

20 25 30

Arg His Thr Phe Glu Ser Trp Gly Lys Glu Lys Thr Ser Gly Val Ala

35 40 45

Glu Phe Gly Gln Leu Pro Met Leu Gln Ile Asp Gly His Asn Leu Val

50 55 60

Gln Ser Arg Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Leu Arg Arg Ala Gly Leu Leu

65 70 75 80

Ser His Asp Leu Phe Glu Leu Tyr Gln Asp Glu Ser Leu Val Gly Tyr

85 90 95

Leu Asp Asp Ile Gly Gln Ile Ile Ala Lys Phe Val Phe Val Asp Lys

100 105 110

Asp Phe Glu Gly Leu Ala Lys Phe Asn Gln Glu Gln Leu Pro Glu Lys

115 120 125

Leu Arg Ile Leu Glu Arg Arg Leu Asn Pro Ser Asn Thr His Ser Val

130 135 140

Gly Asn Ser Ile Ser His Ala Asp Phe Val Leu Phe Gln Phe Ile His

145 150 155 160

Asp Tyr Phe Leu Arg Pro Leu Lys Ala Glu Gln Leu Arg Pro Ile Leu

165 170 175

Glu Ala Ser Ala Pro Arg Leu Ile Gln Phe Ala Asp Asn Phe Lys Asn

180 185 190

Ala Ser His Asn Ile Ser Ala Tyr Leu Ala Thr Arg Ala Glu Ser Gln

195 200 205

Phe Leu Val Pro Arg Gly Ser Asp Cys Gly Ile Val Ser Lys Asp Asp

210 215 220

Trp Asp Gly Leu Thr Pro Val His Val Glu Tyr Leu Asn Arg Pro Val

225 230 235 240

Gln Leu Val Ile Ile Gln His Thr Asp Thr Pro Pro Cys Leu Thr Asp

245 250 255

Asn Ala Cys Ser Ala Arg Val Arg Ser Ile Gln Asp Tyr His Met Asp

260 265 270

Thr Leu Lys Tyr Trp Asp Ile Gly Ser Ala Phe Leu Ile Gly Gly Asn

275 280 285

Ala Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Val His Val Ser Val Pro Thr

290 295 300

His Ala Tyr Asn Arg Lys Ala Leu Arg Ile Thr Leu Ile Gly Asn Tyr

305 310 315 320

Asn Ser His Gln Pro Thr Thr Glu Gln Ile Asp Ala Leu Lys Ser Leu

325 330 335

Leu Arg Cys Gly Val Ser Asn Gly His Leu Asp Ser Asn Tyr Lys Ile

340 345 350

Val Gly His Arg Gln Leu Met Ala Thr Asp Ser Pro Gly Arg Lys Leu

355 360 365

Tyr Asn Leu Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser

370 375 380

Tyr Lys Gln Ala Ala Ala Ser

385 390

<210> 8

<211> 388

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> INIT_MET

<223> 成熟肽序列以起始密碼子甲硫氨酸開始

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (174)...(179)

<223> 人工增添凝血酶酶切位點

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (180)...(388)

<223> 人工增添組GST-標簽

<400> 8

Met Asp Cys Gly Ile Val Ser Lys Asp Asp Trp Asp Gly Leu Thr Pro

1 5 10 15

Val His Val Glu Tyr Leu Asn Arg Pro Val Gln Leu Val Ile Ile Gln

20 25 30

His Thr Asp Thr Pro Pro Cys Leu Thr Asp Asn Ala Cys Ser Ala Arg

35 40 45

Val Arg Ser Ile Gln Asp Tyr His Met Asp Thr Leu Lys Tyr Trp Asp

50 55 60

Ile Gly Ser Ala Phe Leu Ile Gly Gly Asn Ala Lys Val Tyr Glu Gly

65 70 75 80

Ser Gly Trp Val His Val Ser Val Pro Thr His Ala Tyr Asn Arg Lys

85 90 95

Ala Leu Arg Ile Thr Leu Ile Gly Asn Tyr Asn Ser His Gln Pro Thr

100 105 110

Thr Glu Gln Ile Asp Ala Leu Lys Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Ser

115 120 125

Asn Gly His Leu Asp Ser Asn Tyr Lys Ile Val Gly His Arg Gln Leu

130 135 140

Met Ala Thr Asp Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Leu Ile Arg Arg

145 150 155 160

Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Tyr Lys Gln Leu Val Pro

165 170 175

Arg Gly Ser Met Ala His Thr Arg Phe Val Tyr Phe Asp Gly Phe Gly

180 185 190

Arg Gly Glu Val Thr Arg Leu Ile Leu Lys His Leu Gly Gln Glu Phe

195 200 205

Glu Asp Tyr Arg His Thr Phe Glu Ser Trp Gly Lys Glu Lys Thr Ser

210 215 220

Gly Val Ala Glu Phe Gly Gln Leu Pro Met Leu Gln Ile Asp Gly His

225 230 235 240

Asn Leu Val Gln Ser Arg Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Leu Arg Arg Ala

245 250 255

Gly Leu Leu Ser His Asp Leu Phe Glu Leu Tyr Gln Asp Glu Ser Leu

260 265 270

Val Gly Tyr Leu Asp Asp Ile Gly Gln Ile Ile Ala Lys Phe Val Phe

275 280 285

Val Asp Lys Asp Phe Glu Gly Leu Ala Lys Phe Asn Gln Glu Gln Leu

290 295 300

Pro Glu Lys Leu Arg Ile Leu Glu Arg Arg Leu Asn Pro Ser Asn Thr

305 310 315 320

His Ser Val Gly Asn Ser Ile Ser His Ala Asp Phe Val Leu Phe Gln

325 330 335

Phe Ile His Asp Tyr Phe Leu Arg Pro Leu Lys Ala Glu Gln Leu Arg

340 345 350

Pro Ile Leu Glu Ala Ser Ala Pro Arg Leu Ile Gln Phe Ala Asp Asn

355 360 365

Phe Lys Asn Ala Ser His Asn Ile Ser Ala Tyr Leu Ala Thr Arg Ala

370 375 380

Glu Ser Gln Phe

385

<210> 9

<211> 199

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> INIT_MET

<223> 序列以起始密碼子甲硫氨酸開始

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (2)...(7)

<223> 人工增添組氨酸標簽

<220>

<221> SIGNAL

<222> (8)...(27)

<223> 信號序列的范圍（前肽）

<400> 9

Met His His His His His His Glu Asn Leu Phe Cys Phe Val Cys Met

1 5 10 15

Leu Phe Ile Ile Lys Tyr Gly Ala Val Asn Ala Asp Cys Gly Ile Val

20 25 30

Ser Lys Asp Asp Trp Asp Gly Leu Thr Pro Val His Val Glu Tyr Leu

35 40 45

Asn Arg Pro Val Gln Leu Val Ile Ile Gln His Thr Asp Thr Pro Pro

50 55 60

Cys Leu Thr Asp Asn Ala Cys Ser Ala Arg Val Arg Ser Ile Gln Asp

65 70 75 80

Tyr His Met Asp Thr Leu Lys Tyr Trp Asp Ile Gly Ser Ala Phe Leu

85 90 95

Ile Gly Gly Asn Ala Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Val His Val

100 105 110

Ser Val Pro Thr His Ala Tyr Asn Arg Lys Ala Leu Arg Ile Thr Leu

115 120 125

Ile Gly Asn Tyr Asn Ser His Gln Pro Thr Thr Glu Gln Ile Asp Ala

130 135 140

Leu Lys Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Ser Asn Gly His Leu Asp Ser

145 150 155 160

Asn Tyr Lys Ile Val Gly His Arg Gln Leu Met Ala Thr Asp Ser Pro

165 170 175

Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Leu Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu

180 185 190

Asn Val Asp Ser Tyr Lys Gln

195

<210> 10

<211> 199

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> INIT_MET

<223> 序列以起始密碼子甲硫氨酸開始

<220>

<221> SIGNAL

<222> (2)...(21)

<223> 信號序列的范圍（前肽）

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (194)...(199)

<223> 人工增添組氨酸標簽

<400> 10

Met Glu Asn Leu Phe Cys Phe Val Cys Met Leu Phe Ile Ile Lys Tyr

1 5 10 15

Gly Ala Val Asn Ala Asp Cys Gly Ile Val Ser Lys Asp Asp Trp Asp

20 25 30

Gly Leu Thr Pro Val His Val Glu Tyr Leu Asn Arg Pro Val Gln Leu

35 40 45

Val Ile Ile Gln His Thr Asp Thr Pro Pro Cys Leu Thr Asp Asn Ala

50 55 60

Cys Ser Ala Arg Val Arg Ser Ile Gln Asp Tyr His Met Asp Thr Leu

65 70 75 80

Lys Tyr Trp Asp Ile Gly Ser Ala Phe Leu Ile Gly Gly Asn Ala Lys

85 90 95

Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Val His Val Ser Val Pro Thr His Ala

100 105 110

Tyr Asn Arg Lys Ala Leu Arg Ile Thr Leu Ile Gly Asn Tyr Asn Ser

115 120 125

His Gln Pro Thr Thr Glu Gln Ile Asp Ala Leu Lys Ser Leu Leu Arg

130 135 140

Cys Gly Val Ser Asn Gly His Leu Asp Ser Asn Tyr Lys Ile Val Gly

145 150 155 160

His Arg Gln Leu Met Ala Thr Asp Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn

165 170 175

Leu Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Tyr Lys

180 185 190

Gln His His His His His His

195

<210> 11

<211> 408

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> INIT_MET

<223> 成熟肽序列以起始密碼子甲硫氨酸開始

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (2)...(209)

<223> 人工增添GST-標簽

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (210)...(215)

<223> 人工增添組凝血酶酶切位點

<220>

<221> SIGNAL

<222> (216)...(236)

<223> 信號序列的范圍（前肽）

<400> 11

Met Ala His Thr Arg Phe Val Tyr Phe Asp Gly Phe Gly Arg Gly Glu

1 5 10 15

Val Thr Arg Leu Ile Leu Lys His Leu Gly Gln Glu Phe Glu Asp Tyr

20 25 30

Arg His Thr Phe Glu Ser Trp Gly Lys Glu Lys Thr Ser Gly Val Ala

35 40 45

Glu Phe Gly Gln Leu Pro Met Leu Gln Ile Asp Gly His Asn Leu Val

50 55 60

Gln Ser Arg Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Leu Arg Arg Ala Gly Leu Leu

65 70 75 80

Ser His Asp Leu Phe Glu Leu Tyr Gln Asp Glu Ser Leu Val Gly Tyr

85 90 95

Leu Asp Asp Ile Gly Gln Ile Ile Ala Lys Phe Val Phe Val Asp Lys

100 105 110

Asp Phe Glu Gly Leu Ala Lys Phe Asn Gln Glu Gln Leu Pro Glu Lys

115 120 125

Leu Arg Ile Leu Glu Arg Arg Leu Asn Pro Ser Asn Thr His Ser Val

130 135 140

Gly Asn Ser Ile Ser His Ala Asp Phe Val Leu Phe Gln Phe Ile His

145 150 155 160

Asp Tyr Phe Leu Arg Pro Leu Lys Ala Glu Gln Leu Arg Pro Ile Leu

165 170 175

Glu Ala Ser Ala Pro Arg Leu Ile Gln Phe Ala Asp Asn Phe Lys Asn

180 185 190

Ala Ser His Asn Ile Ser Ala Tyr Leu Ala Thr Arg Ala Glu Ser Gln

195 200 205

Phe Leu Val Pro Arg Gly Ser Met Glu Asn Leu Phe Cys Phe Val Cys

210 215 220

Met Leu Phe Ile Ile Lys Tyr Gly Ala Val Asn Ala Asp Cys Gly Ile

225 230 235 240

Val Ser Lys Asp Asp Trp Asp Gly Leu Thr Pro Val His Val Glu Tyr

245 250 255

Leu Asn Arg Pro Val Gln Leu Val Ile Ile Gln His Thr Asp Thr Pro

260 265 270

Pro Cys Leu Thr Asp Asn Ala Cys Ser Ala Arg Val Arg Ser Ile Gln

275 280 285

Asp Tyr His Met Asp Thr Leu Lys Tyr Trp Asp Ile Gly Ser Ala Phe

290 295 300

Leu Ile Gly Gly Asn Ala Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Val His

305 310 315 320

Val Ser Val Pro Thr His Ala Tyr Asn Arg Lys Ala Leu Arg Ile Thr

325 330 335

Leu Ile Gly Asn Tyr Asn Ser His Gln Pro Thr Thr Glu Gln Ile Asp

340 345 350

Ala Leu Lys Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Ser Asn Gly His Leu Asp

355 360 365

Ser Asn Tyr Lys Ile Val Gly His Arg Gln Leu Met Ala Thr Asp Ser

370 375 380

Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Leu Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu

385 390 395 400

Glu Asn Val Asp Ser Tyr Lys Gln

405

<210> 12

<211> 408

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> INIT_MET

<223> 成熟肽序列以起始密碼子甲硫氨酸開始

<220>

<221> SIGNAL

<222> (2)...(21)

<223> 信號序列的范圍（前肽）

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (254)...(259)

<223> 人工增添組凝血酶酶切位點

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (260)...(408)

<223> 人工增添GST-標簽

<400> 12

Met Glu Asn Leu Phe Cys Phe Val Cys Met Leu Phe Ile Ile Lys Tyr

1 5 10 15

Gly Ala Val Asn Ala Asp Cys Gly Ile Val Ser Lys Asp Asp Trp Asp

20 25 30

Gly Leu Thr Pro Val His Val Glu Tyr Leu Asn Arg Pro Val Gln Leu

35 40 45

Val Ile Ile Gln His Thr Asp Thr Pro Pro Cys Leu Thr Asp Asn Ala

50 55 60

Cys Ser Ala Arg Val Arg Ser Ile Gln Asp Tyr His Met Asp Thr Leu

65 70 75 80

Lys Tyr Trp Asp Ile Gly Ser Ala Phe Leu Ile Gly Gly Asn Ala Lys

85 90 95

Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Val His Val Ser Val Pro Thr His Ala

100 105 110

Tyr Asn Arg Lys Ala Leu Arg Ile Thr Leu Ile Gly Asn Tyr Asn Ser

115 120 125

His Gln Pro Thr Thr Glu Gln Ile Asp Ala Leu Lys Ser Leu Leu Arg

130 135 140

Cys Gly Val Ser Asn Gly His Leu Asp Ser Asn Tyr Lys Ile Val Gly

145 150 155 160

His Arg Gln Leu Met Ala Thr Asp Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn

165 170 175

Leu Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Tyr Lys

180 185 190

Gln Leu Val Pro Arg Gly Ser Met Ala His Thr Arg Phe Val Tyr Phe

195 200 205

Asp Gly Phe Gly Arg Gly Glu Val Thr Arg Leu Ile Leu Lys His Leu

210 215 220

Gly Gln Glu Phe Glu Asp Tyr Arg His Thr Phe Glu Ser Trp Gly Lys

225 230 235 240

Glu Lys Thr Ser Gly Val Ala Glu Phe Gly Gln Leu Pro Met Leu Gln

245 250 255

Ile Asp Gly His Asn Leu Val Gln Ser Arg Ala Ile Glu Lys Tyr Leu

260 265 270

Leu Arg Arg Ala Gly Leu Leu Ser His Asp Leu Phe Glu Leu Tyr Gln

275 280 285

Asp Glu Ser Leu Val Gly Tyr Leu Asp Asp Ile Gly Gln Ile Ile Ala

290 295 300

Lys Phe Val Phe Val Asp Lys Asp Phe Glu Gly Leu Ala Lys Phe Asn

305 310 315 320

Gln Glu Gln Leu Pro Glu Lys Leu Arg Ile Leu Glu Arg Arg Leu Asn

325 330 335

Pro Ser Asn Thr His Ser Val Gly Asn Ser Ile Ser His Ala Asp Phe

340 345 350

Val Leu Phe Gln Phe Ile His Asp Tyr Phe Leu Arg Pro Leu Lys Ala

355 360 365

Glu Gln Leu Arg Pro Ile Leu Glu Ala Ser Ala Pro Arg Leu Ile Gln

370 375 380

Phe Ala Asp Asn Phe Lys Asn Ala Ser His Asn Ile Ser Ala Tyr Leu

385 390 395 400

Ala Thr Arg Ala Glu Ser Gln Phe

405

<210> 13

<211> 181

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> INIT_MET

<223> 成熟肽序列以起始密碼子甲硫氨酸開始

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (174)...(181)

<223> 人工增添Flag標簽

<400> 13

Met Asp Cys Gly Ile Val Ser Lys Asp Asp Trp Asp Gly Leu Thr Pro

1 5 10 15

Val His Val Glu Tyr Leu Asn Arg Pro Val Gln Leu Val Ile Ile Gln

20 25 30

His Thr Asp Thr Pro Pro Cys Leu Thr Asp Asn Ala Cys Ser Ala Arg

35 40 45

Val Arg Ser Ile Gln Asp Tyr His Met Asp Thr Leu Lys Tyr Trp Asp

50 55 60

Ile Gly Ser Ala Phe Leu Ile Gly Gly Asn Ala Lys Val Tyr Glu Gly

65 70 75 80

Ser Gly Trp Val His Val Ser Val Pro Thr His Ala Tyr Asn Arg Lys

85 90 95

Ala Leu Arg Ile Thr Leu Ile Gly Asn Tyr Asn Ser His Gln Pro Thr

100 105 110

Thr Glu Gln Ile Asp Ala Leu Lys Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Ser

115 120 125

Asn Gly His Leu Asp Ser Asn Tyr Lys Ile Val Gly His Arg Gln Leu

130 135 140

Met Ala Thr Asp Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Leu Ile Arg Arg

145 150 155 160

Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Tyr Lys Gln Asp Tyr Lys

165 170 175

Asp Asp Asp Asp Lys

180

<210> 14

<211> 181

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> INIT_MET

<223> 成熟肽序列以起始密碼子甲硫氨酸開始

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (2)...(9)

<223> 人工增添Flag標簽

<400> 14

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Cys Gly Ile Val Ser Lys

1 5 10 15

Asp Asp Trp Asp Gly Leu Thr Pro Val His Val Glu Tyr Leu Asn Arg

20 25 30

Pro Val Gln Leu Val Ile Ile Gln His Thr Asp Thr Pro Pro Cys Leu

35 40 45

Thr Asp Asn Ala Cys Ser Ala Arg Val Arg Ser Ile Gln Asp Tyr His

50 55 60

Met Asp Thr Leu Lys Tyr Trp Asp Ile Gly Ser Ala Phe Leu Ile Gly

65 70 75 80

Gly Asn Ala Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Val His Val Ser Val

85 90 95

Pro Thr His Ala Tyr Asn Arg Lys Ala Leu Arg Ile Thr Leu Ile Gly

100 105 110

Asn Tyr Asn Ser His Gln Pro Thr Thr Glu Gln Ile Asp Ala Leu Lys

115 120 125

Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Ser Asn Gly His Leu Asp Ser Asn Tyr

130 135 140

Lys Ile Val Gly His Arg Gln Leu Met Ala Thr Asp Ser Pro Gly Arg

145 150 155 160

Lys Leu Tyr Asn Leu Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val

165 170 175

Asp Ser Tyr Lys Gln

180

<210> 15

<211> 200

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> INIT_MET

<223> 成熟肽序列以起始密碼子甲硫氨酸開始

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (194)...(201)

<223> 人工增添Flag標簽

<220>

<221> SIGNAL

<222> (2)...(21)

<223> 信號序列的范圍（前肽）

<400> 15

Met Glu Asn Leu Phe Cys Phe Val Cys Met Leu Phe Ile Ile Lys Tyr

1 5 10 15

Gly Ala Val Asn Ala Asp Cys Gly Ile Val Ser Lys Asp Asp Trp Asp

20 25 30

Gly Leu Thr Pro Val His Val Glu Tyr Leu Asn Arg Pro Val Gln Leu

35 40 45

Val Ile Ile Gln His Thr Asp Thr Pro Pro Cys Leu Thr Asp Asn Ala

50 55 60

Cys Ser Ala Arg Val Arg Ser Ile Gln Asp Tyr His Met Asp Thr Leu

65 70 75 80

Lys Tyr Trp Asp Ile Gly Ser Ala Phe Leu Ile Gly Gly Asn Ala Lys

85 90 95

Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp Val His Val Ser Val Pro Thr His Ala

100 105 110

Tyr Asn Arg Lys Ala Leu Arg Ile Thr Leu Ile Gly Asn Tyr Asn Ser

115 120 125

His Gln Pro Thr Thr Glu Gln Ile Asp Ala Leu Lys Ser Leu Leu Arg

130 135 140

Cys Gly Val Ser Asn Gly His Leu Asp Ser Asn Tyr Lys Ile Val Gly

145 150 155 160

His Arg Gln Leu Met Ala Thr Asp Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn

165 170 175

Leu Ile Arg Arg Trp Pro Glu Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Tyr Lys

180 185 190

Gln Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

195 200

<210> 16

<211> 202

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> INIT_MET

<223> 成熟肽序列以起始密碼子甲硫氨酸開始

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (2)...(9)

<223> 人工增添Flag標簽

<220>

<221> SIGNAL

<222> (10)...(30)

<223> 信號序列的范圍（前肽）

<400> 16

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Glu Asn Leu Phe Cys Phe

1 5 10 15

Val Cys Met Leu Phe Ile Ile Lys Tyr Gly Ala Val Asn Ala Asp Cys

20 25 30

Gly Ile Val Ser Lys Asp Asp Trp Asp Gly Leu Thr Pro Val His Val

35 40 45

Glu Tyr Leu Asn Arg Pro Val Gln Leu Val Ile Ile Gln His Thr Asp

50 55 60

Thr Pro Pro Cys Leu Thr Asp Asn Ala Cys Ser Ala Arg Val Arg Ser

65 70 75 80

Ile Gln Asp Tyr His Met Asp Thr Leu Lys Tyr Trp Asp Ile Gly Ser

85 90 95

Ala Phe Leu Ile Gly Gly Asn Ala Lys Val Tyr Glu Gly Ser Gly Trp

100 105 110

Val His Val Ser Val Pro Thr His Ala Tyr Asn Arg Lys Ala Leu Arg

115 120 125

Ile Thr Leu Ile Gly Asn Tyr Asn Ser His Gln Pro Thr Thr Glu Gln

130 135 140

Ile Asp Ala Leu Lys Ser Leu Leu Arg Cys Gly Val Ser Asn Gly His

145 150 155 160

Leu Asp Ser Asn Tyr Lys Ile Val Gly His Arg Gln Leu Met Ala Thr

165 170 175

Asp Ser Pro Gly Arg Lys Leu Tyr Asn Leu Ile Arg Arg Trp Pro Glu

180 185 190

Trp Leu Glu Asn Val Asp Ser Tyr Lys Gln

195 200