本發明屬于生物
技術領域：
，具體涉及一種用于監測膠質細胞瘤病情進展的標志物。
背景技術：
：膠質細胞瘤是成人中心神經系統發病率最高和致命的腦腫瘤。按病理和臨床特點可分為I至IV極，其中多形性膠質母細胞瘤(GBM)是膠質細胞瘤中惡性程度最高的亞型。近年來盡管在多重治療方面已取得了一些進展，但膠質細胞瘤病人的預后并沒有明顯改善，GBM病人的平均生存時間仍然不超過14個月。隨著全基因組和轉錄組測序技術的發展，研究者發現了大量的長鏈非編碼RNA(LncRNA)，有關LncRNA研究的關注度也越來越高。LncRNA是一種不編碼蛋白質的轉錄子，它在推進對于人類健康和疾病的生物學進展的認識中扮演了重要角色。研究表明，各型LncRNA在中樞神經系統中的表達水平存在差異，同時部分已被證實在膠質細胞瘤的發生發展過程中有著重要作用。對于LncRNA在膠質細胞瘤中作用的探究有助于獲得一些潛在的膠質細胞瘤的生物標志物及對膠質細胞瘤的診斷、治療以及預后的判斷。技術實現要素：本發明的一個目的是提供檢測DILC基因或其部分片段表達水平的物質的新用途。本發明提供了檢測DILC基因或其部分片段表達水平的物質在制備診斷或輔助診斷膠質細胞瘤的產品中的應用。本發明還提供了檢測DILC基因或其部分片段表達水平的物質在診斷或輔助診斷膠質細胞瘤中的應用。本發明還提供了檢測DILC基因或其部分片段表達水平的物質在制備檢測或輔助檢測待測患者是否為膠質細胞瘤患者的產品中的應用。本發明還提供了檢測DILC基因或其部分片段表達水平的物質在檢測或輔助檢測待測患者是否為膠質細胞瘤患者中的應用。本發明還提供了檢測DILC基因或其部分片段表達水平的物質在制備監測或輔助監測膠質細胞瘤患者的疾病進展的產品中的應用。本發明還提供了檢測DILC基因或其部分片段表達水平的物質在監測或輔助監測膠質細胞瘤患者的疾病進展中的應用。上述應用中，所述檢測DILC基因或其部分片段表達水平的物質為檢測DILC基因或其部分片段表達水平所需的試劑和/或儀器。在實際應用中，可以利用高通量測序檢測DILC基因或其部分片段表達水平所需的試劑和/或儀器，或利用定量PCR檢測DILC基因或其部分片段表達水平所需的試劑和/或儀器，或利用northern雜交技術檢測DILC基因或其部分片段表達水平所需的試劑和/或儀器，或利用基因芯片檢測DILC基因或其部分片段表達水平所需的試劑和/或儀器。上述應用中，所述檢測DILC基因或其部分片段表達水平的物質為如下1)或2)；1)由序列表中序列2所示的單鏈DNA分子和序列表中序列3所示的單鏈DNA分子組成的引物對A；2)由序列A所示的單鏈DNA分子和序列B所示的單鏈DNA分子組成的引物對B；所述序列A為將序列2刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列2具有相同功能的核苷酸；所述序列B為將序列3刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列3具有相同功能的核苷酸。本發明的第二個目的是提供一種檢測或輔助檢測待測患者是否為膠質細胞瘤患者的試劑盒。本發明提供的檢測或輔助檢測待測患者是否為膠質細胞瘤患者的試劑盒包括檢測DILC基因或其部分片段表達水平的物質。上述試劑盒中，所述試劑盒還包括記載如下判斷標準的可讀載體a1)或a2)：a1)若待測患者DILC基因或其部分片段的相對表達量為0-0.057，則待測患者為或候選為膠質細胞瘤患者；若待測患者DILC基因或其部分片段的相對表達量高于0.057，則待測患者不為或候選不為膠質細胞瘤患者；a2)待測患者DILC基因或其部分片段表達水平越低，待測患者的膠質細胞瘤等級越高。上述試劑盒中，所述檢測DILC基因或其部分片段表達水平的物質為如下1)或2)或3)或4)：1)由序列表中序列2所示的單鏈DNA分子和序列表中序列3所示的單鏈DNA分子組成的引物對A；2)由序列A所示的單鏈DNA分子和序列B所示的單鏈DNA分子組成的引物對B；所述序列A為將序列2刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列2具有相同功能的核苷酸；所述序列B為將序列3刪除或增加或改變一個或幾個核苷酸，且與序列3具有相同功能的核苷酸；3)含有1)所述引物對A或2)所述引物對B的PCR試劑。本發明的第三個目的是提供上述試劑盒或上述可讀載體a1)或a2)的新用途。本發明提供了上述試劑盒或上述可讀載體a1)或a2)在如下(1)-(3)中任一種中的應用：(1)診斷或輔助診斷膠質細胞瘤；(2)檢測或輔助檢測待測患者是否為膠質細胞瘤患者；(3)監測或輔助監測膠質細胞瘤患者的疾病進展。本發明的第四個目的是提供一種檢測或輔助檢測待測患者是否為膠質細胞瘤患者的方法。本發明提供的檢測或輔助檢測待測患者是否為膠質細胞瘤患者的方法包括如下步驟：檢測待測患者的DILC基因或其部分片段的相對表達量，根據待測患者的DILC基因或其部分片段的相對表達量判斷待測患者是否為膠質細胞瘤患者：若待測患者DILC基因的相對表達量為0-0.057，則待測患者為或候選為膠質細胞瘤患者；若待測患者DILC基因的相對表達量高于0.057，則待測患者不為或候選不為膠質細胞瘤患者。本發明的第五個目的是提供一種監測或輔助監測膠質細胞瘤患者的疾病進展的方法。本發明提供的監測或輔助監測膠質細胞瘤患者的疾病進展的方法包括如下步驟：檢測待測患者的DILC基因或其部分片段的相對表達量，根據待測患者的DILC基因或其部分片段的相對表達量判斷待測患者的膠質細胞瘤等級：待測患者DILC基因或其部分片段表達水平越低，待測患者的膠質細胞瘤等級越高。上述方法中，所述檢測待測患者的DILC基因或其部分片段的相對表達量是以待測患者的cDNA作為模板，采用上述引物對A或引物對B進行實時定量PCR。上述方法中，所述相對表達水平采用2-△ΔCt方法計算，計算公式如下：2-ΔΔCT＝2-(ΔCT膠質細胞瘤組-ΔCT正常組)＝2-[(CT膠質細胞瘤組目的基因-CT膠質細胞瘤組內參基因)-(CT正常組目的基因-CT正常組內參基因)]，所述目的基因為DILC基因，所述內參基因為GAPDH。本發明的第六個目的是提供DILC基因或其部分片段作為標志物的新用途。本發明提供了DILC基因或其部分片段作為標志物在如下(1)-(3)中任一種中的應用：(1)診斷或輔助診斷膠質細胞瘤；(2)檢測或輔助檢測待測患者是否為膠質細胞瘤患者；(3)監測或輔助監測膠質細胞瘤患者的疾病進展。上述應用或上述產品或上述方法中，所述部分片段為DILC基因第152-393位所示的DNA分子。上述應用或上述產品或上述方法中，所述膠質細胞瘤為腦膠質細胞瘤。上述應用或上述產品或上述方法中，所述表達水平為轉錄水平。本發明的最后一個目的是提供一種DNA片段。本發明提供的DNA片段為DILC基因第152-393位所示的DNA分子。本發明提供了一種用于膠質細胞瘤病情進展檢測的標志物，其為一種長鏈非編碼RNAdown-regulatedinlivercancerstemcells(以下簡述為DILC)，并發現DILC基因的表達水平與膠質細胞瘤病情進展存在相關性，建立了通過實時定量PCR的方法檢測DILC基因的表達水平的方法。通過實驗證明：按臨床分期分組結果顯示，I/II期、III期、IV期膠質細胞瘤患者DILC基因的表達水平均顯著低于正常對照組，III期、IV期膠質細胞瘤組DILC基因的表達水平顯著低于I/II期組，具有顯著性差異。說明DILC基因表達水平與膠質細胞瘤病情進展之間的密切程度高，呈顯著負相關性，即DILC表達水平越低，膠質細胞瘤等級越高。本發明提供的檢測DILC基因的表達水平的引物特異性好，且檢測方法精確、快速，可用于臨床診斷或監測膠質細胞瘤病情進展。附圖說明圖1是realtimeq-PCR擴增組織樣本DILC的溶解曲線。圖2是realtimeq-PCR擴增組織樣本GAPDH的溶解曲線。圖3是膠質細胞瘤按臨床分期分組，組織樣本DILC表達水平的柱形圖。其中，縱坐標為DILC表達水平，橫坐標為臨床分期。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。實施例1、檢測DILC基因表達水平的引物設計在GeneBank中下載長鏈非編碼RNADILC的核酸序列，選擇序列1所示的DNA分子(DILC基因的第152-393位)作為實時定量PCR的靶序列，設計并合成針對實時定量PCR檢測DILC基因序列的特異性引物，引物序列如下：上游引物：f1:5'–CAGAACCTTAGTCCCGGGAA-3'(SEQIDNo.2)；下游引物：r1:5'–CGTCTGCCACTTCGTTGTAG-3'(SEQIDNo.3)。實施例2、DILC基因在作為膠質細胞瘤疾病進展標志物中的應用一、實時定量PCR檢測DILC基因表達水平1、膠質細胞瘤病例及對照樣本全部腦膠質細胞瘤病例共43例，來自于中國河北醫科大學第二醫院醫學捐贈。按2007年世界衛生組織(WHO)病理分級標準，43例腦膠質細胞瘤病例分組如下：I/II級，23例；III級，7例；IV級，6例。醫學捐贈收取的43例腦膠質細胞瘤病例組織標本均經當地醫學倫理委員會批準后獲得，保存于液氮內，供實驗所用。正常對照樣本共7例。2、cDNA的獲得(1)RNA的提取研磨步驟1中的臨床組織樣本，提取RNA。RNA的提取方法具體見TAKARA公司生產的RNAisoPLUS試劑說明書。每份組織樣本提取RNA后都分別對提取的RNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，利用紫外分光光度儀檢測其濃度。計算1微克所需反轉錄用量。(2)cDNA的獲得以RNA為模板，采用TAKARA公司PrimeScriptRTreagentKit試劑盒反轉錄獲得cDNA。3、實時定量PCR檢測DILC基因的表達以cDNA為模板，以實施例1中設計的上游引物f1和下游引物r1為引物，采用Thermoscientific公司MaximaSYBRGreen/ROXPCRMasterMix(2X)試劑盒進行實時定量PCR。每個模板做2個復孔。同時以hGAPDH磷酸甘油醛脫氫酶為內參照物，其上下游引物間的hGAPDH片段長180bp。內參基因的引物序列如下：上游引物：f2:5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'(SEQIDNo.4)；下游引物：r2:5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3'(SEQIDNo.5)。PCR反應體系如下：MaximaSYBRGreen/ROXqPCRMasterMix5ul，上游引物ForwardPrimer(10uM)0.5ul，下游引物ReversePrimer(10uM)0.5ul，cDNA0.5ul，Nuclease-FreeWater3.5ul，上游引物和下游引物在PCR反應體系中終濃度均為0.3uM。PCR反應條件如下：95℃預變性10min；95℃15s，60℃60s，40個循環；95℃變性15s，60℃60s，95℃30s，60℃延伸2min。部分樣本的DILC、GAPDH溶解曲線如圖1和圖2所示。溶解曲線的結果表明本發明設計的擴增DILC基因的引物特異性較好。二、DILC基因表達水平與膠質細胞瘤疾病進展情況的相關性分析采用2-△ΔCt方法計算目的基因DILC相對表達量并運用SPSS13.0版統計軟件包目的基因DILC的表達水平進行分析。具體方法如下：以hGAPDH磷酸甘油醛脫氫酶為內參照物，以正常組為對照。相對表達量的計算公式如下：2-ΔΔCT＝2-(ΔCT膠質細胞瘤組-ΔCT正常組)＝2-[(CT膠質細胞瘤組目的基因-CT膠質細胞瘤組內參基因)-(CT正常組目的基因-CT正常組內參基因)]。各實驗數據均進行正態性及方差齊性檢驗，服從正態性及方差齊性，兩組間比較用t檢驗；不符合正態性或方差齊性條件的進行秩和檢驗，檢驗水準取α＝0.05，P<0.01為差異非常顯著，P<0.05為差異顯著，P>0.05無顯著差異。膠質細胞瘤組和正常組的DILC基因表達水平的檢測結果如表1所示。DILC基因在I/II期、III期、IV期膠質細胞瘤組中的表達水平如下：DILC基因在I/II期膠質細胞瘤組中的相對表達量(2-ΔΔCT)為0.057(-0.007,0.02)，在III期膠質細胞瘤組中的相對表達量(2-ΔΔCT)為0.031(-0.004，0.002)，在IV期膠質細胞瘤組中的相對表達量(2-ΔΔCT)為0.013(-0.001,0.001)，DILC基因在正常組中的相對表達量(2-ΔΔCT)為1.00(-0.25,0.3)。t檢驗分析結果表明：I/II期、III期、IV期膠質細胞瘤組中DILC基因的相對表達量和正常組相比明顯降低，且有顯著性差異P＜0.05。IV期膠質細胞瘤組中DILC基因的相對表達量明顯低于I/II期膠質細胞瘤組中DILC基因的相對表達量，且有顯著性差異P＜0.05(圖3)。表1、I/II期、III期、IV期膠質細胞瘤組DILC表達水平組織等級例數相對表達量(2-ΔΔCT)正常腦組織7例1(-0.25,0.3)I/II級23例0.057(-0.007,0.02)*III級7例0.031(-0.004,0.003)*ΔIV級6例0.013(-0.001,0.001)*Δ#表中，*：P<0.05，與正常對照組比較；△：P<0.05，與I/II期組比較；#：P<0.05，與III期組比較上述實驗結果表明：DILC基因可作為膠質細胞瘤疾病進展標志物，其表達水平與膠質細胞瘤疾病進展之間的密切相關，可用于膠質細胞瘤早期診斷，判斷待測患者是否為膠質細胞瘤患者，具體判斷方法如下：采用上游引物f1和下游引物r1檢測待測患者DILC基因的相對表達量，若待測患者的DILC基因的相對表達量為0-0.057，則待測患者為或候選為膠質細胞瘤患者；若待測患者的DILC基因的相對表達量高于0.057，則待測患者不為或候選不為膠質細胞瘤患者。序列表<110>中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所河北醫科大學第二醫院<120>一種用于監測膠質細胞瘤病情進展的標志物<160>5<210>1<211>242bp<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1cagaaccttagtcccgggaaaggcgtggtgtccctcgtggccgttcacccctccaccgtc60aacccgctcgggaagcagctcttgccaaaaacctttggacagtccaatgtcaacattgcc120cagcaagtggaagcgcaacaggaaaggagagaagaatggcaagggcctacggcatttctc180catgaaggtctgcgagaaggtgcagaggaaagggaccacttcctacaacgaagtggcaga240cg242<210>2<211>20bp<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>2cagaaccttagtcccgggaa20<210>3<211>20bp<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3cgtctgccacttcgttgtag20<210>4<211>20bp<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>4tgcaccaccaactgcttagc20<210>5<211>21bp<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>5ggcatggactgtggtcatgag21當前第1頁1 2 3