本發明屬于生物技術或醫學領域，更具體的，本發明涉及Hsp27在舌癌化療耐受診治中的應用。

背景技術：

熱休克蛋白是一組在進化上高度保守的蛋白質，除高熱外，缺血、組織損傷、病毒或細菌感染等也會產生，其在許多領域證實能發揮各種重要功能。以往人們對于熱休克蛋白27(Heat shock protein 27，Hsp27)的研究主要集中在Hsp27抗凋亡、抗氧自由基等方面的作用(Small heat shock proteins and protection against injury.Ann N Y Acad Sci.199930；874：66-8.Review)；目前還沒有發現對Hsp27在舌癌化療耐受診治中的應用有了解和深入的研究。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明對Hsp27在舌癌化療耐受診治中的應用進行了深入的研究，不僅可以為舌癌化療耐受機制研究提供新的資料，而且為舌癌化療敏感性預測提供新的檢測標志物，以及為開發基于Hsp27為靶點的新治療策略提供理論依據。

一種Hsp27在舌癌化療耐受診治中的應用，在此應用中，化療能誘導舌癌細胞和患者血清中Hsp27升高。

進一步地，Hsp27能增加舌癌細胞化療的耐受性。

進一步地，細胞外Hsp27能活化舌癌細胞中NF-κB信號。

進一步地，細胞外Hsp27通過與TLR5結合激活NF-κB信號。

進一步地，細胞內Hsp27能抑制BAX和BIM功能抑制化療誘導的凋亡信號。

進一步地，Hsp27與舌癌患者預后呈負相關。

本發明的有益效果在于：

本發明首次證實了化療藥物處理能上調舌癌細胞培養上清中Hsp27蛋白水平和舌癌患者血清中Hsp27蛋白水平，且Hsp27在舌癌化療耐受細胞中表達高于敏感細胞；干擾下調Hsp27表達增加耐藥細胞的化療敏感性，而過表達Hsp27則增加舌癌細胞的化療耐受性；在機制上，細胞外Hsp27可通過TLR5活化NF-κB信號介導化療耐受，細胞內Hsp27抑制BAX和BIM功能抑制化療誘導的凋亡信號，同時發現舌癌組織中Hsp27高表達與舌癌患者預后呈負相關。從而本發明不僅為舌癌化療耐受機制研究提供新的資料，而且為舌癌化療敏感性預測提供新的檢測標志物，以及為開發基于Hsp27為靶點的新治療策略提供理論依據。

附圖說明

圖1A-圖1B為實施例1的實驗結果圖；

圖2A-圖2C為實施例2的實驗結果圖；

圖3A-圖3B為實施例3的實驗結果圖；

圖4A-圖4D為實施例4的實驗結果圖；

圖5A-圖5E為實施例5的實驗結果圖；

圖6A-圖6C為實施例6的實驗結果圖；

圖7A-圖7C為實施例7的實驗結果圖。

具體實施方式

下面將結合附圖，對本發明進行清楚、完整地描述。

實施例1：化療能誘導舌癌細胞和患者血清中Hsp27升高

結果顯示，耐藥細胞Tca8113/PYM中Hsp27蛋白水平明顯高于正常口腔粘膜細胞Hacat和Tca8113、SCC-25、SCC-15、SCC-9及CAL-27等化療相對較敏感的舌癌細胞(圖1A)，同時耐藥細胞培養液中Hsp27蛋白水平亦明顯高于Hacat、Tca8113、SCC-25、SCC-15、SCC-9及CAL-27細胞培養液(圖1A)；我們分別用PYM(80mg/L)和cDDP(5mg/L)處理上述細胞，發現化療均能不同程度的誘導各細胞中和細胞培養液中Hsp27蛋白水平升高(圖1A)；此外，我們檢測了30例正常健康人和50例舌癌患者血清中Hsp27的蛋白水平，50例舌癌患者血清包括28例首診患者血清和22例經過以PYM和/或cDDP化療前后的患者血清，發現舌癌患者血清中Hsp27蛋白水平明顯高于正常健康患者血清，同一舌癌患者中化療后血清中的Hsp27蛋白水平明顯高于化療前(圖1B)，提示化療本身可能上調舌癌細胞中的Hsp27表達。

實施例2：Hsp27增加舌癌細胞化療耐受性的體外實驗

為了觀察Hsp27在舌癌化療耐受中的作用，我們通過shRNA技術沉默Tca8113/PYM細胞中Hsp27表達，其中sh-1#和sh-2#干擾效果最明顯(圖2A)，故我們選取sh-1#和sh-2#進行后續實驗，建立Hsp27穩定低表達細胞系Tca8113/PYM-sh-1#和Tca8113/PYM-sh-2#以及對照細胞系Tca8113/PYM-sh-con，用MTS實驗檢測藥物敏感性，發現干擾Hsp27表達后，Tca8113/PYM細胞對PYM和cDDP的敏感性增加(圖2A)；同時，為了觀察分泌的Hsp27是否參與舌癌細胞的化療耐受，用Hsp27中和抗體處理Tca8113/PYM細胞后，同樣能增加化療敏感性(圖2A)。反之，通過轉染pLEX-Hsp27載體在Tca8113和SCC-25細胞中建立Hsp27穩定過表達細胞系以及相應對照細胞系，發現過表達Hsp27后，Tca8113(圖2B)和SCC-25(圖2C)細胞對化療的敏感性降低；同時，用重組的人Hsp27蛋白(rhHsp27)處理亦能增加Tca8113(圖2B)和SCC-25(圖2C)細胞的化療耐受性。

實施例3：Hsp27增加舌癌細胞化療耐受性的體內實驗

上述體外細胞水平實驗表明Hsp27能參與舌癌細胞的化療耐受，在此，我們在裸鼠體內實驗進一步驗證Hsp27在舌癌化療中的作用，將Tca8113/pLEX-con和Tca8113/pLEX-Hsp27細胞接種于裸鼠前腋下成瘤后，接種后第15天開始，分別給予腹腔注射等量生理鹽水(0.2ml)、PYM(30mg/kg)和cDDP(3mg/kg)，每3天1次，共處理10次，每3天測量一次腫瘤的長徑及寬徑而計算出腫瘤體積，并繪制成腫瘤生長曲線，實驗結束后斷頸處死裸鼠，剝離腫瘤，測量末次體積并稱重。結果顯示過表達Hsp27能增加Tca8113細胞的體內化療耐受性，在化療條件下，Hsp27過表達組的腫瘤體積大于對照組(圖3A)，瘤重重于對照組(圖3B)。

實施例4：細胞外Hsp27活化舌癌細胞中NF-κB信號

通過NF-κB活性的報告基因實驗和WB檢測相關蛋白水平發現耐藥細胞Tca81113/PYM中NF-κB活性高于Hacat、Tca8113、SCC-25、SCC-15、SCC-9及CAL-27細胞，同時，Tca8113/PYM的核p65蛋白水平高于其他細胞，且Tca8113/PYM中NF-κB經典靶基因Survivin和IL-6的mRNA和蛋白水平高于基他細胞(圖4A，p<0.0001)，提示耐藥細胞Tca8113/PYM細胞中NF-κB信號通路活化。再者，發現Tca8113/PYM細胞中p-IκBα水平高于其他細胞，而總IκBα蛋白水平則低于其他細胞(圖4A)；干擾沉默Hsp27表達和用Hsp27中和抗體處理均能下調Tca8113/PYM細胞中NF-κB活性和核p65蛋白水平，同時下調NF-κB靶基因Survivin和IL6表達(圖4B，p<0.0001)；而過表達Hsp27和用rhHsp27處理則能上調Tca8113和SCC-25細胞的NF-κB活性和p65的核蛋白水平，以及Survivin和IL6表達水平(圖4C，p<0.0001)。再者，在舌癌組織中Hsp27蛋白水平與p65核移位水平呈正相關，而與IκBα蛋白水平呈負相關(圖4C，圖4D)。為了觀察細胞外Hsp27是否通過活化NF-κB信號而在舌癌細胞中發揮功能，我們采用轉染IκBα顯性負突變載體(pBabe-IκBα)或使用NF-κB抑制劑BAY11-7082(通過抑制IκBα磷酸化而抑制NF-κB信號)處理Tca8113和SCC-25細胞后，再用rhHsp27處理，發現轉染pBabe-IκBα和使用BAY11-7082處理均能明顯逆轉rhHsp27誘導舌癌細胞中NF-κB活化(圖4D，p<0.0001)。這些實驗結果提示分泌的Hsp27能通過下調IκBα而活化舌癌細胞中NF-κB信號。

實施例5：細胞外Hsp27通過與TLR5結合激活NF-κB信號

經檢測發現舌癌細胞中TLR5蛋白水平高于正常口腔粘膜上皮細胞(圖5A)；采用sh-RNA技術干擾下調Tca8113/PYM細胞中TLR5表達，其中sh-3#和sh-4#干擾效果較好，選取sh-3#和sh-4#用于進一步實驗(圖5B)；Tca8113/PYM細胞中，干擾TLR5表達后，NF-κB活性、核p65蛋白水平和IκBα磷酸化水平降低，而總IκBα水平升高，作為NF-KB靶基因Survivin和IL6的mRNA表達水平降低(圖5C，p<0.0001)；干擾Tca8113和SCC-25細胞中TLR5表達后，再用rhHsp27處理，發現干擾沉默TLR5表達能逆轉rhHsp27誘導的IκBα磷酸化和總IκBα蛋白水平降低、NF-κB活性和核p65蛋白水平升高、以及Survivin和IL-6表達升高(圖5D，p<0.0001)；進而，我們采用免疫共沉淀實驗觀察Hsp27是否可以直接與TLR5相互作用，用rhHsp27(10ug/ml)處理Tca8113和SCC-25細胞1h后，抽提細胞總蛋白，先用Hsp27抗體沉淀蛋白后，用TLR5抗體行western blot實驗發現Hsp27能與TLR5結合，同樣地，用TLR5抗體沉淀蛋白后，用Hsp27抗體行westernblot實驗發現TLR5能與Hsp27結合(圖5E)。這些實驗結果提示外源性的Hsp27能與TLR5結合，從而在活化舌癌細胞中NF-κB信號。

實施例6：細胞內Hsp27抑制BAX和BIM功能抑制化療誘導的凋亡信號

為了觀察Hsp27在化療誘導凋亡中的作用，首先檢測了Hsp27表達干預條件下化療對凋亡相關分子表達和活性的影響，發現無論Hsp27表達干預與否，即使在Tca8113/PYM耐藥細胞中，化療能誘導舌癌細胞中BAX、BAD和BIM的表達、線粒體上BAX、BAD和BIM水平的增加、以及細胞質中cytochromeC(Cyto C)水平的升高(圖6A-圖6C)；但過表達Hsp27明顯抑制Tca8113和SCC-25細胞中化療誘導線粒體上BAX和BIM水平的升高，同時抑制化療誘導細胞質中Cyto C水平的升高(圖6A)；在Tca8113/PYM細胞中，干擾Hsp27表達則增加化療誘導線粒體上BAX和BIM水平的升高，同時增加化療誘導細胞質中Cyto C水平的升高(圖6B)；為了觀察Hsp27是否通過結合BAX和BIM從而抑制化療誘導凋亡條件下BAX和BIM向線粒體移位，通過免疫共沉淀實驗發現在Tca8113和SCC-25細胞中，Hsp27能與BAX和BIM結合，且其結合水平在化療條件下隨著Hsp27表達增加而增加(圖6C)。這些結果提示胞內Hsp27可能通過與BAX和BIM結合而抑制化療條件下其向線粒體移位，從而抑制線粒體釋放Cyto發明C而誘導細胞凋亡。

實施例7：Hsp27與舌癌患者預后呈負相關

我們在84例來源于廣州醫科大學附屬腫瘤醫院(患者具有預后隨訪資料)的經有PYM和/或cDDP化療的舌癌組織中用免疫組化方法檢測Hsp27及其相關分子的蛋白表達。發現有48舌癌組織例呈現Hsp27高表達，36例舌癌組織呈現Hsp27低表達(圖7A)。免疫組化顯示TLR5在舌癌組織中普遍呈現高豐度表達狀態(圖7A)。無論Hsp27表達豐度的高低，化療均能誘導舌癌組織細胞中BAX和BIM的表達，并發現Hsp27高表達與p65核移位呈正相關，而與IκBα蛋白水平和Caspase3活化呈負相關(圖7A和圖7B)。且根據Hsp27蛋白水平進行預后分析發現Hsp27高表達的舌癌患者預后較差(圖7C)。

上文所列出的一系列的詳細說明僅僅是針對本發明的可行性實施例的具體說明，它們并非用以限制本發明的保護范圍，凡未脫離本發明技藝精神所作的等效實施例或變更均應包含在本發明的保護范圍之內。