本發屬于微生物發酵領域，尤其涉及一種紅豆杉固態發酵培養基及其制備方法和紅豆杉固態發酵方法。

背景技術：

紫杉烷類化合物是提取于高等裸子植物紅豆杉的樹皮、根和葉等部位的一類化合物，主要含有紫杉醇、三尖杉寧堿、10-DABⅢ、7-木糖基紫杉醇等，有許多已被證明具有細胞毒性和抗腫瘤活性，而用來提取紫杉醇等的天然紅豆杉資源有限，因而天然紫杉醇原料藥的生產和供應受到限制，遠遠不能滿足紫杉醇臨床的應用。

固態發酵(Solid-state fermentation，簡稱SSF)是指利用自然底物做碳源及能源，或利用惰性底物做固體支持物，其體系無水或接近于無水的任何發酵過程，固體發酵技術發展已久，應用廣泛。在古代中國就已經被應用在制曲釀酒、腌制食品、肥料堆積等方面。受科技發展的限制，在過去的很長一段時間內固體發酵技術都停留在一個比較原始落后的狀態，甚至在現代的工業生產上仍然在沿用這樣的發酵技術。在最近二十年間，關于固體發酵技術的研究和應用得到了迅速發展，人們在固態發酵領域的研究及其在資源環境、蛋白質飼料中的應用取得了進展，主要表現在生物飼料、生物燃料、生物農藥、生物轉化、生物解毒及生物修復等方面的應用。目前還沒有專利利用微生物和紅豆杉采用固體發酵技術，增加紅豆杉紫杉醇的含量。

固態發酵本身具有如下優點：培養基簡單且來源廣泛，多為便宜的天然基質或工業生產的下腳料；投資少，能耗低，技術較簡單；產物的產率較高；基質含水量低，可大大減少生物反應器的體積，不需要廢水處理，環境污染較少，后處理加工方便；發酵過程一般不需要嚴格的無菌操作；通氣一般可由氣體擴散或間歇通風完成，不需要連續通風，空氣一般也不需嚴格的無菌空氣。

所以為提高紫杉醇的產量及質量、降低紫杉醇的生產成本，可以對其進行固態發酵進行研發以滿足臨床日益增長的需求。

技術實現要素：

本發明的目的是為了提供一種提高紅豆杉紫杉醇產量、降低其生產成本的紅豆杉固態發酵培養基及其制備方法和紅豆杉固態發酵方法。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：一種紅豆杉固態發酵培養基包括A培養基和B培養基，其中A培養基包括如下重量份：紅豆杉枝葉粉末100份、麩皮40-50g份、豆粕4-5份、大米粉10份；

B培養基包括如下重量份：蛋白胨2份、酵母浸膏1-2份、氯化鈉5份、磷酸二氫鉀0.3份、硫酸鎂0.2份、葡萄糖8-10份、土豆汁，所述土豆汁體積與所述氯化鈉質量的比為20mL：1g。

進一步優選的，所述A培養基包括如下重量份：紅豆杉枝葉粉末100份、麩皮50g份、豆粕5份、大米粉10份；

所述B培養基包括如下重量份：：蛋白胨2份、酵母浸膏1份、氯化鈉5份、磷酸二氫鉀0.3份、硫酸鎂0.2份、葡萄糖10份、土豆汁，所述土豆汁體積與所述氯化鈉質量的比為20mL：1g。

上述紅豆杉固態發酵培養基的制備方法包括如下步驟：將紅豆杉粉末用甲醛熏蒸至少12h后與麩皮、豆粕、大米粉混合均勻即得A培養基；

將新鮮土豆去皮切塊，用5倍切塊土豆質量的水煮沸至少30min，然后用紗布過濾，濾液自然冷卻至室溫后用蒸餾水定容至5倍切塊土豆質量的水對應的體積得土豆汁；

將蛋白胨、酵母浸膏、氯化鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂和葡萄糖用土豆汁溶解后，用氫氧化鈉調節pH至7，即得B培養基。

進一步優選的，所述的氫氧化鈉濃度為3mol/L。

一種利用上述紅豆杉固態發酵培養基進行的紅豆杉固態發酵方法包括如下步驟：

A.培養基準備：將制備好的B培養基與A培養基中的麩皮、豆粕和大米粉混合均勻后滅菌，滅菌后的混合物與甲醛熏蒸后的紅豆杉粉末混合均勻即得培養基，將培養基裝于容器中，厚度為0.8-1.2cm；

B.菌種液的制備：將斜面菌種接種于裝有PDB培養基的已滅菌的容器中，在溫度為28℃、攪拌速度200rpm/min條件下恒溫培養60-80h，制得種子液；

C.接種及培養：將種子液按質量分數1％-5％的量接入已制備好的培養基中，于26-32℃溫度下靜置培養6-10天；

所述菌種編號為CPCC 800037，保存于中國藥學微生物菌種保藏管理中心。

進一步的，所述步驟A中滅菌條件為：溫度為121℃、壓力為0.1MPa滅菌鍋內滅菌20min。

進一步優選的，所述步驟B中恒溫培養時間為72h。

進一步的，所述步驟B中種子液接入培養基后，在培養基上蓋上紗布并捆扎結實。

進一步優選的，所述步驟A中培養基的厚度為1cm。

采用本發明提供的培養基對紅豆杉進行發酵能有效提高發酵培養產物中紫杉醇的含量，且該方法為首次嘗試對紅豆杉進行固體發酵，對紫杉醇生產行業具有重要意義。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。所述實施例僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。

實施例中用于制備含紅豆杉粉末固體真菌發酵培養基的紅豆杉枝葉粉末為本公司種植的曼地亞紅豆杉枝葉經過風干粉碎而得，其他各項成分可通過市購的方式獲得。

實施例一

培養基配置：將紅豆杉粉末100g用甲醛熏蒸12h備用。

制備B培養基：制備土豆汁：將200g新鮮土豆去皮切塊，用1L的水煮沸30min，然后用4層紗布過濾，過濾液自然冷卻至室溫后用蒸餾水定容至1L備用，pH為自然。

將蛋白胨2g，酵母浸膏1g，氯化鈉5g，磷酸二氫鉀0.3g，硫酸鎂0.2g，葡萄糖10g溶于100ml土豆汁中，用3mol/L的氫氧化鈉調節pH至7，備用。

將制備好的B培養基與A培養基除紅豆杉粉末以外的其余成分混合均勻，121℃、0.1Mpa滅菌鍋20分鐘后冷卻，將熏蒸后的紅豆杉粉末100g與滅菌后的培養基混合均勻備用。

接種：將搖瓶培養的菌種液按質量分數3％的量接入已制備好的培養基中，于30℃條件下培養7天，用甲醇提取，HPLC測定紫杉醇含量。

實施例二

培養基配置：將紅豆杉粉末100g用甲醛熏蒸12h備用。

制備B培養基：制備土豆汁：將200g新鮮土豆去皮切塊，用1L的水煮沸30min，然后用4層紗布過濾，過濾液自然冷卻至室溫后用蒸餾水定容至1L備用，pH為自然。

將蛋白胨2g，酵母浸膏1g，氯化鈉5g，磷酸二氫鉀0.3g，硫酸鎂0.2g，葡萄糖10g溶于100ml土豆汁中，用3mol/L的氫氧化鈉調節pH至7，備用。

將制備好的B培養基與A培養基除紅豆杉粉末以外的其余成分混合均勻，121℃、0.1Mpa滅菌鍋20分鐘后冷卻，將熏蒸后的紅豆杉粉末100g與滅菌后的培養基混合均勻備用。

菌種液制備：將斜面菌種，接種于裝有PDB培養基的已滅菌的三角瓶中，28℃、200rpm/min，恒溫培養3天，制得種子液備用。

接種：將搖瓶培養的菌種液按質量分數1％的量接入已制備好的培養基中，于32℃條件下培養10天，用甲醇提取，HPLC測定紫杉醇含量。

實施例三

培養基配置：將紅豆杉粉末100g用甲醛熏蒸12h備用。

制備B培養基：制備土豆汁：將200g新鮮土豆去皮切塊，用1L的水煮沸30min，然后用4層紗布過濾，過濾液自然冷卻至室溫后用蒸餾水定容至1L備用，pH為自然。

將蛋白胨2g，酵母浸膏1g，氯化鈉5g，磷酸二氫鉀0.3g，硫酸鎂0.2g，葡萄糖10g溶于100ml土豆汁中，用3mol/L的氫氧化鈉調節pH至7，備用。

將制備好的B培養基與A培養基除紅豆杉粉末以外的其余成分混合均勻，121℃、0.1Mpa滅菌鍋20分鐘后冷卻，將熏蒸后的紅豆杉粉末100g與滅菌后的培養基混合均勻備用。

菌種液制備：將斜面菌種，接種于裝有PDB培養基的已滅菌的三角瓶中，28℃、200rpm/min，恒溫培養3天，制得種子液備用。

接種：將搖瓶培養的菌種液按質量分數5％的量接入已制備好的培養基中，于28℃條件下培養6天，用甲醇提取，HPLC測定紫杉醇含量。

以同批未發酵紅豆杉枝葉，用甲醇提取，HPLC測定紫杉醇含量作為對照，各實施例的對照數據如表1所示。

表1紫杉醇含量對比結果