本發(fā)明涉及一種通過光調(diào)控精確檢測線粒體內(nèi)銅離子的熒光探針及其制備方法和應(yīng)用，屬于有機(jī)熒光探針領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

在線粒體中，銅離子是一個重要的微量元素,是一系列重要生理酶中不可分割的一部分,如運(yùn)輸和催化功能的酶。當(dāng)線粒體內(nèi)的銅離子失衡會破壞線粒體呼吸鏈，會表現(xiàn)出活性氧簇化合物含量升高、線粒體膜電位下降、脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞色素c的釋放等一系列細(xì)胞凋亡的征兆。銅離子和蛋白質(zhì)的相互作用也被視為神經(jīng)變性疾病的信號，如帕金森和阿爾茨海默病。對線粒體內(nèi)Cu²⁺的精確檢測，有助于我們進(jìn)一步了解銅離子在神經(jīng)退行性疾病中的起到的作用，有助于增進(jìn)我們對線粒體內(nèi)銅離子生理過程的了解，為神經(jīng)疾病病理的研究提供一個線粒體內(nèi)銅離子可視化工具。

線粒體在生命中的重要角色，促使它一直作為科學(xué)研究中的重中之重。在線粒體的研究中，多以熒光探針主，一個理想的熒光探針是無數(shù)個科學(xué)家的夢想，至今已經(jīng)報道出來了很多熒光探針，如檢測活性氧簇、活性氮簇、金屬離子，生物小分子等的熒光探針，但是這些熒光探針都存在一個致命的缺點(diǎn)就是在經(jīng)過細(xì)胞質(zhì)靶向線粒體的過程中不能避免來自細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的被檢測物的干擾，造成研究結(jié)果缺乏說服力。為了解決這一存在已久的問題，急需研發(fā)一種可以定位線粒體又能避免細(xì)胞質(zhì)內(nèi)被檢測物的熒光探針。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決以上的問題，本發(fā)明提供一種可定位活細(xì)胞中線粒體，并通過光調(diào)控精確檢測線粒體內(nèi)銅離子的熒光探針及其制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種通過光調(diào)控精確檢測線粒體內(nèi)銅離子的熒光探針，所述的熒光探針為Mito-Cu²⁺熒光探針，Mito-Cu²⁺熒光探針的結(jié)構(gòu)式如(Ⅰ)所示：

本發(fā)明采用的另一技術(shù)方案是：所述的通過光調(diào)控精確檢測線粒體內(nèi)的銅離子熒光探針的制備方法，所述的Mito-Cu²⁺熒光探針的制備方法包括如下步驟：將熒光素衍生化合物和三苯基膦依次加入到甲苯中，加熱回流8-16小時，冷卻抽濾，除去溶劑，經(jīng)硅膠柱層析提純得到目標(biāo)產(chǎn)物Mito-Cu²⁺熒光探針，反應(yīng)式如下：

優(yōu)選的，所述熒光素衍生化合物和三苯基膦的摩爾比為1:1.2-2。

優(yōu)選的，所述的熒光素衍生物的制備方法如下：

(1)將熒光素溶解在甲醇中，滴加的水合肼，回流8-14小時，除去溶劑，經(jīng)硅膠柱層析提純得到熒光素酰肼；

(2)將熒光素酰肼和2-硝基芐溴溶到DMF中，加入碳酸銫常溫6-13個小時，水洗萃取，經(jīng)硅膠柱層析提純得到光保護(hù)熒光素酰肼；

(3)將光保護(hù)熒光素酰肼和1，4-二溴丁烷溶到DMF中，加入碳酸銫和碘化鉀常溫反應(yīng)10-24個小時，水洗萃取，經(jīng)硅膠柱層析提純得到熒光素衍生物。

優(yōu)選的，所述步驟(1)中熒光素與水合肼的質(zhì)量比為1:4.2-5。

優(yōu)選的，所述步驟(2)中熒光素酰肼、2-硝基芐溴和碳酸銫的摩爾比為1:1-1.5:4。

優(yōu)選的，所述步驟(3)中光保護(hù)熒光素酰肼、1，4-二溴丁烷和碳酸銫的摩爾比為1:1.2-1.5:4。

本發(fā)明采用的另一技術(shù)方案是：一種通過光調(diào)控精確檢測線粒體內(nèi)銅離子熒光探針的應(yīng)用，所述的熒光探針可應(yīng)用于生理體系中精確檢測線粒體內(nèi)的銅離子。

有益效果：

本發(fā)明的熒光探針具有較好的線粒體靶向性、化學(xué)穩(wěn)定性、生物兼容性和銅離子選擇性。激光共聚焦成像實(shí)驗(yàn)表明該探針具有較好的細(xì)胞通透性，對細(xì)胞和生物體無毒副作用。

本發(fā)明的熒光探針在可應(yīng)用于細(xì)胞體系中通過光調(diào)控精確檢測線粒體內(nèi)的銅離子而避免來自細(xì)胞質(zhì)中銅離子的干擾的應(yīng)用。

本發(fā)明的精確測線粒體內(nèi)銅離子的熒光探針可用于活細(xì)胞線粒體銅離子的精確檢測，主要用的活細(xì)胞為Hela細(xì)胞株、MCF-7細(xì)胞株或者RAW264.7細(xì)胞株。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1制備的Mito-Cu²⁺(5uM)UV光照5分鐘后對不同Cu(NO₃)₂濃度Hepes緩沖溶液(0.2uM-20uM)的熒光光譜圖。

圖2是實(shí)施例1制備的Mito-Cu²⁺(5uM)UV光照5分鐘后對20uM Cu(NO₃)₂濃度Hepes緩沖溶液不同響應(yīng)時間的熒光光譜圖。

圖3是實(shí)施例1制備的Mito-Cu²⁺(5uM)UV光照5分鐘后對20當(dāng)量不同金屬離子濃度Hepes緩沖溶液的熒光光譜圖。

圖4是實(shí)施例1制備的Mito-Cu²⁺(5uM)在細(xì)胞線粒體中的共聚焦顯微成像。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

通過光調(diào)控精確測線粒體內(nèi)銅離子的熒光探針的制備方法如下：

(1)熒光素酰肼的制備：將1g熒光素溶解在50mL甲醇中，滴加4mL的水合肼，回流10小時，除去溶劑，經(jīng)硅膠柱層析提純得到熒光素酰肼；

(2)光保護(hù)熒光素酰肼的制備：將108mg熒光素酰肼和82mg 2-硝基芐溴溶到3mL DMF中，加入405mg碳酸銫常溫6個小時，水洗萃取，經(jīng)硅膠柱層析提純得到光保護(hù)熒光素酰肼；

(3)光保護(hù)熒光素衍生物的制備：將光保護(hù)熒光素酰肼253mg和1，4-二溴丁烷131.7mg溶到4mL DMF中，加入碳酸銫664.4mg和碘化鉀催化量常溫反應(yīng)12個小時，水洗萃取，經(jīng)硅膠柱層析提純得到熒光素衍生物。¹H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.02(d,J＝4.8Hz,1H),7.92(d,J＝1.5Hz,1H),7.75(m,1H),7.58(t,J＝4.5Hz,1H),7.42(m,3H),7.00(t,J＝3.9Hz,1H),6.69(s,1H),6.62(d,J＝9.9Hz,1H),6.51(d,J＝6.9Hz,5H),6.03(t,J＝3.3Hz,1H),3.98(t,J＝3.45Hz,2H),3.66(s,2H),3.46(t,J＝3.75Hz,2H),2.03(m,2H),1.92(m,2H),1.69(d,J＝3.9Hz,3H).¹³C NMR(75MHz,CDCl₃):δ166.36,160.00,158.37,153.14,150.92,147.47,138.70,134.27,132.92,129.76,128.75,128.57,128.49,128.24,127.52,124.88,123.81,123.30,122.92,112.70,112.47,112.13,111.44,110.60,103.15,101.68,71.84,67.24,65.30,33.32,29.46,27.82,23.63.

(4)Mito-Cu²⁺熒光探針的制備：將摩爾比1:1.2的熒光素衍生化合物和三苯基膦依次加入到甲苯中，加熱回流12個小時，冷卻抽濾，除去溶劑，經(jīng)硅膠柱層析提純得到目標(biāo)產(chǎn)物Mito-Cu²⁺熒光探針。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆):δ8.05(d,J＝4.8Hz,1H),7.74(m,17H),7.55(m,3H),7.48(s,1H),6.95(d,J＝3Hz,1H),6.41-6.50(s,1H),6.59(m,2H)6.53(m,3H),5.59(d,J＝3.9Hz,1H),4.42(bs,2H),4.06(t,J＝3.45Hz,2H),3.69(t,J＝6.75Hz,2H),1.91(m,2H),1.72(m,2H),1.65(d,J＝3.9Hz,3H).¹³C NMR(75MHz,DMSO-d₆):δ165.49,159.03,157.46,152.13,151.00,147.39,136.87,134.85,134.18,133.56,133.43,132.64,130.24,130.08,129.14,128.57,128.26,127.82,127.28,124.52,123.25,122.43,118.97,117.83,112.29,111.87,111.37,102.31,101.30,71.23,66.24,64.30,28.77,22.90,19.33,18.33.IT-TOF-MS:m/z[M+H]⁺calcd:812.29,found:812.28.

實(shí)施例2

通過光調(diào)控精確測線粒體內(nèi)銅離子的熒光探針的制備方法如下：

(1)熒光素酰肼的制備：將0.8g熒光素溶解在50mL甲醇中，滴加3.7mL的水合肼，回流12小時，除去溶劑，經(jīng)硅膠柱層析提純得到熒光素酰肼；

(2)光保護(hù)熒光素酰肼的制備：將158mg熒光素酰肼和125mg 2-硝基芐溴溶到4mL DMF中，加入593.6mg碳酸銫常溫10個小時，水洗萃取，經(jīng)硅膠柱層析提純得到光保護(hù)熒光素酰肼；

(3)光保護(hù)熒光素衍生物的制備：將光保護(hù)熒光素酰肼100mg和1，4-二溴丁烷57mg溶到2mL DMF中，加入碳酸銫267mg和碘化鉀催化量常溫反應(yīng)16個小時，水洗萃取，經(jīng)硅膠柱層析提純得到熒光素衍生物

(4)Mito-Cu²⁺熒光探針的制備：將摩爾比1:1.6的熒光素衍生化合物和三苯基膦依次加入到甲苯中，加熱回流14個小時，冷卻抽濾，除去溶劑，經(jīng)硅膠柱層析提純得到目標(biāo)產(chǎn)物Mito-Cu²⁺熒光探針。

實(shí)施例3

通過光調(diào)控精確測線粒體內(nèi)銅離子的熒光探針制備方法如下：

(1)熒光素酰肼的制備：將1g熒光素溶解在50mL甲醇中，滴加4.5mL的水合肼，回流14小時，除去溶劑，經(jīng)硅膠柱層析提純得到熒光素酰肼；

(2)光保護(hù)熒光素酰肼的制備：將200mg熒光素酰肼和185.3mg 2-硝基芐溴溶到4mL DMF中，加入751.4mg碳酸銫常溫12個小時，水洗萃取，經(jīng)硅膠柱層析提純得到光保護(hù)熒光素酰肼；

(3)光保護(hù)熒光素衍生物的制備：將光保護(hù)熒光素酰肼123mg和1，4-二溴丁烷76mg溶到3mL DMF中，加入碳酸銫323mg和碘化鉀催化量常溫反應(yīng)20個小時，水洗萃取，經(jīng)硅膠柱層析提純得到熒光素衍生物

(4)Mito-Cu²⁺熒光探針的制備：將摩爾比1:1.75的熒光素衍生化合物和三苯基膦依次加入到甲苯中，加熱回流15個小時，冷卻抽濾，除去溶劑，經(jīng)硅膠柱層析提純得到目標(biāo)產(chǎn)物Mito-Cu²⁺熒光探針。

實(shí)施例4

通過光調(diào)控精確測線粒體內(nèi)銅離子的熒光探針制備方法如下：

(1)熒光素酰肼的制備：將1g熒光素溶解在50mL甲醇中，滴加4.8mL的水合肼，回流14小時，除去溶劑，經(jīng)硅膠柱層析提純得到熒光素酰肼；

(2)光保護(hù)熒光素酰肼的制備：將120mg熒光素酰肼和119mg 2-硝基芐溴溶到4mL DMF中，加入450mg碳酸銫常溫13個小時，水洗萃取，經(jīng)硅膠柱層析提純得到光保護(hù)熒光素酰肼；

(3)光保護(hù)熒光素衍生物的制備：將光保護(hù)熒光素酰肼85mg和1，4-二溴丁烷55.3mg溶到2mL DMF中，加入碳酸銫223mg和碘化鉀催化量常溫反應(yīng)20個小時，水洗萃取，經(jīng)硅膠柱層析提純得到熒光素衍生物

(4)Mito-Cu²⁺熒光探針的制備：將摩爾比1:2的熒光素衍生化合物和三苯基膦依次加入到甲苯中，加熱回流16個小時，冷卻抽濾，除去溶劑，經(jīng)硅膠柱層析提純得到目標(biāo)產(chǎn)物Mito-Cu²⁺熒光探針。

實(shí)施例5

通過光調(diào)控精確測線粒體內(nèi)銅離子的熒光探針對銅離子的響應(yīng)檢測

1、Mito-Cu²⁺對不同銅離子濃度的熒光響應(yīng)(圖1)：

首先配制濃度25mM的Hepes緩沖溶液(pH＝7.35),用緩沖溶液配制5uMMito-Cu²⁺的銅離子探針，UV光照5分鐘后,加入0.2-20當(dāng)量的銅離子，用熒光分光光度法測試，并繪制Mito-Cu²⁺的銅離子探針對不同當(dāng)量銅離子的熒光光譜圖。

2、Mito-Cu²⁺對20當(dāng)量銅離子不同響應(yīng)時間的熒光響應(yīng)(圖2)：

用緩沖溶液配制5uM Mito-Cu²⁺的銅離子探針，UV光照5分鐘后,加入20當(dāng)量的銅離子，用熒光分光光度法分別測試響應(yīng)5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、60分鐘的熒光強(qiáng)度，并繪制Mito-Cu²⁺對20當(dāng)量銅離子不同響應(yīng)時間的熒光光譜圖。

3、Mito-Cu²⁺對20當(dāng)量不同金屬離子的熒光響應(yīng)(圖3)：

用緩沖溶液配制10uM Mito-Cu²⁺的銅離子探針，UV光照5分鐘后,加入20當(dāng)量的不同金屬離子，用熒光分光光度法分別測試，并繪制Mito-Cu²⁺的銅離子探針對不同金屬離子的熒光光譜圖。

4、Mito-Cu2+在細(xì)胞線粒體中的共聚焦顯微成像(圖4)：

向含有Hela細(xì)胞的培養(yǎng)皿中加Mito-Cu²⁺DMSO溶液，與細(xì)胞培養(yǎng)液混合均勻后，使Mito-Cu²⁺在培養(yǎng)液中的濃度為5uM，染色1個小時后，用pH＝7.35的緩沖溶液沖洗3次，將該培養(yǎng)皿在共聚焦顯微鏡下成像，取出培養(yǎng)皿，UV光照5分鐘后，靜置1個小時，再次將該培養(yǎng)皿在共聚焦顯微鏡下成像。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Mito-Cu²⁺具有良好的細(xì)胞通透性、很好線粒體靶向性。證明了通過光調(diào)控的方法控制探針和銅離子的反應(yīng)是非常成功的，實(shí)現(xiàn)了精確檢測線粒體內(nèi)的銅離子而不受細(xì)胞質(zhì)內(nèi)銅離子的干擾。

本發(fā)明的不局限于上述實(shí)施例所述的具體技術(shù)方案，凡采用等同替換形成的技術(shù)方案均為本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。