本發明屬于發酵技術領域，特別是涉及一種利用展青霉菌發酵生產灰黃霉素的培養基和培養方法。
背景技術：
灰黃霉素是青霉菌發酵液的菌絲體中分離得到的一種含有氯的次級代謝產物。它是屬于非多烯類的抗真菌抗生素。灰黃霉素于1958年開始用于醫學臨床，主要用于治療皮膚淺層絲狀真菌感染，尤其是對小芽孢菌、紅色癬菌具有良好的抑制效果。在農業上，灰黃霉素也被用于真菌病害防治。
目前，國內采用發酵模式生產灰黃霉素，其存在的主要問題有以下幾點：
1 工業化大生產發酵水平較低，其發酵水平維持在25000ug/ml左右。
2 國內缺少關于規模化大生產春雷霉素完整的發酵工藝文獻報道，并且相關的文獻報道以試驗為主，不能夠為大生產模式提供有效地技術支持。
3 春雷霉素大生產發酵周期長，超過了260h左右，能耗比較高。
技術實現要素：
本發明的目的就在于克服上述現有技術的缺陷，提供一種可有效提高發酵單位，降低能耗，縮短發酵周期，同時最大限度的降低原輔料對發酵單位的影響，降低生產成本，且原輔料來源不受環境影響，保證其供應充足，實現灰黃霉素穩定、高效生產的利用展青霉菌發酵生產灰黃霉素的培養基。
本發明的另一目的是提供利用上述培養基生產灰黃霉素的培養方法。
為實現上述目的所采取的技術方案為：
一種利用展青霉菌發酵生產灰黃霉素的培養基，其特征在于包括種子培養基和發酵培養基，其中
所述種子培養基的組成為：
葛根粉7～11g/L、大力士甜高粱12～16g/L、葡萄糖5～9g/L、白酒糟6～10g/L、玉米漿11～15ml/L、魚粉10～14g/L、棉籽油8～12ml/L、硫酸銨0.4～0.8g/L、輕質碳酸鈣1～5g/L；
所述發酵培養基的組成為：
葛根粉9～14g/L、大力士甜高粱14～18g/L、葡萄糖7～11g/L、白酒糟8～12g/L、玉米漿13～17ml/L、魚粉12～16g/L、棉籽油11～15ml/L、硫酸銨0.5～0.9g/L、輕質碳酸鈣2～6g/L；磷酸二氫鉀0.05～0.09g/L、硫酸鎂0.03～0.07g/L、硫酸亞鐵0.006～0.01g/L、氯化鈉0.04～0.08g/L。
一種利用上述培養基發酵生產灰黃霉素的培養方法，其特征在于工藝步驟為：
1） 種子培養：首先將種子培養基滅菌并冷卻至20～25℃，并用無菌空氣保壓，然后在火焰保護下，將已經培養好的展青霉菌母瓶發酵液接入種子培養基中進行種子培養，至菌體濃度32～34%、培養時間40～45h移種；
2） 發酵培養：先將發酵培養基滅菌，冷卻至20～25℃，并用無菌空氣保壓，然后將培養好的種子液移入發酵培養基進行發酵培養，至菌體濃度35～39%、發酵周期不超過250h，化學效價＞30000ug/ml時終止發酵。
所述種子培養基滅菌后的質量要求為：氨基氮20～40mg/L、還原糖2～4g/100ml；
所述發酵培養基滅菌后的質量要求為：氨基氮40～60mg/L、還原糖4～6g/100ml。
所述培養好的展青霉菌母瓶發酵液質量要求為：菌體濃度20～30%；鏡檢無雜菌。
所述種子培養條件為：罐壓0.03～0.06MPa；罐溫28～29℃；空氣流量：30～50m3/h；攪拌轉速60～80r/min。
所述發酵培養條件為：
a 培養基初始pH：發酵培養基滅菌后pH控制在6～7，
b 溫度：培養溫度28～29℃，
c 攪拌轉速：轉速控制在100～120r/min，
d 壓力控制：罐壓0.05～0.06MPa，
e pH控制：發酵過程中pH控制在6～7，
f 空氣流量：200～300m3/h，
h 溶氧控制：
發酵前90h內，不控制溶氧，
91～160h，溶氧控制在40%以上，
161～發酵結束：溶氧控制在30%以上。
所述發酵過程中采用流加法進行補料，補料包括補糖、補水、補硫酸銨和pH控制，其中
a 補糖工藝控制：
發酵100～200h，當還原糖含量＜2g/100ml時，補入糊精，控制發酵液中還原糖含量為2.0～2.5g/100ml，
發酵201 h～發酵結束，當還原糖含量＜1.5g/100ml，補入糊精，控制發酵液中還原糖含量為1.5～2.0g/100ml；
b補水工藝控制：
發酵前80h不用進行補水，
發酵81～200h，當菌體濃度高于45%時，加入滅菌水，控制發酵液菌體濃度在40～45%，每隔6～8h檢測發酵液菌體濃度，
發酵201h～發酵結束，當菌體濃度高于40%時，加入滅菌水，控制發酵液菌體濃度在35～40%，每隔6～8h檢測發酵液菌體濃度；
c 發酵過程pH控制：
發酵前80h，pH不進行控制，
發酵81～200h，當pH＜6.0，采用流加法加入10～20%的氫氧化鈉，調節pH至6～7，當pH＞7，采用流加法加入30%的鹽酸溶液，調節pH至6～7；
d 補硫酸銨：
在發酵120h和200h時補入10%的硫酸銨溶液，其用量控制在發酵液體積的0.01～0.03%。
本發明的技術優勢體現在：
1 本發明確認了展青霉菌發酵生產灰黃霉素的種子培養基、發酵培養基中碳源、氮源和最佳配伍比例。
2 本發明對種子培養、發酵培養的工藝進行了詳細的闡述，確認了灰黃霉素最佳的發酵工藝和控制參數。通過本發明發酵生產灰黃霉素，其發酵單位達到30000ug/ml以上，同國內技術相比，發酵單位提高了20%以上；發酵周期控制在250h以內，降低了發酵能耗。
3 本發明培養基中加入白酒糟，因其含有豐富的氨基酸和促生長因子，可以部分替代魚粉，降低了生產成本。
4 本發明培養基中加入葛根粉代替淀粉，降低了發酵液的黏度，避免了高溫滅菌過程中出現的糊化現象，減少了毒性物質的釋放；葛根粉中的碳水化合物含量達到了88%，能夠滿足灰黃霉素生物合成中所需的乙酸用量。
5 本發明適用于工業化規模化發酵生產灰黃霉素。
具體實施方法
下面用實例予以說明本發明，應該理解的是，實例是用于說明本發明而不是對本發明的限制。本發明的范圍與核心內容依據權利要求書加以確定。
下述實施例的菌種選用：生產使用的菌種來源為展青霉菌母瓶發酵液。母瓶發酵液質量要求為：菌體濃度20～30%；鏡檢無雜菌。
葛根淀粉來源：將塊狀葛根送入碎解機中碎解。碎解機的篩網孔徑選取2-3毫米規格即可。
白酒糟：白酒發酵的副產物，蛋白含量應＞14%，水分含量＜1.5%。
實施例1
種子培養：種子培養基體積10m3。
葛根粉70kg、大力士甜高粱120kg、葡萄糖50kg、白酒糟60 kg、玉米漿110L、魚粉100 kg、棉籽油80L、硫酸銨4kg、輕質碳酸鈣10kg。
首先將種子培養基滅菌并冷卻至20℃，并用無菌空氣保壓，培養基滅菌后質量為：氨基氮20mg/L、還原糖2g/100ml。然后在火焰保護下，將已經培養好的展青霉菌母瓶發酵液按照30L的接種量接入種子培養基中進行種子培養。
種子培養條件為：罐壓0.03～0.06MPa；罐溫28～29℃；空氣流量：30m3/h；攪拌轉速60r/min。至菌體濃度32%、培養時間40h移種。
發酵培養：發酵培養基體積100m3。
葛根粉900kg、大力士甜高粱1400kg、葡萄糖700kg、白酒糟800 kg、玉米漿1300L、魚粉1200kg、棉籽油1100L、硫酸銨50kg、輕質碳酸鈣200kg；磷酸二氫鉀5kg、硫酸鎂3kg、硫酸亞鐵0.6kg、氯化鈉4kg。
先將發酵培養基滅菌，冷卻至20℃，并用無菌空氣保壓，發酵培養基滅菌后的質量為：氨基氮40mg/L、還原糖4g/100ml。然后將培養好的種子液移入發酵培養基進行發酵培養。
發酵培養條件為：
a 培養基初始pH：發酵培養基滅菌后pH控制在6.9；
b 溫度：培養溫度28～29℃，
c 攪拌轉速：轉速控制在100r/min，
d 壓力控制：罐壓0.05～0.06MPa，
e pH控制：發酵過程中pH控制在6～7，
f 空氣流量：200m3/h，
h 溶氧控制：
發酵前90h內，不控制溶氧，
91～160h，溶氧控制在40%以上，
161～發酵結束：溶氧控制在30%以上。
發酵培養結束，菌體濃度35%、發酵周期不超過241h，化學效價30127ug/ml。實施例2
種子培養：種子培養基體積10m3。
葛根粉80kg、大力士甜高粱130kg、葡萄糖60kg、白酒糟70 kg、玉米漿120L、魚粉110 kg、棉籽油90L、硫酸銨5kg、輕質碳酸鈣20kg。
首先將種子培養基滅菌并冷卻至21℃，并用無菌空氣保壓，培養基滅菌后質量為：氨基氮25mg/L、還原糖2.5g/100ml。然后在火焰保護下，將已經培養好的展青霉菌母瓶發酵液按照32L的接種量接入種子培養基中進行種子培養。
種子培養條件為：罐壓0.03～0.06MPa；罐溫28～29℃；空氣流量：35m3/h；攪拌轉速65r/min。至菌體濃度32.5%、培養時間41h移種。
發酵培養：發酵培養基體積100m3。
葛根粉1000kg、大力士甜高粱1500kg、葡萄糖800kg、白酒糟900 kg、玉米漿1400L、魚粉1300kg、棉籽油1200L、硫酸銨60kg、輕質碳酸鈣300kg；磷酸二氫鉀6kg、硫酸鎂4kg、硫酸亞鐵0.7kg、氯化鈉5kg。
先將發酵培養基滅菌，冷卻至21℃，并用無菌空氣保壓，發酵培養基滅菌后的質量為：氨基氮45mg/L、還原糖4.5g/100ml。然后將培養好的種子液移入發酵培養基進行發酵培養。
發酵培養條件為：
a 培養基初始pH：發酵培養基滅菌后pH控制在6.7；
b 溫度：培養溫度28～29℃，
c 攪拌轉速：轉速控制在105r/min，
d 壓力控制：罐壓0.05～0.06MPa，
e pH控制：發酵過程中pH控制在6～7；
f 空氣流量：220m3/h，
h 溶氧控制：
發酵前90h內，不控制溶氧，
91～160h，溶氧控制在40%以上，
161～發酵結束：溶氧控制在30%以上。
發酵培養結束，菌體濃度36%、發酵周期不超過242h，化學效價30291ug/ml。
實施例3
種子培養：種子培養基體積10m3。
葛根粉90kg、大力士甜高粱140kg、葡萄糖70kg、白酒糟80 kg、玉米漿130L、魚粉120 kg、棉籽油100L、硫酸銨6kg、輕質碳酸鈣30kg。
首先將種子培養基滅菌并冷卻至22℃，并用無菌空氣保壓，培養基滅菌后質量為：氨基氮30mg/L、還原糖3g/100ml。然后在火焰保護下，將已經培養好的展青霉菌母瓶發酵液按照35L的接種量接入種子培養基中進行種子培養。
種子培養條件為：罐壓0.03～0.06MPa；罐溫28～29℃；空氣流量：40m3/h；攪拌轉速70r/min。至菌體濃度33%、培養時間43h移種。
發酵培養：發酵培養基體積100m3。
葛根粉1100kg、大力士甜高粱1600kg、葡萄糖900kg、白酒糟1000 kg、玉米漿1500L、魚粉1400kg、棉籽油1300L、硫酸銨70kg、輕質碳酸鈣400kg；磷酸二氫鉀7kg、硫酸鎂5kg、硫酸亞鐵0.8kg、氯化鈉6kg。
先將發酵培養基滅菌，冷卻至23℃，并用無菌空氣保壓，發酵培養基滅菌后的質量為：氨基氮50mg/L、還原糖5g/100ml。然后將培養好的種子液移入發酵培養基進行發酵培養。
發酵培養條件為：
a 培養基初始pH：發酵培養基滅菌后pH控制在6.5，
b 溫度：培養溫度28～29℃，
c 攪拌轉速：轉速控制在110r/min，
d 壓力控制：罐壓0.05～0.06MPa，
e pH控制：發酵過程中pH控制在6～7，
f 空氣流量：250m3/h，
h 溶氧控制：
發酵前90h內，不控制溶氧，
91～160h，溶氧控制在40%以上，
161～發酵結束：溶氧控制在30%以上。
發酵培養結束，菌體濃度37%、發酵周期不超過245h，化學效價30374ug/ml。
實施例4
種子培養：種子培養基體積10m3。
葛根粉100kg、大力士甜高粱150kg、葡萄糖80kg、白酒糟90 kg、玉米漿140L、魚粉130 kg、棉籽油110L、硫酸銨7kg、輕質碳酸鈣40kg。
首先將種子培養基滅菌并冷卻至24℃，并用無菌空氣保壓，培養基滅菌后質量為：氨基氮35mg/L、還原糖3.5g/100ml。然后在火焰保護下，將已經培養好的展青霉菌母瓶發酵液按照38L的接種量接入種子培養基中進行種子培養。
種子培養條件為：罐壓0.03～0.06MPa；罐溫28～29℃；空氣流量：45m3/h；攪拌轉速75r/min。至菌體濃度33.5%、培養時間44h移種。
發酵培養：發酵培養基體積100m3。
葛根粉1200kg、大力士甜高粱1700kg、葡萄糖1000kg、白酒糟1100 kg、玉米漿1600L、魚粉1500kg、棉籽油1400L、硫酸銨80kg、輕質碳酸鈣500kg；磷酸二氫鉀8kg、硫酸鎂6kg、硫酸亞鐵0.9kg、氯化鈉7kg。
先將發酵培養基滅菌，冷卻至24℃，并用無菌空氣保壓，發酵培養基滅菌后的質量為：氨基氮55mg/L、還原糖5.5g/100ml。然后將培養好的種子液移入發酵培養基進行發酵培養。
發酵培養條件為：
a 培養基初始pH：發酵培養基滅菌后pH控制在6.3，
b 溫度：培養溫度28～29℃，
c 攪拌轉速：轉速控制在115r/min，
d 壓力控制：罐壓0.05～0.06MPa，
e pH控制：發酵過程中pH控制在6～7，
f 空氣流量：280m3/h，
h 溶氧控制：
發酵前90h內，不控制溶氧，
91～160h，溶氧控制在40%以上，
161～發酵結束：溶氧控制在30%以上。
發酵培養結束，菌體濃度37%、發酵周期不超過245h，化學效價30304ug/ml。實施例5
種子培養：種子培養基體積10m3。
葛根粉140kg、大力士甜高粱160kg、葡萄糖90kg、白酒糟100kg、玉米漿150L、魚粉140kg、棉籽油120L、硫酸銨8kg、輕質碳酸鈣50kg。
首先將種子培養基滅菌并冷卻至25℃，并用無菌空氣保壓，培養基滅菌后質量為：氨基氮40mg/L、還原糖4g/100ml。然后在火焰保護下，將已經培養好的展青霉菌母瓶發酵液按照40L的接種量接入種子培養基中進行種子培養。
種子培養條件為：罐壓0.03～0.06MPa；罐溫28～29℃；空氣流量：50m3/h；攪拌轉速80r/min。至菌體濃度34%、培養時間45h移種。
發酵培養：發酵培養基體積100m3。
葛根粉1300kg、大力士甜高粱1800kg、葡萄糖1100kg、白酒糟1200 kg、玉米漿1700L、魚粉1600kg、棉籽油1500L、硫酸銨90kg、輕質碳酸鈣600kg；磷酸二氫鉀9kg、硫酸鎂7kg、硫酸亞鐵1kg、氯化鈉8kg。
先將發酵培養基滅菌，冷卻至25℃，并用無菌空氣保壓，發酵培養基滅菌后的質量為：氨基氮60mg/L、還原糖6g/100ml。然后將培養好的種子液移入發酵培養基進行發酵培養。
發酵培養條件為：
a 培養基初始pH：發酵培養基滅菌后pH控制在6.1，
b 溫度：培養溫度28～29℃，
c 攪拌轉速：轉速控制在120r/min，
d 壓力控制：罐壓0.05～0.06MPa，
e pH控制：發酵過程中pH控制在6～7，
f 空氣流量：300m3/h，
h 溶氧控制：
發酵前90h內，不控制溶氧，
91～160h，溶氧控制在40%以上，
161～發酵結束：溶氧控制在30%以上。
發酵培養結束，菌體濃度37%、發酵周期不超過245h，化學效價30127ug/ml。
對比實施例（培養工藝及控制參數依據實施例3）
種子培養：種子培養基體積10m3。
大米粉90kg、葡萄糖70kg、花生餅粉80 kg、玉米漿130L、黃豆餅粉120 kg、硫酸銨6kg、輕質碳酸鈣30kg。
首先將種子培養基滅菌并冷卻至22℃，并用無菌空氣保壓，培養基滅菌后質量為：氨基氮18mg/L、還原糖2g/100ml。然后在火焰保護下，將已經培養好的展青霉菌母瓶發酵液按照35L的接種量接入種子培養基中進行種子培養。
種子培養條件為：罐壓0.03～0.06MPa；罐溫28～29℃；空氣流量：40m3/h；攪拌轉速70r/min。至菌體濃度30%、培養時間44h移種。
發酵培養：發酵培養基體積100m3。
大米粉1100kg、葡萄糖900kg、花生餅粉800kg、玉米漿1200L、黃豆餅粉1000kg、硝酸鈉50kg、輕質碳酸鈣400kg；磷酸二氫鉀7kg、硫酸鎂5kg、硫酸亞鐵0.8kg、氯化鈉6kg。
先將發酵培養基滅菌，冷卻至23℃，并用無菌空氣保壓，發酵培養基滅菌后的質量為：氨基氮37mg/L、還原糖3.8g/100ml。然后將培養好的種子液移入發酵培養基進行發酵培養。
發酵培養條件為：
a 培養基初始pH：發酵培養基滅菌后pH控制在6.5，
b 溫度：培養溫度28～29℃，
c 攪拌轉速：轉速控制在110r/min，
d 壓力控制：罐壓0.05～0.06MPa，
e pH控制：發酵過程中pH控制在6～7，
f 空氣流量：250m3/h，
h 溶氧控制：
發酵前90h內，不控制溶氧，
91～160h，溶氧控制在40%以上，
161～發酵結束：溶氧控制在30%以上。
發酵培養結束，菌體濃度35%、發酵周期不超過264h，化學效價24761ug/ml。
上述實施例1-5中，發酵過程中采用流加法進行補料，補料包括補糖、補水、補硫酸銨和pH控制，其中
a 補糖工藝控制：
發酵100～200h，當還原糖含量＜2g/100ml時，補入糊精，控制發酵液中還原糖含量為2.0～2.5g/100ml，
發酵201 h～發酵結束，當還原糖含量＜1.5g/100ml，補入糊精，控制發酵液中還原糖含量為1.5～2.0g/100ml；
b補水工藝控制：
發酵前80h不用進行補水，
發酵81～200h，當菌體濃度高于45%時，加入滅菌水，控制發酵液菌體濃度在40～45%，每隔6～8h檢測發酵液菌體濃度，
發酵201h～發酵結束，當菌體濃度高于40%時，加入滅菌水，控制發酵液菌體濃度在35～40%，每隔6～8h檢測發酵液菌體濃度；
c 發酵過程pH控制：
發酵前80h，pH不進行控制，
發酵81～200h，當pH＜6.0，采用流加法加入10～20%的氫氧化鈉，調節pH至6～7，當pH＞7，采用流加法加入30%的鹽酸溶液，調節pH至6～7；
d 補硫酸銨：
在發酵120h和200h時補入10%的硫酸銨溶液，其用量控制在發酵液體積的0.01～0.03%。