本發明涉及一種發酵洋蔥皮功能性產品及其制備方法，特別涉及一種減肥功能產品等。
背景技術：
：近年來，隨著經濟社會的發展、生活水平的提高、工作方式的轉變，人們過上了更加安逸、靜態的生活，轎車、電梯取代了人們少有的消耗能量的方式，繁密的工作把人們牢牢地鎖在電腦旁，勞累一天回到家就會躺在沙發上看電視，因此，做運動和鍛煉身體的時間微乎其微。與此同時，快節奏生活下的飲食既缺乏營養也不健康，人們往往在加班到很晚以后還吃夜宵，日常生活中經常無節制地食用高熱量食品，人際場合上過量飲酒，類似不良的飲食方式在快速發展的今天已是司空見慣。人們卻不知在享受的背后，無數隱藏的疾病在伺機而來，其中肥胖癥也在慢慢靠近。尤其，兒童期單純性肥胖(以下簡稱兒童肥胖)是指排除機體各器官自身患有的疾病，因長時間能量吸收過多、消耗較少而導致體內脂肪蓄積的一種營養失衡性疾病。WHO報道，兒童肥胖檢出率近年來在全球呈明顯上升趨勢。目前在全球范圍內，5歲以下的兒童大約有4千萬超重或者肥胖，學齡兒童體重超標的有1.55億。我國兒童肥胖的患病率同樣不容樂觀，在楊淑香等人2012年對城區兒童健康水平的抽樣調查中顯示，山東濰坊男、女兒童的肥胖率分別為9.9％和4.6％；王欽以3～6歲在園兒童為目標對象調查了義烏市的肥胖癥現狀，發現該年齡段兒童肥胖檢出率為0.89％，男孩為0.53％，女孩為0.36％，并且兒童的肥胖癥檢出率逐年上升趨勢。眾所周知，洋蔥中含有豐富的生物活性物質，這些成分具有顯著的抑菌、降血脂、降血糖、抗血栓、抗腫瘤和抗氧化等保健功效。關于洋蔥的多種保健功能及有效成分提取的研究，前人已經有了一定的研究基礎。目前，關于洋蔥可食部分黃酮的研究較多，而加工生產中的廢棄物—洋蔥皮卻沒有得到很好的利用。大量研究證明洋蔥黃酮含量從外鱗莖到內鱗莖是依次遞減的，洋蔥外表皮中的黃酮類物質的含量顯著高于可食部分。但事實上，洋蔥皮并沒有受到人們的重視，也沒有得到充分的加工利用，大部分洋蔥皮被丟棄，是對資源的極大浪費。如果能夠將洋蔥皮中富含的黃酮利用起來，不但可以解決加工生產所帶來的污染，又可以研究開發洋蔥皮深加工產品，這不僅可以促進洋蔥加工業的快速發展，對生活、對社會也具有深遠的意義。從消費者角度講，慢性疾病的發病率日益增加，功能保健食品的開發為人們的健康做出了重要保障；依經濟角度看，提取洋蔥皮中的黃酮類物質，是將洋蔥皮變廢為寶的有效途徑，是科技轉化生產力的具體體現；從農民的角度來說，功能產品的研究開發，提高了洋蔥皮的綜合利用，提高了洋蔥產業的整體效益，增加了農民的經濟收入。技術實現要素：本發明的目的在于提供一種洋蔥皮中黃酮類化合物的提取方法，其特征在于，包括洋蔥皮的發酵步驟和洋蔥皮中黃酮類化合物的提取步驟。本發明所述的黃酮類化合物的提取方法，其特征在于，所述發酵步驟中，采用朝鮮族大醬中篩選出來的產纖維素酶酵母菌和產纖維素酶乳酸菌(cy2-2/cy2-4)。本發明所述的黃酮類化合物的提取方法，其特征在于，所述洋蔥皮中黃酮類化合物的提取步驟中，還包括乙醇提取步驟。本發明所述的黃酮類化合物的提取方法，其特征在于，所述乙醇提取中，洋蔥皮與乙醇的固液比選自1:20～1:40。本發明所述的黃酮類化合物的提取方法，其特征在于，所述乙醇提取中，乙醇濃度選自40％～60％的范圍。本發明所述的黃酮類化合物的提取方法，其特征在于，所述乙醇提取中，提取溫度選自80℃～90℃的范圍。本發明所述的黃酮類化合物的提取方法，其特征在于，所述乙醇提取中，提取時間選自1～2小時的范圍。本發明所述的黃酮類化合物的提取方法，其特征在于，還包括精制步驟。本發明所述的黃酮類化合物的提取方法，其特征在于，所述精制步驟為大孔樹脂處理步驟。本發明還提供一種減肥保健產品，其包含所述洋蔥皮中提出黃酮類化合物。本發明所述的減肥保健產品，其適用于兒童、成人、老人。通過本發明，1.洋蔥皮中黃酮類化合物蘆丁、槲皮素和山奈酚的含量分別為0.2785mg/g、70.85mg/g、0.7mg/g，槲皮素是洋蔥皮中主要的黃酮類物質；2.OPE能夠減輕小鼠因攝食高脂飼料導致的營養性肥胖，對攝食量沒有顯著影響，說明OPE不是通過降低食欲達到減肥的作用，小鼠糞便形態正常，不會引起腹瀉；3.OPE能夠有效改善小鼠的血脂水平，加快體內脂質的代謝，并提高機體的抗氧化能力，降低患動脈粥樣硬化的風險；4.OPE能有效抑制脂肪細胞的膨大，減小脂肪細胞體積，并可清除脂肪在肝臟上的沉積，加快脂肪細胞的動員與代謝，預防脂肪肝的發生；5.OPE降脂減肥的作用與劑量有關，存在劑量效應，中、高劑量效果最為明顯，沒有顯著性差異，而低劑量的效果不很明顯，說明一定劑量的OPE具有預防肥胖的作用。除此之外，通過本發明提取得到的黃酮類化合物，具有優異的抗氧化效果，可以期待更多功能性產品的開發。附圖說明圖1示出本發明的洋蔥皮中黃酮類化合物的提取方法的示意圖；圖2示出產纖維素酶酵母菌生長曲線；圖3示出周期內小鼠體重變化趨勢；圖4示出OPE對小鼠脂肪系數、攝食量、食物利用率的影響；圖5示出OPE對小鼠臟器指數的影響；圖6示出小鼠血清中TC含量；圖7示出小鼠血清中TG含量；圖8示出小鼠血清中HDL-C水平；圖9示出小鼠血清中LDL-C水平；圖10示出小鼠血清中FFA含量；圖11示出小鼠肝勻漿中GSH-Px的活力；圖12示出小鼠肝勻漿中MDA含量；圖13示出小鼠肝勻漿中T-SOD活力；圖14示出小鼠肝勻漿中T-AOC活力；圖15示出小鼠肝臟對比圖；圖16示出小鼠肝組織細胞HE染色(400倍)；圖17示出小鼠脂肪組織細胞HE染色(100倍)。具體實施方式下面，將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行詳細的描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動的前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。需要說明的是，在本文中，術語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過程、方法、物品或者設備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設備所固有的要素。圖1示出本發明的洋蔥皮中黃酮類化合物的提取方法的示意圖；圖2示出產纖維素酶酵母菌生長曲線；圖3示出周期內小鼠體重變化趨勢；圖4示出OPE對小鼠脂肪系數、攝食量、食物利用率的影響；圖5示出OPE對小鼠臟器指數的影響；圖6示出小鼠血清中TC含量；圖7示出小鼠血清中TG含量；圖8示出小鼠血清中HDL-C水平；圖9示出小鼠血清中LDL-C水平；圖10示出小鼠血清中FFA含量；圖11示出小鼠肝勻漿中GSH-Px的活力；圖12示出小鼠肝勻漿中MDA含量；圖13示出小鼠肝勻漿中T-SOD活力；圖14示出小鼠肝勻漿中T-AOC活力；圖15示出小鼠肝臟對比圖；圖16示出小鼠肝組織細胞HE染色(400倍)；圖17示出小鼠脂肪組織細胞HE染色(100倍)。在本發明中，洋蔥皮采集于延吉市某農貿市場，用于發酵的酵母菌由延邊大學農學院提供的從大醬中分離提取，實驗試劑分別為無水乙醇(分析純)、甲醇、磷酸、乙腈(色譜純)、蘆丁、槲皮素、山奈酚標準品，作為種子培養基采用牛肉浸膏3.0g、蛋白陳10g、NaC15.0g、葡萄糖1.0g、蒸餾水1000mI。作為發酵培養基：CMC-Nal0g、(NH4)SO44g、KH2PO42g、MgSO4·7H2O0.5g、蛋白陳10g、牛肉膏5g、加水至1000mI。在本發明中，儀器設備分別采用電子天平：FA1104N型，上海精密科學有限公司；旋轉蒸發儀:FYFLAN-1001型，東京理化器械株式會社；糖度計:WY032'T型，重慶蜀江科技貿易有限公司；高速粉碎機:FW-200型，北京中興偉業儀器有限公司；旋轉蒸發儀:EYELAN-1001型，東京理化器械株式會社；冷凍干燥機:LGH-18型，北京松源華興科技發展有限公司；高效液相色譜儀:LC-2010型：日本島津DPN-9082BS-III電熱恒溫培養箱：上海新苗醫療設備有限公司。實施例1～9一、<洋蔥皮提取物的制備>按照表1，將洋蔥皮粉碎后加入到濃度分別為40％、50％、60％的乙醇水溶液中，固液比分別為1:20、1:30、1:40，在80-90℃萃取1-2小時。趁熱過濾，濾渣中加一定量的醇水溶液，在相同溫度下萃取30min后過濾，方法再進行一次，將三次濾液合并，濃縮至原體積的五分之一，冷凍干燥，計算提取率。表1發酵洋蔥皮提取異黃酮按照表1的極差分析結果可以得出，影響洋蔥皮異黃酮提取效果各因素的主次順序為B(提取溫度)、D(乙醇濃度)、A(固液比)和C(提取時間)。二、<產纖維素酵母菌的制備>從朝鮮族大醬提取分離出來的產纖維素酵母菌的生長曲線。由圖2可以看出，酵母菌在培養基上生長良好，生長停滯期較短，在接種8h后進入對數生長期，60h后生長速率有所下降，80-100h進入穩定期時菌體數量最大，根據生長曲線結果可以確定產纖維素酵母菌的穩定生長期為80-100h。經活化培養后接種于種子培養基中，37℃、120r/min條件下培養24h后作為種子液。按4％接種量接種于產酶培養基中，37℃、120r/min條件下培養，每4h測量培養液吸光度(600nm)，以時間為橫坐標，吸光度做縱坐標繪制生長曲線。將種子液接種于產酶培養基中，一定條件下培養制成粗酶液，將粗酶液4℃、3000r/min下離心15min，取上清液測定纖維素酶活力。采用濾濾、紙酶活和CMC酶活測定纖維素酶活。將細菌在一定條件下培養，分別討論產酶時間、產酶pH及產酶溫度對纖維素酶活力的影響，以確定最佳產酶條件。表2異黃酮發酵前后含量變化樣品名發酵前含量發酵后含量增長比率蘆丁0.000765mg/g0.009173mg/g92％槲皮素0.0084255mg/g0.040636mg/g79％山奈酚0.008424mg/g0.005696mg/g-49％由表2可以看出，洋蔥皮最佳條件發酵，最優提取工藝提取以后，異黃酮的總含量有所增長，蘆丁和槲皮素的含量在經過發酵之后分別增長了92％和79％，而山奈酚的含量卻降低了48％。三、洋蔥皮提取物在減肥產品中的應用準確稱量蘆丁、槲皮素、山奈酚標準品2mg，分別投入到10mL容量瓶容器中，用甲醇(HPLC級)溶解并定容至刻度，放在超聲波中20min使溶解完全，得到0.2mg/mL的標準品溶液。再分別精密量取1mL蘆丁、槲皮素和山奈酚單體溶液至10mL容量瓶中，定容至刻度，混合均勻，即得到三種標準品的混合溶液。準確稱量OPE的粉末2mg，裝入到10mL容量瓶容器中，先倒入一半的甲醇將黃酮類物質溶解，放入超聲波中20min后，繼續用甲醇定容至10mL刻度，然后超聲30min，將溶液用0.45μm微孔濾膜過濾，繼而根據準備好的程序和流動相進行檢測。色譜柱：DiamonsilC18(250×4.6mm5μm)，選擇乙腈-0.4％磷酸溶液作為流動相，流速0.8mL/min，每次以10μL量進樣，在360nm波長下進行梯度洗脫(表3)。表3洗脫程序以60只4～5周齡SPF級C57BL-6J雄性小鼠為試驗對象，飼養期間自由采食和飲水，按動物實驗中心標準進行飼養，溫度保持在20～23℃左右，濕度控制在40～60％，自然通風，照明按12/12h自動控制，定期更換墊料，保持生長環境清潔，清洗鼠籠。小鼠適應性飼養1周后，開始預防性抗肥胖試驗，周期為10周。不同處理的動物分籠飼養，每周稱1次體重，并觀察整個過程中小鼠活動程度、體毛色澤、進食情況及糞便形狀等。試驗10周后，各組小鼠禁食12h，稱量終體重后眼球取血，解剖后取小鼠的臟器和脂肪。喂養適應1周后，按體重隨機取10只繼續喂食基礎飼料，列為普通對照組；其余小鼠按體重隨機分為五組，通過飼喂高脂飼料進行膳食誘導，分別設置為高脂對照組、實驗組(高、中、低)和陽性茶多酚對照。具體喂養方式見表4：表4試驗動物分組情況每天對小鼠的生理狀況進行記錄，如體毛色澤、活潑程度、進食飲水及糞便性狀等，稱取小鼠的給食量、剩食量和撒食量，單位為g，精確到0.1，統計攝食量(1)。每周稱小鼠體重1次，實驗結束前，小鼠禁食12h，測定小鼠終體重，并用游標卡尺記錄體長(鼻子到肛門的長度)，計算體重增長量(2)和Lee’s指數(3)；計算食物利用率(4)。攝食量＝給食量-剩食量-撒食量(1)體重增長量＝終體重-初體重(2)食物利用率＝體重增長量/攝食量×100(4)小鼠摘眼球取血后，解剖摘取小鼠腹腔脂肪和睪丸附近脂肪，以及小鼠的心、肝、脾、腎，用濾紙吸干臟器上的血液后稱量其重量，保留到0.001g，計算脂肪系數(5)和臟器指數(6)。脂肪系數＝體內脂肪總重/體重×100％(5)臟器指數＝臟器重/體重×100％(6)實驗結束時，將小鼠解剖摘取肝臟和脂肪，肉眼下觀察小鼠肝臟脂肪變性情況，并立即選取左葉肝組織及附睪同一部位脂肪組織(約0.5×0.5×0.8cm)于10％福爾馬林溶液中固定，并不時搖動，使組織固定充分、完全，減少淤血對細胞觀察的干擾。組織塊固定好后，用不同濃度的無水乙醇和二甲苯進行脫水透明，然后將組織用軟蠟和硬蠟包埋。蠟凝固后，從包埋盒中取下組織塊，根據冷凍切片機的刀片進行必要的修型，然后調節厚度開始切片，攤片的時候要盡量注意避免褶皺，防止細胞在顯微鏡下展示不完全，烘干后按HE染色程序進行染色，在光學顯微鏡下觀察并拍照。肝臟脂肪組織變性情況，按照《非酒精性脂肪肝診斷標準》進行判定。肝臟相關指標的測定要先制成組織勻漿，在右葉肝組織同一位置取0.3g，將其放在玻璃勻漿管口用剪子剪碎，加入9倍體積(mL)提前放入冰箱中的0.86％生理鹽水。為了保持組織勻漿的低溫狀態，將勻漿管下端插入盛有冰水混合物的三角瓶中，用左手穩住保持平衡。右手將搗杵慢慢地垂直插入套管中，上下研磨使組織勻漿化，為了充分研碎重復10次左右，看不到肝纖維為止。組織勻漿在4℃下2500r/min離心10min取上清液，按照試劑盒指導過程測定肝組織中蛋白含量、MDA、T-SOD、T-AOC、和GSH-Px活力。試驗期結束后，摘除小鼠眼球用5ml離心管采集血樣，按小鼠編號順序對離心管標號，置于水浴鍋中，37℃水浴30min。取出于高速冷凍離心機上3000r/min條件下離心10min，分離采集小鼠血清，每份分裝兩管，于-80℃冰箱中保存。根據試劑盒操作具體步驟說明測定血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C和FFA含量。實驗數據用Excel辦公軟件進行統計整理，脂肪細胞用ImageJ軟件進行測量，結果采用SPSS17.0統計分析軟件進行單因素方差分析，并通過LED法進行差異顯著性檢驗。P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著，數值用(平均值±標準差)的形式表示。在整個實驗過程中各組小鼠攝食飲水正常，排泄的糞便呈正常狀態，小鼠精神狀態較佳，反應敏捷，各組間無撕咬現象。表5OPE對小鼠體重、Lee's指數的影響注：同一列不同小寫字母表示同一指標不同處理組間存在顯著性差異(p＜0.05)。小鼠身體重量的增量及每周的增長幅度從表5、圖3可見。各組小鼠在飼養初期體重無統計學差異(P>0.05)，處于同一水平。隨著飼養時間的增加，各組小鼠體重正常生理反應都會逐漸增長，但從折線圖中可以看出，高脂組小鼠體重增加的速率最快，高于實驗組和普通組，說明小鼠攝食高脂飼料起到了增長體重的作用。到末期稱量終體重時，高脂對照組小鼠體重增長了55.42％，普通對照組體重增長32.82％，兩組小鼠體重增長有顯著的差距，參照保健食品功能學評價程序與檢驗方法規范，說明小鼠肥胖模型成功。高脂組體重與OPE中劑量組和高劑量組差異顯著，表明一定劑量的OPE起到了抑制肥胖的作用；而低劑量組與高脂組的小鼠體重差異不顯著，說明低劑量提取物沒有起到明顯的作用。洋蔥皮提取物高劑量組體重增長量與飼喂基礎飼料的普通組差異不顯著，說明高劑量洋蔥皮提取物抑制肥胖作用效果最明顯。Lee's指數與人的體重指數(BMI)類似，主要反映機體肥胖程度。從表3可以觀察到，其中只有洋低組與高脂組Lee's指數不存在顯著性差異，其他組與高脂組比較都看出顯著性差異，而除了洋低外的其他組組間無顯著差異，說明洋高、洋中和陽性對照組小鼠的肥胖程度與正常組接近。機體的脂肪含量及脂肪系數是反映小鼠肥胖程度的一個重要指標，實驗結果從表6、圖4可見。OPE中、高劑量組與高脂組相比，脂肪總重、脂肪系數均顯示出顯著差異(P<0.05)，洋低組的脂肪重和脂肪系數相對高脂對照組比無統計學差異(P>0.05)，效果不是很明顯，說明一定劑量的洋蔥皮提取物具有良好的抑制體內脂肪堆積的作用。實驗組、陽性對照組和高脂對照組之間小鼠的攝食水平基本接近，這說明飼養期間灌胃OPE并沒有給小鼠的食欲帶來不良影響。喂食高脂飼料的小鼠食物利用率較高，說明肥胖與體內的激素水平有關。飼喂高脂飼料實驗組的食物利用率比高脂對照組的食物利用率低，說明OPE可能是通過降低體內食物利用率，而實現控制體重平衡的功效，預示著OPE對體重的影響與攝食量無關。表6OPE對小鼠脂肪系數、攝食量、食物利用率的影響注：同一列不同小寫字母表示同一指標不同處理組間存在顯著性差異(p＜0.05)。從表7的數據可以看出，各實驗組間心臟指數、腎臟指數和脾臟指數均無顯著差異(P>0.05)，表明OPE對心、腎、脾臟功能沒有明顯影響。而高脂組的肝臟指數顯著(P<0.05)高于普通組，可能是由于長期攝食高能量的食物，使脂肪在肝臟上的積聚變多所致。灌胃OPE實驗組的肝臟指數較高脂組顯著(P<0.05)降低，分別降低了6.91％、1.73％、5.19％，與普通對照組差異不明顯，這可能是因為洋蔥皮中豐富的黃酮類物質起到了抑制脂肪在動物體內堆聚的作用，加速脂肪分解，避免了脂肪在臟器上的沉積。表7OPE對小鼠臟器指數的影響注：同一列不同小寫字母表示同一指標不同處理組間存在顯著性差異(p＜0.05)。OPE對小鼠血清中的TC、TG、HDL-C、LDL-C和FFA含量的影響如表8、圖6～10所示，高脂組TC、TG的水平提升較多，與普通組相比具有顯著性差異，說明高能量的膳食誘導會使小鼠血清TC、TG含量升高。對于血清TC、TG的含量與高脂組相比，實驗組和陽性對照組均有所降低，中、高劑量組、陽性對照組降低的幅度具有顯著性(p<0.05)，而洋低組的降低幅度不顯著(P>0.05)；中、高劑量組TG和高劑量組TC含量與正常組無顯著差異，說明一定劑量的OPE對于降低小鼠血清TC、TG含量具有一定作用，洋高組比高脂組TC含量降低了11.96％。試驗各組間小鼠血清HDL-C水平并無顯著性差異(p>0.05)，和高脂組比較，試驗組血清HDL-C均有所升高，但無統計學意義。實驗組和陽性組血清中LDL-C水平和高脂對照組比較，均有所降低，且除了洋低以外差異都顯著(p<0.05)；和普通組比較，實驗組和陽性組血清LDL-C水平均有一定程度的升高，但差異不顯著。由表6數據可知，高脂組FFA偏大，中、高劑量組和陽性組相比高脂組FFA值平均降低了16.22％，水平接近正常組，但各組間差異不顯著。表8OPE對小鼠血脂指標及游離氨基酸的影響注：同一列不同小寫字母表示同一指標不同處理組間存在顯著性差異(p＜0.05)。綜上可知，高脂組小鼠血清TC、TG、LDL-C和FFA含量高于普通組小鼠，血清中HDL-C低于普通組小鼠，說明長久的高能量膳食能夠在一定程度上引起小鼠血脂升高，實驗組小鼠的血脂水平有所改善，說明添加洋蔥皮提取物對于降低小鼠血脂起到一定作用。小鼠灌胃OPE后抗氧化指標的變化見表9和圖11～14。高脂組的GSH-Px活力顯著(P<0.05)低于普通組，實驗組和陽性對照組都能將小鼠肝組織中GSH-Px活力提高，其中中、高劑量組提高的效果比較顯著，優于普通組。與普通組相比，高脂組肝組織勻漿MDA含量升高較顯著(P<0.05)，己經超出正常對照組的42.2％，反應出高脂膳食誘導小鼠出現高血脂癥，以致機體抗氧化能力減弱。洋低組和陽性組能夠小幅度地降低MDA含量，但是對比高脂組呈現不顯著性差異；洋高和洋中組的肝組織勻漿中MDA含量相對高脂組降低比較顯著，與普通組接近，說明OPE能夠控制MDA含量，從而加強機體抗氧化能力。測定小鼠的T-AOC水平，高脂組顯著(P<0.05)低于普通組，實驗組和陽性組T-AOC水平較高脂組相比有所提升，其中洋高組和洋中組提高最為顯著，洋低組、陽性組與高脂組比較無統計學意義(P>0.05)。對于T-SOD活力來看，實驗組、陽性組、普通組間差異均不顯著(P>0.05)，但相對高脂組活力都有所提升，洋中組差異最為顯著(P<0.05)，提高了14.45％，說明中劑量的OPE對提升肝T-SOD活力效果最好。表9OPE對小鼠肝臟中GSH-Px,MDA,T-AOC,T-SOD的影響注：同一列不同小寫字母表示同一指標不同處理組間存在顯著性差異(p＜0.05)。綜合對比分析普通組和高脂組小鼠肝勻漿中MDA、T-AOC和相關氧化酶，顯示出高能量膳食誘導使得小鼠肝臟中MDA含量升高，T-AOC降低，GSH-Px和T-SOD活力下降，機體抗氧化能力減弱，OPE和茶多酚都能夠增強機體抗氧化能力，OPE的作用成效要優于茶多酚。用肉眼觀察圖15解剖后肝臟圖片可知，普通組、洋高組和洋中組的肝臟外觀顏色呈紅褐色，表面光滑且有光澤，邊緣銳利，質軟有彈性；肥胖組和洋低組小鼠的肝臟則呈土黃色，沒有光澤，腫大易碎，肝表面比普通組粗糙，邊緣圓頓，切面有油膩感；陽性組小鼠情況介于二種之間，優于肥胖組和洋低組，但不及中、高劑量效果好。從圖16病理學觀察中可以看出，高劑量組和中劑量組的肝細胞形態、大小正常，肝索排列相對整齊，肝小葉結構無損壞，與普通組無太大差異。高脂組的肝細胞可見炎性細胞浸潤，小泡性脂肪浸潤增多，肝細胞發生脂肪變性。陽性組肝細胞脂肪化程度比高脂組和洋低組有改善，但效果不及洋中組，說明OPE一定劑量能有效改善小鼠肝細胞脂肪變性的癥狀，脂肪化肝細胞的修復作用明顯。脂肪細胞的超微顯微鏡的觀察結果見圖17。與普通組相比，高脂組的脂肪細胞在形態上明顯膨大，顯微鏡同視野內脂肪細胞數量減少。陽性對照組和實驗低劑量組脂肪細胞大小不一，能夠在一定程度上減少脂肪細胞的大小。洋高組及洋中組的脂肪細胞形態較為均一，且細胞直徑明顯小于高脂組，同一視野范圍內脂肪細胞數量增加，且效果優于陽性組，可以看出OPE比茶多酚更能夠減少脂肪細胞的累積，抑制脂肪細胞膨大。表10小鼠脂肪細胞的直徑及面積注：同一列不同字母表示同一指標不同處理組間顯著性差異(p＜0.05)。脂肪細胞的直徑長短和面積大小從表10可以看出，高脂組脂肪細胞的直徑和面積均顯著(P<0.05)高于普通對照組，實驗組和陽性組與高脂組相比，脂肪的細胞直徑及細胞面積均有顯著(P<0.05)降低，中、高劑量組起到調節脂肪細胞大小的作用最優，效果優于陽性組。脂肪細胞大小表現出與脂肪組織累積的程度以及體重呈正相關，研究表明肥胖過程伴隨著體內脂肪細胞增大增多，脂肪細胞在體內累積增加，從而引起肥胖現象。推測OPE可能是通過加速體內脂肪動員，阻礙脂肪在細胞內累計過多，從而減小脂肪系數，達到減肥的效果。隨著物質生活對品質需求的提升以及個人保健意識的逐漸加強，人們對保持健康且形態美的身體顯得格外的重視，且肥胖給人們帶來的影響不言而喻，于是更多有發展有前景的抗肥胖產品的研發被提上日程。動物模型是研究抗肥胖藥物效果、吸收途徑以及作用機理的主要工具，選用正確合適的動物對象是實驗成功的前提。國內外很多專家將C57BL/6J小鼠應用于肥胖領域的研究，因為C57BL/6J小鼠已經完成全基因組的測序，遺傳背景相對明確，個體間的差異較小，對高能量飼料敏感，C57BL/6J小鼠通過飲食誘導形成肥胖模型周期較短，易形成肥胖模型。劉芳等利用C57BL/6J、ICR和KM三種品系的小鼠建立肥胖模型，通過研究對比每個品系小鼠的體重、脂肪重量、機體酶活性及脂肪細胞形態，發現C57BL/6J小鼠比其它兩種小鼠更容易形成肥胖模型，相關指標的波動幅度更具有代表性。C57BL/6J小鼠在肥胖領域的應用有很多，為人們尋求健康和美做出了非常多的貢獻。如Stewart等以C57BL/6J小鼠為實驗對象，研究了槲皮素對高能量飲食后的能量消耗及抗炎水平的影響；顧芹等以C57BL/6J雄性肥胖小鼠為試驗對象，研究了不同干預治療對脂肪組織中TNF-α的影響；曹玉珍等用高脂飼料誘發C57BL/6J小鼠形成脂肪肝，對建模后小鼠的血脂、肝脂質及相關轉氨酶進行了研究，結果表明C57BL/6J小鼠是建立脂肪肝模型非常匹配的品系；朱婷婷以C57BL/6J小鼠為研究對象，探討了高脂高膽固醇飲食是否會引發脂質在肺組織和肺泡上皮細胞上的沉積。綜合以上報道表明，C57BL/6J小鼠非常適合作為試驗對象用于肥胖領域的研究，除此之外，C57BL/6J小鼠還可以廣泛用于遺傳學、免疫學、腫瘤學及老年病學研究中。體重、腹腔脂肪重量、Lee’s指數是判斷肥胖程度的主要標準。肥胖是指機體內脂肪存積過多，使體重增加而引發的病癥，過多的脂肪蓄積常會伴隨血脂異常。體重和脂肪量是最直觀、簡便評判肥胖與否的指標，本實驗中高脂組小鼠體重顯著高于普通組，體重增長率高于20％，說明高脂小鼠成功造模。OPE試驗組的小鼠體重較高脂組相比有不同程度的降低，其中洋高組體重相對降低9.95％，洋中組相對降低了8.61％，兩組體重差異不顯著(P>0.05)。陽性組體重相對降低了4.73％，效果沒有中、高劑量OPE的好，但是高于洋低組，說明一定劑量的OPE比茶多酚能發揮更好的抑制體重增長的作用。小鼠攝食量沒有顯著差異，表明OPE沒有影響小鼠的食欲。實驗組小鼠的脂肪重量和脂肪系數低于高脂對照組，說明OPE可能是通過促進脂肪分解達到了抑制體重增長的作用，這可能與小鼠血漿和垂體中的生長激素(GH)水平有關。當小鼠通過高脂膳食誘導形成肥胖后，血漿和垂體中GH含量會降低，從而使促進脂解的能力下降，脂肪細胞會變得膨大或聚積的越來越多，但這些激素的分泌和脂肪的變化都會受到OPE的影響。小鼠喂食高脂飼料易形成肥胖模型，可能因為小鼠的機體不能將攝入的脂肪及時地氧化，而且脂肪在漸漸向體內臟器沉積的過程中會伴隨著碳水化合物的氧化，還有消耗能量的能力減弱。所以飼食高能量膳食的小鼠，比食用普通基礎飼料小鼠體重增加的快。本實驗中，各組小鼠對食物的攝入量沒有統計學差異，這說明在飼養過程中沒有因為灌胃操作而使小鼠生病、厭食，也說明小鼠對洋蔥特有的辛辣味沒有產生抵抗行為，日常生活中的攝食飲水都表現正常。食物利用率指小鼠對相同重量食物的吸收利用程度，與體重、攝食量有密不可分的關系。本實驗中，高脂對照組小鼠體重增長最顯著，同時食物的利用率也顯著(P<0.05)高于普通對照組；實驗組小鼠體重相對高脂組比有不同程度的降低，食物利用率的水平也呈現不同程度的下降趨勢，說明OPE可能是通過抑制機體對食物的吸收利用率而達到控制體重的目的。動物的Lee’s指數相當于人體評判肥胖的指標BMI，數值越大，說明機體越肥胖。本實驗中高脂組的Lee’s指數顯著(P<0.05)高于普通組，再次證明了肥胖建模的成功。實驗組和陽性組的Lee’s指數與普通組不存在顯著性差異，說明OPE和茶多酚都有控制肥胖的作用。不過洋低組Lee’s指數降低較少，與高脂組沒有統計學差異，說明OPE的減肥效果有量效關系。機體的肥胖與否和生長發育情況，一定程度上會在動物的臟器上體現，臟器指標能夠從基礎上反映出機體的健康狀況及生長狀態。本實驗結果表明，各組小鼠的心臟、脾臟和腎臟的影響較小，沒有顯著性差異，說明OPE沒有損害心臟、脾臟和腎臟的功能，沒有明顯的副作用。在同等的飼養環境下，高脂對照組肝臟指數顯著(P<0.05)高于其他組，這可能是過多的能量攝入以脂肪的形式沉積在肝臟上，使肝臟發生腫大。同時肝臟是機體新陳代謝和消化吸收的重要器官，是最大的消化腺，自身很容易受到進入體內的食物和周圍環境的影響。實驗組和陽性組的肝臟指數與高脂組比有顯著性差異(P<0.05)，肝臟指數降低，說明食用高脂飼料的同時灌胃OPE能減少脂肪在肝臟中的沉積，降低脂肪肝發生的幾率。KyeWonPark等的研究顯示，黃酮類物質能很好的保護肝臟，減少肝臟脂肪的沉積，降低肝臟指數。TG是脂肪在人體內主要的貯存方式，是脂類代謝的重要指標，膽固醇也是脂質代謝的重要指標之一，是許多疾病的影響因子。血漿中TG和TC的濃度超過正常限定值，一般會被診斷為高脂血癥。肥胖的人一般都帶有高脂血癥，使血液的粘滯程度增加，加大患心血管疾病的危險。HDL-C是逆向轉運膽固醇的載體，作用是將周圍組織中的膽固醇吸收起來，然后運送至肝臟使其分解，以清除因LDL攝入過多造成的膽固醇及膽固醇酯在血管壁上的沉積。體態肥胖者基本都會出現脂肪代謝異常，主要的特征就是TG、TC和LDL-C的濃度較正常人高，HDL-C含量相反地會降低。本實驗中，高脂組小鼠的血液生化指標與此現象一致，脂肪代謝出現紊亂，這可能與肥胖者胰島素水平較高密切相關，高胰島素會加速脂肪的合成，同時也會減慢TG自身的降解速度。本實驗采用高脂膳食誘導的方法，通過高脂飼料誘導小鼠形成高脂血癥，使脂肪代謝紊亂，這與人類的單純營養性肥胖有一定的相似性。對血清生化指標進行測定，結果表明，高脂組小鼠的TC、TG、LDL含量明顯高于普通組，HDL含量卻顯示降低，說明小鼠高脂血癥模型成功。實驗組和陽性組均能不同程度的降低TC、TG、LDL含量，說明OPE和茶多酚都能夠抑制高血脂小鼠血清中TC、TG和LDL-C水平的升高，緩解HDL-C的降低，且OPE的效果更好。高脂組是由高脂膳食誘導的肥胖模型，肥胖易導致代謝綜合征，使血清中FFA升高，因此會降低肝細胞胰島素受體對胰島素的結合能力，并會加速受體胰島素的降解，抑制肝臟對葡萄糖的攝取，引起脂毒性作用。FFA是TG被脂肪細胞分解后的產物，往往肥胖程度越大，脂肪堆積的量會越多，分泌FFA也會越多，中心型肥胖嚴重的危害性就是歸因于此。過量的FFA分泌，會損害胰島β-細胞，引發糖尿病，還會造成脂肪肝和高血壓等疾病。本實驗中，實驗組和陽性組都能減少FFA的分泌，中、高劑量組和陽性組的FFA含量與普通組無顯著差異，但洋低組降低的不明顯。有研究表明，黃酮類物質主要是通過抗氧化作用來實現降血脂的作用，大量動物試驗及臨床研究證實，機體抗氧化能力的衰弱與肥胖有密切聯系。肥胖減弱機體抗氧化能力的途徑可能是通過降低抗氧化酶、過氧化物酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶的活性而達到的，而過多的脂質過氧化物和ROS可消耗細胞內谷胱甘肽和維生素E，導致機體酶促及非酶促防御體系的抗氧化能力減弱。黃酮類化合物中某些成分可鰲合金屬離子，使其失去催化脂質氧化的能力，阻礙氧化反應的發生，從而促進抗氧化能力提高。SOD是保護機體不受抗氧化損傷最重要的一類抗氧化酶，T-AOC則是反映機體總抗氧化水平高低的指標，GSH是“抗氧化劑復合鏈”主要成員之一，是機體內分解過氧化物的一類抗氧化劑。實驗結果發現高能量飲食使高脂組小鼠肝勻漿中T-SOD、T-AOC、GSH-Px水平明顯下降，增加了脂質過氧化終產物MDA的含量，表明機體抵抗氧化損傷的體系被破壞，不能正常發揮清除自由基的作用。而實驗組可以使小鼠肝臟中MDA含量下降，T-AOC活力增強，提升機體防御體系，說明OPE可以有效提高SOD和GSH-Px的活性，降低MDA帶來的損害，并且能力的大小與劑量的多少呈相關性。單純性脂肪肝主要是脂肪、脂肪酸和TG在肝臟上聚積形成負荷，肝臟動態平衡被破壞，FFA含量增多被陸續運送至肝組織，而肝臟對FFA的氧化能力下降，加重TG血癥。用400倍顯微鏡觀察肝臟切片，飼喂基礎飼料的普通組肝組織的結構完整，肝細胞呈放射狀規則地排列在中央靜脈周圍，并且肝小葉的結構非常清晰。但是高脂組的肝組織切片呈現出片狀模糊，肝細胞發生腫脹，細胞中含有大小不等的脂肪滴空泡，出現脂肪細胞浸潤。陽性組的肝細胞脂肪浸潤數量少于高脂組，能一定程度的減少肝臟上脂肪的堆聚，經大量報道證實，茶多酚起到減肥作用的主要途徑就是抑制膽固醇在體內的吸收，以及加速機體內不必要的脂肪分解。從染色后的肝組織顯微圖片看，中、高劑量組的肝細胞出現脂肪滴的數量比陽性組更少，說明一定劑量的OPE會比茶多酚更能抑制脂肪沉積，OPE的效果更佳。肥胖患者一般對外界的應激反應不是很敏感，能量消耗的較少，多余的能量就會以中性脂肪的形式儲存起來，形成白色脂肪組織，這也是為什么肥胖的人不容易瘦下來的原因。脂肪細胞是評價能量代謝平衡的關鍵指標，可以通過分泌細胞因子，調節和控制機體的行為和功能，還可通過自身的氧化能力調節脂類的數量。有研究表明，大多數成人體內脂肪細胞的數量不會發生顯著變化，肥胖者一般不是脂肪細胞的個數增多，而是體積的膨大，越來越多大型的脂肪細胞堆積在一起，就導致了脂肪細胞的變性而形成肥胖。通過對各組小鼠脂肪細胞直徑及面積的測定，我們可以看出實驗組和陽性對照組能夠顯著抑制脂肪細胞體積的膨大。OPE對飲食誘導的營養性肥胖小鼠有明顯的抑制肥胖效果，并且減肥的作用程度與劑量大小呈正相關。OPE濃度過低不能發揮出理想的減肥效果，中、高劑量的作用效果比較可觀，效果比同等劑量的茶多酚突出，說明OPE能夠發揮出良好的抑制脂肪細胞膨大、緩解脂肪細胞堆積的作用。通過本發明，1.洋蔥皮中黃酮類化合物蘆丁、槲皮素和山奈酚的含量分別為0.2785mg/g、70.85mg/g、0.7mg/g，槲皮素是洋蔥皮中主要的黃酮類物質；2.OPE能夠減輕小鼠因攝食高脂飼料導致的營養性肥胖，對攝食量沒有顯著影響，說明OPE不是通過降低食欲達到減肥的作用，小鼠糞便形態正常，不會引起腹瀉；3.OPE能夠有效改善小鼠的血脂水平，加快體內脂質的代謝，并提高機體的抗氧化能力，降低患動脈粥樣硬化的風險；4.OPE能有效抑制脂肪細胞的膨大，減小脂肪細胞體積，并可清除脂肪在肝臟上的沉積，加快脂肪細胞的動員與代謝，預防脂肪肝的發生；5.OPE降脂減肥的作用與劑量有關，存在劑量效應，中、高劑量效果最為明顯，沒有顯著性差異，而低劑量的效果不很明顯，說明一定劑量的OPE具有預防肥胖的作用。通過本發明的制備方法得到的產品，其粗提產品適用于制備各種功能性保健食品，精提產品既可適用于功能性保健食品的制備，也可適用于抗氧化藥品及減肥藥品的制備。當前第1頁1 2 3