用于治療成膠質細胞瘤的治療組合物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及用于治療診斷患有多形性成膠質細胞瘤(GBM)的動物的組合物和方法。
【專利說明】用于治療成膠質細胞瘤的治療組合物
[0001]交叉引用相關申請
本專利申請要求獲得2010年10月25日提交的美國臨時申請號61/406，429的優先權益處，該申請清楚地通過引用并入本文。
[0002]發明背景
多形性成膠質細胞瘤(GBM)是人中常見類型的原發性腦腫瘤，且是非常侵襲性和毀滅性的癌癥，存活中值約為一年。(Eramo等人，Chemotherapy resistance of glioblastoma stem cells, Cell Death and Differentiation (2006) 13, 1238-1241)。成膠質細胞瘤具有任何中樞神經系統惡性腫瘤中最差的預后。GBM的治療是困難的，這是因為其在大腦中的生物位置。目前治療可以包括化療、放射、放射外科手術、糖皮質激素、抗血管生成治療和外科手術。盡管開發了新的手術和放射技術且使用了多種抗腫瘤藥物，但是卻沒有治愈惡性神經膠質瘤。(Eramo 等人，Chemotherapy resistance of glioblastoma stem cells,Cell Death and Differentiation (2006) 13, 1238-1241)。成膠質細胞瘤細胞對于細胞毒性劑是耐受的，且在成膠質細胞瘤患者中很短時間期間內復發的高發病率提示腫瘤發生性細胞能夠壓倒治療。
[0003]發明概沭
本發明提供了抗腫瘤組合物，其包含純化的成膠質細胞瘤GBM6-AD干細胞。在某些實施方案中，細胞是無血清培養基中的貼壁細胞系，其可用于產生抗腫瘤免疫應答。在某些實施方案中，本發明提供了成膠質細胞瘤干細胞系(GBM6-AD)，指定為ATCC?專利保藏命名PTA-11498。在某些實施方案中，GBM6-AD細胞是裂解的。在某些實施方案中，GBM6-AD細胞是輻射的。在某些實施方案中，抗腫瘤組合物進一步包含生理上可接受的無毒媒介物。在某些實施方案中，抗腫瘤組合物進一步包含佐劑。在某些實施方案中，佐劑是咪喹莫特。在某些實施方案中，佐劑是toll樣受體(TLR)配體，如CpG 0DN、膜聯蛋白A2、聚ICLC、或刺激免疫應答的非TLR配體。在某些實施方案中，組合物與載體如樹突狀細胞或巨噬細胞綴合。在某些實施方案中，組合物被包含在非細胞載體如脂質體中。
[0004]本發明提供了在需要其的動物中引發免疫應答的方法，其包括將上述抗腫瘤組合物施用于動物。在某些實施方案中，動物是哺乳動物，如人或非人哺乳動物。在某些實施方案中，該方法進一步包括將咪喹莫特施用于動物。在某些實施方案中，在施用抗腫瘤組合物之前施用咪喹莫特。在某些實施方案中，腸胃外如肌內、皮下、皮內、或靜脈內施用抗腫瘤組合物。然而，其他的施用方式，如口服或鼻內或遞送也是可接受的。在某些實施方案中，在多于一個時間點如在兩個時間點施用抗腫瘤組合物。在某些實施方案中，以I Ug -100 mg的劑量范圍施用抗腫瘤組合物。每個施用時間點的GBM6-AD細胞。在某些實施方案中，在每個施用時間點以2 X IO6 GBM6-AD細胞的劑量施用抗腫瘤組合物。在某些實施方案中，局部施用咪喹莫特。在某些實施方案中，在兩個肩胛上注射部位局部施用咪喹莫特。
[0005]在某些實施方案中，該方法進一步包括將輻射治療施用于動物。在某些實施方案中，在施用抗腫瘤組合物之前、期間或之后施用輻射治療。在某些實施方案中，以小于6，000cGY的劑量施用輻射治療。在某些實施方案中，在多個時間點施用輻射治療。在某些實施方案中，在三個時間點施用輻射治療。在某些實施方案中，以5220 cGY的劑量、和隨后的每個360 cGY的兩個額外劑量施用輻射治療。在某些實施方案中，在5220 cGY的劑量后10周施用360 cGY的第一額外劑量，并且在5220 cGY的劑量后14周施用360 cGY的第二額外劑量。
[0006]在某些實施方案中，所述方法進一步包括將輻射敏化劑替莫唑胺施用于動物。在某些實施方案中，輻射敏化劑是“parp抑制劑”(parp是參與DNA修復的蛋白)。在某些實施方案中，輻射敏化劑是替莫唑胺。在某些實施方案中，在初始輻射治療期間施用替莫唑胺。在某些實施方案中，以5-200mg/m2/天的劑量范圍施用替莫唑胺組合物。在某些實施方案中，以75mg/m2/天的劑量施用替莫唑胺。在某些實施方案中，輻射治療是以180cGy部分的5220 cGY的劑量。在某些實施方案中，經6至7周施用輻射治療。在某些實施方案中，該方法進一步包括在初始輻射治療后4周和第8周經連續兩天以180cGy部分施用額外360cGY部分。
[0007]在某些實施方案中，動物是哺乳動物，如人。
[0008]在某些實施方案中，該方法進一步包括將地塞米松施用于動物。在某些實施方案中，在診斷時施用地塞米松治療。在某些實施方案中，到初始輻射治療的第6周使動物斷絕地塞米松。
[0009]在某些實施方案中，該方法進一步包括施用耗竭調節性T細胞或骨髓源性抑制細胞的化療或藥物。實例包括舒尼替尼(sunititib)、ontak、環磷酰胺、吉西他濱、維甲酸(retionoic acid)。
[0010]本發明提供了產生樹突狀細胞疫苗的方法，其包括用上述抗腫瘤組合物脈沖(pulse)樹突狀細胞。
[0011 ] 本發明提供了在動物中引發免疫應答的方法，其包括將上述組合物引入動物中。
[0012]本發明提供了產生對GBM6-AD特異性的抗體的方法，其包括將上述組合物引入動物中，并且分離對GBM6-AD特異性的抗體。
[0013]本發明提供了與純化的貼壁成膠質細胞瘤GBM6-AD干細胞特異性結合的純化的抗體，這種純化的粘附性成膠質細胞瘤GBM6-AD干細胞是ATCC?專利保藏命名PTA-11498。在某些實施方案中，抗體是人抗體或人源化抗體。在某些實施方案中，抗體是單鏈Fv或scFv片段。
[0014]本發明提供了在需要其的患者中治療原發性腦腫瘤的方法，其包括將上述抗腫瘤組合物或與純化的粘附性成膠質細胞瘤GBM6-AD干細胞特異性結合的純化的抗體施用于患者。在某些實施方案中，原發性腦腫瘤是星形細胞瘤、多形性成膠質細胞瘤、成神經管細胞瘤或室管膜細胞瘤。
[0015]附圖概沭
圖1.被用作腫瘤抗原來源的GBM6-AD細胞的流式細胞術數據。柱狀圖顯示同種型染色以對照背景結合(灰色)和測試抗體染色(白色)。
[0016]圖2.在鼠GBM中咪喹莫特/腫瘤裂解物疫苗延長生存。用GL261神經膠質瘤細胞植入到C57BL/6小鼠的右側紋狀體。在腫瘤攻擊后第3、10、17、24、和31天通過皮內注射施用以GL261裂解物的接種。每次將咪喹莫特膏劑施用于皮膚以覆蓋接種部位。用鹽水治療的小鼠用作對照(N=5/組)。在接種組中生存明顯延長(Log-排序；p=00.06)。[0017]圖3.治療方案。在輻射治療(XRT)的前四周期間，一半患者接受替莫唑胺(tem+)且另一半沒有接受替莫唑胺(tem-)。以180 cGy部分給予輻射。從第10至14周每兩周、然后從16至52周每四周施用咪喹莫特/ BTIC疫苗。
[0018]圖4.從在兩種氧張力中生長的人成膠質細胞瘤分離的原代細胞。將相同數量的神經膠質瘤細胞接種于由DMEM/F12，20 ng/ml EGF和FGF和IX B27和N2補充物組成的完全干細胞培養基中。5天后捕捉代表性圖像。
[0019]圖5.本圖提供了在組織培養測定中GBM6裂解物脈沖的DC引發的腫瘤殺傷性T細胞的結果。該數據直接顯示GBM6可以產生腫瘤殺傷性免疫應答。
[0020]圖6A-6C.在5%氧氣中培養的原代GBM細胞系表達高水平的神經膠質瘤相關的和腫瘤起始蛋白。A，通過實時PCR分析5%或20% O2中培養的三種神經膠質瘤細胞的mRNA水平(n=4/組)和B,通過流式細胞術分析蛋白水平(n=3-4/組)。C,通過western分析驗證蛋白水平。* P〈 0.05; ** P〈 0.01。
[0021]圖7A-7D.來自5%氧氣的腦TLs表現出優異的腫瘤殺傷性活性。以用來自5%或20% O2的TL脈沖的DC刺激PBMC，且與A & B HLA-A2匹配的成膠質細胞瘤或C室管膜細胞瘤孵育。D，為了確定增加的腫瘤殺傷性應答是否是MHC-1依賴的，將抗-ABC阻斷抗體在PBMC之前添加至靶細胞。數據代表兩次獨立實驗。誤差條，土 SEM。* P < 0.05; ** P〈
0.010
[0022]圖8A-8C.來自5%氧氣的腫瘤裂解物增加了⑶8 T細胞引發。樹突狀細胞用5%或20% O2中衍生的CFSE標記的TL脈沖，用a -HLA-DR染色，且A，通過流式細胞術分析(3次重復的代表)。CMV+PBMC與用5%或20% O2 TLs +/- pp65肽脈沖的DC共培養持續B，48h，且分析分泌的IFN y產生，C，72h，以確定基于每個細胞的⑶8+pp65五聚體+ IFN Y產生。誤差條，土 SEM * P < 0.05; ** P < 0.01。
[0023]圖9.自體外周血來源的dc治療。
[0024]圖10.治療之前和之后的腫瘤。第一小圖時間=0，第二小圖顯示兩個月后的損傷，且第三小圖顯示后3個月后的損傷。第二個損傷在3個月后消失。
[0025]發明詳沭 抗腫瘤組合物
以前的研究已經顯示，GBM是彌漫性內在腦橋膠質瘤(DIPG)的最常見組織學。相應地，已經表明，DIPG表達GBM相關的免疫原性蛋白，所述免疫原性蛋白是目前臨床試驗中正在革巴向的，包括 IL-13R a 2、Epha2、Her_2、和 EGFRvIII (Wheeler CJ,等人.Vaccinationelicits correlated immune and clinical responses in glioblastoma multiformepatients.Cancer Research.2008;68:5955-5964; Okada H，等人.Expressionof glioma-associated antigens in pediatric brain stem and non-brain stemgliomas.J Neurooncol.2008;88:245-250; Sampson JHj Archer, G.E., Mitchell,D.A., Heimberger，A.B.& Bigner，D.D.Tumor-specific immunotherapy targetingthe EGFRvIII mutation in patients with malignant glioma.Semin Immunol?2008; 20:267-275) 0然而，由于DIPG不是外科手術易接近的腫瘤，所以產生細胞裂解物疫苗是困難的。本發明人已經建立了在無血清干細胞培養基中生長的BTIC細胞系GBM6，其可用于用裂解物疫苗治療DIPG。[0026]本發明也已經建立了親本GBM6細胞系的變體，命名為GBM6-AD，當其在無血清干細胞培養基時中生長時是貼壁的。如本文所使用的，術語“貼壁細胞系”是指細胞系在完全無血清的條件下作為貼壁單層生長(即，細胞在培養基中作為在人工基質上的單層(貼壁培養)、而不是在培養基中自由漂浮地(懸浮培養)生長)。如本文所使用的，術語“貼壁細胞系”是指細胞甚至在沒有用使之貼壁的試劑如纖連蛋白、基質膠或層粘連蛋白處理的標準組織培養瓶(例如，Falcon 75 cm2瓶，10 cm2皿等)上在無血清干細胞培養基中是貼壁的。因此，本細胞附著，甚至在固體基質沒有預先處理的情況下附著于固體基質。這是該細胞系的非常罕見且獨特的特性。該特征允許在相對于在無血清條件下不貼壁的細胞系更快且更便宜的臨床條件下大規模制備細胞。
[0027]GBM6-AD比GBM6更廣泛地傳代，并且隨著時間推移，從液氮中解凍后其生長動力學增加。這是相對于GBM6的顯著優勢，因為可能更快地制備大很多的量的疫苗，這是如果患者正在迅速死亡的重要考慮因素。GBM6還在5% O2中生長延長的時間期間來產生GBM6-AD,這似乎使細胞變得貼壁，并且重要的是，免疫原性更強。
[0028]GBM6-AD在大學的分子和細胞治療(MCT)設施在10，000級生產套件中在大學的醫療中心臨床細胞治療實驗室(FACT-認可的，CAP #18060-01, CLIA #24D0688128)在良好生產規范(GMP)條件下建立的。流式細胞術數據表明，GBM6表達許多重要的DIPG抗原包括IL-13Ra 2、Epha2、和 Her-2(圖1)。此外，GBM6-AD 也表達關鍵的 BTIC 抗原，包括 CD133、巢蛋白、和S0X-2(圖1)。基于該數據，GBM6-AD裂解物的接種靶向在腦的其他部位不存在的大多數DIPG和GBM。
[0029]成膠質細胞瘤干細胞系GBM6-AD已經保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC?保藏中心，10801 University Boulevard, Manassas, Va.20110-2209 USA)且指定為ATCC?專利保藏名稱PTA-11498。該細胞系在2010年11月18日保藏。在本申請未定期間，專利和商標局局長和要求后由局長授權確定的人員將可獲得該保藏物。該保藏物將在ATCC?保藏中心(這是公共的保藏中心)保持30年、或最近要求后5年、專利可實施期間(其永遠更長)，且如果它在此期間沒有活力將進行替代。
[0030]在某些實施方案中，GBM6-AD細胞是操作的，如裂解的或輻射的。可以通過方法包括多個凍融循環或使用高壓氣泡(霧化)以“沖擊”細胞中的孔而實現裂解。裂解物可以快速或使用速率控制向下冷凍(例如，每分鐘1°C )至_80°C或更低的溫度而冷凍裂解物用于儲存。細胞在產生裂解物之前可以輻射，或可以輻射裂解物本身以確保完全的細胞死亡。可以從多種設備包括銫或鈷輻射而遞送輻射。
[0031]佐劑
疫苗通常含有兩個組分:抗原和佐劑。抗原是由免疫應答針對的病原體或腫瘤編碼的分子結構。為了激活抗原特異性免疫應答，抗原必須遞呈在適當的免疫刺激微環境中。在某些實施方案中，佐劑通過刺激產生免疫激活分子如促炎性細胞因子而建立這種微環境。疫苗效力取決于抗原和佐劑的類型，以及如何施用它們。這些組分之間達到正確的平衡是引發保護性免疫的關鍵。
[0032]1.Toll 樣等體
已經估計，大多數哺乳動物物種具有10至15之間的Toll樣受體(TLR)類型。在人中已經鑒定了 11種TLR(簡單命名為TLRl至TLRlI)，并且在其他哺乳動物物種中已經發現了許多這些等價形式。TLR作為二聚體起作用。盡管大多數TLR似乎作為同源二聚體起作用，但是TLR2與TLRl或TLR6形成異源二聚體，每種二聚體具有不同的配體特異性。TLRs在所有生物體中的功能似乎類似，足以使用單一作用模型。每種Toll樣受體在識別存在于微生物上的特定的或特定組的分子決定簇中形成同源二聚體或異源二聚體。
[0033]TLR通過識別病原體相關分子模式和引發炎癥而感受感染。因此，已經開發TLR配體作為疫苗佐劑。在某些實施方案中，TLRl至TLRll的配體可以用作佐劑。抗原的攝取和佐劑對TLR信號傳遞的激活是動態且極端脆弱的過程。理想地，吞噬抗原的抗原遞呈細胞(APC)也將占用TLR配體，導致共刺激分子的增量調節、炎性細胞因子的分泌、和抗原遞呈至T細胞。當APC加工病毒顆粒(其含有TLR配體(例如，dsRNA)和病毒蛋白)時，這肯定是事實。然而，在癌癥疫苗的情況下，已經在混合物中施用抗原和TLR配體。這種方法可以在注射部位導致幾種理論結果:吞噬僅抗原的APC、吞噬僅TLR配體的APC或吞噬TLR配體與抗原(期望的結果)的APC。因此，共同施用可以在獲得的免疫應答中產生信噪比的問題。甚至當抗原和TLR配體由相同的APC吞曬時，時機是關鍵的。Nierkens等人最好地表明了這一點，其顯示了相對于同時攝取，在抗原之前攝取TLR9配體顯著降低了抗原交叉遞呈至 CTL (Nierkens S，等人，Cancer Res.2008;你:5390-5396)。相應地，Ingale等人已經表明，相對于用每種組分的混合物接種，通過共價鍵將TLR2配體與抗原直接綴合使腫瘤反應性IgG的滴度增加了超過100，000倍(Ingale S，等人，Nat Chem Biol.2007:^:663-667)。同樣,相對于兩種組分分開地共同施用，抗原與TLR9配體的偶聯使抗原特異性 T 細胞的數量增加了 5 至 100 倍(Krishnamachari Y，Salem AK.Adv Drug DelivRev.2009;汾:205-217)。[0034]咪唑喹啉是已經作為疫苗佐劑利用的雙環有機分子。咪喹莫特是FDA批準的免疫應答調節劑，其作為霜劑施用在皮膚上用于治療皮膚腫瘤。咪喹莫特在人中通過在漿細胞樣樹突狀細胞和B細胞上表達的TLR7發揮其免疫刺激作用。咪喹莫特治療引起促炎性細胞因子包括干擾素a、干擾素Y、和IL_12(其中所有對于在動物中引發與抗腫瘤和抗病毒活性相關的強大的ThI免疫應答都是重要的)的釋放。局部咪喹莫特已經用作疫苗佐劑，在靶向確定的腫瘤和病毒感染的許多研究中取得了適度成功。然而，通過僅僅依靠TLR7信號傳遞限制了咪喹莫特的效力，因為在最豐富的專用APC之一，即CD8a+TLR7_髓樣樹突狀細胞中不表達TLR7 (Edwards AD,等人，Eur J Iwmunol.2003;827-833)，從而限制效力。出于這個原因，已經通過修飾咪喹莫特開發了其他化合物。
[0035]瑞喹莫特是有效的TLR7和TLR8雙重配體(Wu JJ,等人，An ti viral Res.2004;^:79-83) ?由于TL 8在⑶8 a +髓樣樹突狀細胞中表達，所以它克服了咪喹莫特的限制之一(Coffman RL,等人，Immunity;33。盡管如此，許多因素已經限制了瑞喹莫特和咪喹莫特的效力。一種最近鑒定的治療失敗的機制是，盡管這些藥物誘導促炎性細胞因子，但是它們同時誘導高水平的抗炎性細胞因子如IL-1O (Gibson SJ,等人，CellImmunol.2002;^: 74-86;和 Lu H，等人，/ J遞;7財:5360-5367)。在臨床關聯中，應用咪喹莫特霜劑在治療的腫瘤上起作用，但對于遠端腫瘤不起作用，提示全身免疫中的損傷(Lu H，等人，/ J遞;7財:5360-5367;和 Gill VL,等人，Vet Comp Oncol.2008;^:55-64)。事實上，顯示在咪喹莫特治療后阻斷IL-10導致治療的和遠端(未治療的)腫瘤的控制，表明目前使用的咪唑并喹啉誘導的自我調節的細胞因子應答的臨床意義。因此，存在開發觸發更理想的促炎性細胞因子與抗炎性細胞因子比例的新的基于咪喹并喹啉(imquidazolequinoline)的化合物的需要。在本發明的某些實施方案中，施用TLR-7和/或TLR-8 (或TLR-7/8的組合)分子。
[0036]聚ICLC是由羧甲基纖維素、聚肌胞苷酸和聚-L-賴氨酸雙鏈RNA組成的免疫刺激劑。它是toll樣受體3(TLR3)的配體。
[0037]2.臘聯蛋白A2
膜聯蛋白A2是在人中由ANXA2基因編碼的蛋白。膜聯蛋白2參與多種細胞過程，如細胞運動性(尤其是上皮細胞的運動性)，膜相關蛋白復合物與肌動蛋白細胞骨架的連接，細胞內吞作用，纖維蛋白溶解，離子通道形成，和細胞基質相互作用。它是鈣依賴性磷脂結合蛋白，其功能是幫助組織細胞內的蛋白胞外分泌至胞外結構域。膜聯蛋白2A是多效性蛋白，意味著其功能依賴于在機體中的位置和時間。
[0038]3.寡核苷酸
術語“核酸”或“寡核苷酸”是指至少5個堿基長度的核苷酸的聚合形式。術語“寡核苷酸”包括核酸的單鏈和雙鏈形式。本發明的核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、或任一種核苷酸的修飾形式。通常，雙鏈分子在體內更穩定，盡管單鏈分子當它們含有合成骨架時具有增加的活性。
[0039]如本文所使用的，“寡脫氧核糖核苷酸”(ODN)是約3-1000(或兩者之間的任何整數)個堿基長度的脫氧核糖核酸序列。在某些實施方案中，ODN是約3至約50個堿基長度。淋巴細胞ODN攝取受細胞活化調節。例如，攝取CpG ODN的B細胞增殖和分泌增加量的免疫球蛋白。本發明基于下列發現:含有至少一個未甲基化的胞嘧啶-鳥嘌呤(CpG) 二核苷酸的某些寡核苷酸激活免疫應答。
[0040]“CpG”或“CpG基序”是指具有通過磷酸酯鍵連接的胞嘧啶和隨后的鳥嘌呤的核酸。術語“甲基化的CpG”是指在嘧啶環上、通常發生在嘧啶環的5-位置的胞嘧啶的甲基化。術語“未甲基化的CpG”是指在嘧啶環上的胞嘧啶不存在甲基化。本發明的寡核苷酸中的未甲基化的CpG基序的甲基化、部分除去或除去被認為降低其作用。寡核苷酸中的所有未甲基化的CpG基序的甲基化或除去明顯降低其作用。如果該作用類似于不含有CpG基序的寡核苷酸的作用，那么CpG基序的甲基化或去除的作用是“明顯的”。
[0041]在某些實施方案中，CpG寡核苷酸為約8-1000個堿基大小或約8-30個堿基大小的范圍內。對于在本發明中的應用，可以利用本領域眾所周知的多種方法之一從頭合成核酸。例如，氰乙基亞磷酰胺法(Beaucage, S.L.,和 Caruthers, M.H.，Tet.Let.22:1859, 1981);核苷H-磷酸法(Garegg等人，Tet.Let.27:4051-4054, 1986; Froehler等人，Nucl.Acid.Res.14:5399-5407，1986; Garegg 等人，Tet.Let.27:4055-4058，1986，Gaffney等人，Tet.Let.29:2619-2622，1988)。這些化學物可以通過可購得的多種自動寡核苷酸合成儀進行。
[0042]或者，CpG 二核苷酸可以在質粒中大規模產生(參見Sambrook, T.，等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press,New York, 1989)，它在對受試者 施用后降解為寡核苷酸。可以利用已知技術，如使用限制性酶、外切核酸酶或內切核酸酶的技術，由現有的核酸序列(例如，基因組或cDNA)制備寡核苷酸。[0043]本發明的CpG寡核苷酸是免疫刺激分子。“免疫刺激核酸分子”是指核酸分子，其含有未甲基化的胞嘧啶、鳥嘌呤二核苷酸序列(即，“CpG DNA”或含有胞嘧啶和隨后的鳥嘌呤且由磷酸酯鍵連接的DNA)且刺激(例如，對樹突狀細胞具有促有絲分裂作用，或誘導或增加樹突狀細胞的細胞因子表達)樹突狀細胞。免疫刺激核酸分子可以是雙鏈或單鏈的。通常，雙鏈分子在體內更穩定，而單鏈分子具有增加的免疫活性。
[0044]“核酸”或“DNA”意味著多核苷酸(即，包含與磷酸酯基團和與可交換有機堿基連接的糖(例如，核糖或脫氧核糖)的分子，所述可交換有機堿基是取代的嘧啶(例如，胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶⑴或尿嘧啶(U))或取代的嘌呤(例如腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G))。如本文所使用的，該術語是指核糖核苷酸以及寡脫氧核糖核苷酸。該術語還應當包括多核苷(即多核苷酸減去磷酸酯)和任何其他含有有機堿基的聚合物。核酸分子可以從現有的核酸來源(如基因組或cDNA)獲得，但優選是合成的(例如，通過寡核苷酸合成產生)。
[0045]CpG ODN
已經描述了在結構和表型上不同的三種主要類型的CpG ODN0每種類型的實例連同對類型特定的免疫效果和結構特點顯示于Krieg中(Krieg, 2006, Nature Reviews DrugDiscovery, 5，471-484)。A 類 CpG ODN(也稱為 D 型)是干擾素-a (IFN a )分泌(從漿細胞樣樹突狀細胞)的有效誘導劑，但僅微弱刺激B細胞。A類ODN的結構在5’和/或3’末端包括聚-G基序(三個或更多的連續鳥嘌呤)，其能夠形成非常穩定、但復雜的有序性更高的被稱為G-四分體(G-tetrads)的結構，和含有以自`身互補回文的一個或多個CpG基序的中央磷酸二酯區。這些基序引起A類ODN自我裝配成納米顆粒。B類0DN(也被稱為K型)具有硫代磷酸酯骨架，通常不形成有序性更高的結構，并且是較強的B細胞刺激劑，但是IFNa分泌的弱誘導劑。但是，如果人工地以樹枝狀聚合物或用陽離子脂質轉染迫使B類CpG ODN進入珠粒或微粒上有序性更高的結構，它們發揮與A類CpG ODN相同的免疫概況，從而將有序性更高結構的形成與生物活性連接起來。C類CpG ODN具有在A和B類之間中間的免疫特性，誘導B細胞活化和IFN a分泌。這些特性似乎由這些ODN具有一個或多個5’CpG基序和3’回文的獨特結構所導致，這被認為允許在內體環境中形成雙鏈體(Krieg, 2006.Nature Reviews Drug Discovery, 5, 471-484; Takeshita F.等人，2004.Semin Immunol.16 (I): 17-22; Verthelyi D, Zeuner RA., 2003.TrendsImmunol.24:519-522)。
[0046]CpG ODN是合成的寡核苷酸,其含有在特定的序列環境中未甲基化的CpG 二核苷酸(CpG基序)。與哺乳動物DNA相比，在細菌DNA中CpG基序以20倍更高的頻率存在。基于主要參與識別這些分子的免疫細胞的活化，它們誘導一組協調的免疫應答。基于其在CpG基序的關鍵傳感器漿細胞樣樹突狀細胞(I3DC)上獨特的活性，已經鑒定了兩種類型的CpGODN (Krug A.等人，2001.Eur J Immunol, 31 (7): 2154-63)。CpG-A 是漿細胞樣樹突狀細胞(I3DC)中IFN- a的有效的誘導劑，而CpG-B是IFN- a的弱誘導劑，但是B細胞的有效活化劑。盡管小鼠和人之間的CpG基序不同，但是在這兩個物種中，CpG ODN的識別主要通過 TLR9 介導(Bauer S.等人，2001.Proc Natl Acad Sci USA, 98 (16): 9237-42)。
[0047]最近已經鑒定了新的類型的CpG 0DN，被稱為CpG-C，其同時具有高PDC誘導和B細胞的活化(Hartmann G.等人，2003.Eur J Tmmuno1.33 (6): 1633-41)。CpG-C 的序列組合CpG-A和CpG-B的元件。最有效的序列被稱為M362，其含有具有CG 二核苷酸的中央回文序列(CpG-A的特征性特點)，和在5’末端的“TCGTCG基序”(存在于CpG-B中)。
[0048]制劑
在某些實施方案中，抗腫瘤組合物制劑在媒介物中含有有效量的純化的成膠質細胞瘤GBM6-AD干細胞(“活性成分”)，所述有效量由本領域技術人員容易地確定。活性成分，典型地，可以占此組合物的約1%到約95% (w/w)，如果合適的話或者甚至更高或更低。將要施用的量取決于各種因素，例如考慮接種的動物或人受試者的年齡、體重和身體狀況。該量還取決于此動物的免疫系統合成抗體的能力以及所期望的保護程度。有效的劑量，可由本領域普通技術人員，通過確定劑量應答曲線的常規試驗很容易地確定。通過單次或多次劑量施用生物膜肽或其片段免疫受試者。可以根據需要施用多個劑量。
[0049]在某些實施方案中，鼻內制劑包括既不引起對鼻粘膜的刺激也不明顯妨礙纖毛功能的媒介物。稀釋劑例如水、鹽水溶液或其它已知物質能夠和本發明一起使用。在某些實施方案中，鼻內制劑還含有防腐劑例如，但不限于氯代丁醇和氯化芐烷銨。在某些實施方案中，存在表面活性劑以提高通過鼻粘膜對本發明的蛋白的吸收。
[0050]在某些實施方案中，口服液體制劑是這樣的形式，例如水性或油性懸浮液、溶液、乳劑、糖漿劑或酏劑，或者是以干燥的在使用之前需要用水或其它合適的媒介物重構的片齊喊產品給出。在某些實施方案中，此液體制劑含有常規的添加劑，例如懸浮劑、乳化劑、非水媒介物(可包括食用油)或防腐劑。
[0051]在某些實施方案中，為了制備抗腫瘤組合物，被純化的GBM6-AD如上文所述進行分離、凍干和/或穩定化、裂解。然后將GBM6-AD細胞的量調整到合適的濃度，任選地與合適的佐劑組合，并包裝供使用。合適的佐劑，包括但不限于:咪喹莫特；表面活性劑，例如十六烷基胺、十八烷基胺、溶血卵磷脂、溴化二甲基二十八烷基銨、N，N- 二十八烷基-N' -N-雙(2-羥乙基-丙烷二胺)、甲氧基十六烷基-甘油和復合多元醇；聚陰離子，例如吡喃、硫酸右旋糖酐、多聚肌苷酸多聚胞苷酸(poly 1C)、聚丙烯酸、卡巴浦爾；多肽，例如胞壁酰基二肽、二甲基甘油(aimethylglycine)、特夫素、油類乳劑、明帆和它們的混合物。其它潛在的佐劑包括大腸桿菌熱不穩定毒素的或霍亂毒素的B肽亞基。McGhee，J.R.,等人，〃0nvaccine development, 〃 Sem.Hemato1., 30:3-15 (1993)。最后，可將免疫原性產物慘入到脂質體用于制劑中，或綴合至各種蛋白，例如匙孔孅血藍蛋白(KLH)或人血清白蛋白(HSA)或其它聚合物。
[0052]在某些實施方案中，組合物進一步含有一種或多種已知的TLR配體。具體而言，在某些實施方案中，組合物含有膜聯蛋白A2(蛋白)或膜聯蛋白A2的片段作為新的TLR2配體，其是重要佐劑。在某些實施方案中，TLR配體與GBM-AD中的蛋白通過共價鍵綴合。在某些實施方案中，TLR配體與GBM6-AD蛋白借助馬來酰亞胺化學接頭綴合。
[0053]施用模式
本發明的抗腫瘤組合物、GBM6-AD衍生疫苗、GBM6-AD反應的T細胞和抗-GBM6-AD抗體可配制成藥物組合物并以與選擇的施用途徑相適應的各種形式施用于哺乳動物宿主，例如人患者，所述施用途徑即，口服、鼻內、皮內或腸胃外，或通過靜脈內、肌內、局部或皮下途徑。
[0054]因此，本發明化合物可與藥學上可接受的媒介物(例如惰性稀釋劑或可吸收的可食用載體)相組合進行全身施用，例如口服施用。可將它們包入硬殼或軟殼明膠膠囊中，可壓縮成片劑，或可直接與患者飲食的食物直接并入。對于治療性口服施用，活性化合物可與一種或多種賦形劑混合并以可吸收的片劑、口含片、錠劑、膠囊劑、酏劑、懸浮劑、糖漿劑、薄片劑等形式使用。所述組合物和制劑應該含有至少0.1%的活性化合物。組合物和制劑的百分比當然是可以變化的，通常可方便地為給定單位劑型重量的約2%至約60%。在這類治療有用的組合物中活性化合物的量應為能夠獲得有效劑量水平的量。
[0055]片劑、錠劑、丸劑、膠囊劑等還可含有以下物質:粘合劑，例如西黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑，例如磷酸氫二鈣；崩解劑，例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、海藻酸等；潤滑劑，例如硬脂酸鎂；以及甜味劑，例如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦，或調味劑，例如薄荷、冬綠油，或櫻桃調味劑可以添加。單位劑型為膠囊時，除上述類型的物質外，其還可含有液體載體，例如植物油或聚乙二醇。各種其他物質可以包衣形式存在，或用于以其他方式改變固體單位劑型的物理形態。例如，片劑、丸劑或膠囊劑可用明膠、蠟、紫膠或糖等進行包衣。糖漿或酏劑可含有活性化合物、作為甜味劑的蔗糖或果糖、作為防腐劑的對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯、染料及調味劑例如櫻桃或橙味調味劑。當然，制備任何單位劑型所用的所有物質應該是藥學上可接受的并且在所使用的量下是基本上無毒的。此外，可將活性化合物引入持續釋放的制劑和裝置中。
[0056]活性化合物也可通過輸注或注射進行靜脈內或腹膜內施用。活性化合物或其鹽的溶液可在水中制備，任選地與無毒的表面活性劑混合。分散劑也可在甘油、液態聚乙二醇、三乙酸甘油酯及其混合物中，以及油中制備。在常規貯存及使用條件下，這些制劑含有防腐劑以防止微生物的生長。
[0057]適于注射或輸注的藥物劑型可包括無菌水溶液或分散劑，或者含有適于臨時配制無菌可注射或可輸注溶液或分散劑的活性成分的無菌粉末，其任選地被包封在脂質體中。在所有情況下，最終劑型在生產和貯存條件下均應該是無菌的、流動的并且穩定的。液體載體或媒介物可以是溶劑或液體分散介質，包括例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液態聚乙二醇等)、植物油、無毒的甘油酯、以及它們的合適的混合物。可例如通過形成脂質體、在分散劑情形下通過維持所需的粒度或通過使用表面活性劑從而保持適當的流動性。可通過各種抗細菌劑和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，防止微生物的作用。 在許多情況下，還優選地含有等滲劑，例如糖類、緩沖劑或氯化鈉。可通過在組合物中使用延遲吸收劑，例如單硬脂酸鋁和明膠，從而延長可注射組合物的吸收。
[0058]無菌注射溶液通過將所需量的活性化合物，根據需要與多種以上所列舉的其他成分一起加入適當溶劑中，接著進行過濾滅菌來制備。在制備無菌可注射溶液用無菌粉末的情況下，優選的制備方法為真空干燥和冷凍干燥技術，該方法產生前述過濾滅菌溶液中存在的活性成分與任何其他所需成分的粉末。
[0059]對于局部施用，本發明化合物可以純的形式施用，即，當它們是液體時。但是，通常希望將本發明化合物與皮膚學上可接受的載體相組合，以組合物或制劑形式施用至皮膚上，所述皮膚學上可接受的載體可為固體或液體。
[0060]可用的固體載體包括精細分散的固體，例如滑石、粘土、微晶纖維素、二氧化硅、氧化鋁等。可用的液體載體包括水、醇或二醇或水-醇/ 二醇摻合物，本發明化合物可任選借助無毒的表面活性劑以有效水平溶解或分散于液體載體中。可添加輔劑例如芳香劑及其他抗微生物劑來優化針對給定用途的性質。得到的液體組合物可通過吸收襯墊施用，用于浸潰繃帶及其他敷料，或用泵型噴霧器或氣溶膠噴霧器噴灑在受影響的區域。
[0061]增稠劑例如合成聚合物、脂肪酸、脂肪酸鹽及酯、脂肪醇、改性纖維素或改性礦物材料，也可與液體載體一起使用來形成可延展的膏劑、凝膠劑、軟膏、皂劑等，用于直接應用至使用者的皮膚。
[0062]可用于將本發明化合物送遞至皮膚的皮膚學上可用的組合物的實例為本領域已知的；例如參見 Jacquet 等人(U.S.Pat.N0.4, 608, 392), Geria (U.S.Pat.N0.4,992,478)，Smith 等人(U.S.Pat.N0.4，559，157)和 Wortzman (U.S.Pat.N0.4，820，508)。
[0063]本發明化合物的可用劑量可通過比較它們的體外活性和在動物模型中的體內活性而確定。將小鼠及其他動物的有效劑量外推至人類的方法是本領域已知的；例如，參見U.S.Pat.N0.4,938,949。
[0064]通常，一種或多種本發明化合物在液體組合物例如洗劑中的濃度可為約0.1-25重量-%、優選約0.5-10重量-%。在半固體或固體組合物例如凝膠或粉末中的濃度可為約0.1-5重量-%，優選約0.5-2.5重量。
[0065]用于治療所需的化合物或其活性鹽或其衍生物的量，不僅隨所選的具體的鹽而變化，而且隨施用途徑、所治療病況的性質及患者年齡及狀況而變化，并最終應由治療的內科醫生或臨床醫生決定。`
[0066]但是，通常的合適劑量為每天約0.1至約100mg/kg體重,例如約10至約75mg/kg體重的范圍，例如每天3至約50mg/kg受治療者體重,優選6至90mg/kg/天的范圍,最優選15至60mg/kg/天的范圍。
[0067]化合物通常方便地以單位劑型施用；例如，每單位劑型含有5至lOOOmg、通常10至750mg、最常用的為50至500mg的活性成分。
[0068]理想地，可施用活性成分以獲得約0.5至約75 u M，優選約I至50 ii M，最優選約2至約30 ii M的活性化合物峰值血漿濃度。這可以通過例如靜脈內注射0.05至5%活性成分的溶液，任選其鹽溶液而實現，或者通過口服含有約1-1OOmg活性成分的大丸劑進行施用。可通過連續輸注提供約0.01-5.0mg/kg/h的活性成分，或通過間歇性輸注含有約
0.4-15mg/kg的活性成分，從而保持需要的血液水平。
[0069]所需劑量通常可以單劑量或以合適的時間間隔施用的分劑量提供，例如每天兩次、三次、四次或更多次的亞劑量。所述亞劑量本身還可再分成例如多個不連續的松散間隔的施用；例如通過吹藥器多次吸入或通過多次滴入眼中來施用。
[0070]治療方法
可以多種方式治療患者，包括以下:
疫苗#1:通過遞送將凋亡的GBM6-AD細胞(通過輻射和熱休克誘導，所以細胞還活著但正在死亡，并且所有都注定死亡)與適當的佐劑施用至受試者中。
[0071 ] 疫苗#2:通過遞送將GBM6-AD細胞裂解物(通過凍融或霧化誘導)與適當的佐劑施用至受試者中。
[0072]疫苗#3:通過遞送將用凋亡的GBM6-AD細胞(通過輻射和熱休克誘導，所以細胞還活著但正在死亡，并且所有都注定死亡)脈沖的樹突狀細胞與適當的佐劑施用至受試者中。
[0073]疫苗#4:通過遞送將GBM6-AD細胞裂解物(通過凍融或霧化誘導)脈沖的樹突狀細胞與適當的佐劑施用至受試者中。
[0074]疫苗#5:施用與GBM6-AD融合的樹突狀細胞與適當的佐劑(細胞融合疫苗)。
[0075]疫苗#6:施用與GBM6-AD融合的B細胞與適當的佐劑(細胞融合疫苗)。
[0076]疫苗#7:施用與源自GBM6-AD的表面的酸洗脫的肽與適當的佐劑。
[0077]疫苗#8: —種或多種上述的任何組合。
[0078]在某些實施方案中，使用如上的劑量和佐劑皮內或皮下或淋巴結內注射疫苗持續多個周期。
[0079]在某些實施方案中，借助過繼性細胞治療治療患者。在某些實施方案中，患者施用由GBM6-AD裂解物脈沖的樹突狀細胞引發的T細胞。
[0080]在某些實施方案中，通過施用對GBM6-AD抗原特異性的抗體而治療患者。
[0081]GBM6-AD杭體和GBM6-AD反應件T細朐和制各杭GBM6-AD杭體和GBM6-AD反應件T細胞的方法
在某些實施方案中，通過用自體GBM6-AD脈沖的樹突狀細胞引發和使用標準的組織培養方法在培養物中產生GBM6-AD反應性T細胞，并且施用于患者。總之，在某些實施方案中，GBM6-AD直接用作疫苗，或間接地用于產生抗體或T細胞，其隨后用作直接治療。
[0082]在某些實施方案中，克隆產生針對GBM6-AD的單克隆抗體的雜交瘤。如本文所使用的，術語“單克隆抗體”是指從一組基本均勻的抗體(換言之，其中除了以少量存在的天然存在的突變體以外構成該組的抗體是均勻的抗體組)獲得的抗體。單克隆抗體是高度特異性的，并且與單一抗原位點相互作用。此外，與通常含有針對不同抗原決定簇的各種抗體的常見多克隆抗體制劑相比，每種單克隆抗體靶向抗原上的單一抗原決定簇(表位)。除其特異性以外，單克隆抗體是有利的，因為它們是從不被其他免疫球蛋白污染的雜交瘤培養物產生的。
[0083]形容詞“單克隆”表明從基本上均勻的抗體組獲得的抗體的特征，并且沒有指定通過特定方法產生的抗體。例如，用于本發明中的單克隆抗體可以通過，例如雜交瘤方法(Kohler和Milstein，Nature 256:495，1975)或重組方法(U.S.Pat.N0.4，816，567)產生。用于本發明中的單克隆抗體也可以從卩遼菌體抗體文庫分離(Clackson等人，Nature352:624-628，1991; Marks 等人，J.Mol.Biol.222:581-597，1991 )。本發明的單克隆抗體尤其包含“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，其中，重(H)鏈和/或輕(L)鏈的部分衍生自特定物種或特定的抗體的類或子類，并且鏈的剩余部分衍生自另一物種或另一種抗體類或子類。此外，突變抗體和其抗體片段也包括在本發明中(U.S.Pat.N0.4,816, 567;Morrison 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 81:6851-6855，1984)。
[0084]如本文所使用的，術語“突變抗體”是指包含變體氨基酸序列的抗體，其中一個或多個氨基酸殘基已經改變。例如，抗體的可變區可以進行修飾以改進其生物特性如抗原結合。這樣的修飾可以通過下列實現:定點誘變(參見Kunkel, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 82:488 (1985))，基于PCR的誘變，盒誘變，等。這樣的突變體包含與抗體的重或輕鏈可變區的氨基酸序列至少70%相同，更優選至少75%，甚至更優選至少80%，還更優選至少85%，又更優選至少90%，和最優選至少95%相同的氨基酸序列。如本文所使用的，術語“序列同一性”被定義為在比對序列并且適當地引入缺口而使序列同一性必要地最大化之后確定的與抗體的初始氨基酸序列的殘基相同的殘基的百分比。
[0085]具體而言，一個核苷酸序列或氨基酸序列與另一個的同一丨丨生可以使用Karlin和Altschul 的算法 BLAST (Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 90:5873-5877，1993)來確定。基于該算法開發了程序如 BLASTN 和 BLASTX(Altschul 等人，J.Mol.Biol.215:403-410，1990)。為了根據基于BLAST的BLASTN分析核苷酸序列，參數設定為，例如，評分=100，和字長=12。另一方面，用于通過基于BLAST的BLASTX分析氨基酸序列的參數包括，例如，評分=50，和字長=3。當使用BLAST和Gapped BLAST程序時使用每個程序的默認參數。這種分析的特定技術是本領域已知的(參見國家生物技術信息中心(NCBI)的網站，BasicLocal Alignment Search Tool (BLAST) ; http://www.ncb1.nlm.nih.gov)。
[0086]可以通過本領域技術人員已知的方法制備多克隆和單克隆抗體。例如，可以通過下述方法制備抗體。
[0087]用于免疫動物的GBM6-AD包括裂解和輻射的GBM6-AD細胞。作為用于免疫的抗原，可以在沒有修飾的情況下，或者與載體分子綴合之后使用GBM6-AD細胞。當使用載體分子時，例如，將GBM6-AD細胞首先與載體分子偶聯，然后向其中添加佐劑。這樣的佐劑包括明礬、弗氏完全和不完全佐劑等，其中任何一個都可以組合在一起。
[0088]將如上所述制備的抗原給予哺乳動物，如小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、馬、猴、兔、山羊、和綿羊。可以通過任何現有方法包括通常使用的靜脈內注射、皮下注射和腹膜內注射進行這種免疫。關于免疫間隔不存在任何限制。可以以數天至數周、優選4至21天的間隔進行免疫。可以，例如，以10至100 Ug (例如，20至40 Ug)抗原蛋白的單一劑量免疫小鼠，但劑量不限于這些值。
[0089]在第一次免疫前，和第二次和隨后的免疫后三至七天，從動物收集血液，并且分析血清的抗體滴度。為了促進免疫應答，優選使用聚集劑如明礬。通常，選擇的哺乳動物抗體具有足夠高的抗原結合親和力。可以使用飽和結合測定法、酶聯免疫吸附測定法(ELISA)，或競爭性測定法(例如，放射免疫測定法)確定抗體親和力。
[0090]可以通過常規的交聯分析篩選多克隆抗體，如描述于下列中的方法:"Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories, Harlow andDavid Lane edit.(1988)).〃。另一種方法是，例如，表位作圖(Champe 等人，J.Biol.Chem.270:1388-1394 (1995))。用于確定多肽或抗體滴度的優選方法包括定量抗體結合親和力。在其他實施方案中，除了或代替用于確定抗體結合親和力的方法，還使用用于評價抗體的一種或多種生物特性的方法。這樣的分析方法是特別有用的，因為它們表明了抗體的治療效力。當抗體在這樣的分析中顯示出改進的特性時，其結合親和力通常是，但不總是，增強的。
[0091]可以通過Milstein等人的方法獲得用于制備單克隆抗體的雜交瘤(Kohler, G.，和Milstein，C.，Methods Enzymo 1.1981，73，3-46)。待與產生抗體的細胞融合的骨髓瘤細胞可以是源自本領域技術人員通常可獲得的任何各種動物的細胞系，所述動物如小鼠、大鼠、和人。待使用的細胞系是耐藥性的，并且在非融合狀態在選擇性培養基(例如HAT培養基中)中不能存活，但在融合狀態下可以存活。通常使用8-氮鳥嘌呤抗性細胞系，其缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶，并且不可以在次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培養基中生長。骨髓瘤細胞包括多種已知的細胞系，例如，P3x63Ag8.653(J.1mmunol.(1979) 123: 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology andImmunology (1978) 81: 1-7), NS-1 (Kohler, G.和 Milstein, C., Eur.J.1mmunol.(1976) 6: 511-519)，MPC-1l (Margulies, D.H.等人，Cell (1976) 8: 405-415)，SP2/0 (Shulman, M.等人，Nature (1978) 276: 269-270)，FO (de St.Groth, S.F?等人，J.Tmmuno1.Methods (1980) 35: 1-21), S194 (Trowbridge, 1.S., J.Exp.Med.(1978) 148: 313-323)，R210 (Galfre, G.等人，Nature (1979) 277: 131-133)，和P3U1 (J.Exp.Med.1979, 150:580; Curr Top Microbiol.1mmunol.1978, 81:1)。人骨髓瘤和小鼠-人雜骨髓瘤細胞系也可以用于產生人單克隆抗體(Kozbar, J.1mmunol.133:3001 (1984) ; Brodeur 等人，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplication,第 51-63 頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。例如，從最后免疫后兩至三天處死的動物，收集產生抗體的細胞。產生抗體的細胞包括脾細胞、淋巴結細胞和外周血細胞。通常使用脾細胞。具體而言，從上述各種動物切割或收集組織如脾臟或淋巴結。然后，將組織被壓碎，并且將獲得的材料懸浮在培養基或緩沖液如PBS、DMEM或RPMI1640中，隨后用不銹網等過濾。然后將其離心以獲得目的產生抗體的細胞。
[0092]然后將上述骨髓瘤細胞和產生抗體的細胞融合。通過在融合促進劑存在的情況下在30至37°C在用于動物細胞培養的培養基如MEM、DMEM和RPM1-1640中以1:1至1:20的比例將骨髓瘤細胞與產生抗體的細胞接觸I至15分鐘而實現細胞融合。為了促進細胞融合，可以使用商業上可獲得的細胞融合裝置，使用融合促進劑如聚乙二醇(平均分子量1，000至6，000 (Da))或聚乙烯醇或用于融合的病毒如仙臺病毒融合產生抗體的細胞和骨髓瘤細胞。
[0093]在細胞融合后從細胞選擇目的雜交瘤。選擇方法包括使用在選擇性培養基中選擇性擴增細胞的方法。具體而言，用適當的培養基稀釋細胞懸浮液，并且然后將細胞鋪板到微量滴定板中。將選擇培養基(例如，HAT培養基)的等分試樣加入到各孔中，并且然后培養細胞，同時適當地交換選擇培養`基。作為結果生長的細胞可以作為雜交瘤保存。
[0094]在另一個實施方案中，可以從通過使用McCafferty等人報道的技術產生的抗體曬菌體文庫分離抗體或抗體片段(Nature 348:552-554 (1990))。Clackson等人(Nature352:624-628 (1991))和 Marks 等人(J.Mol.Biol.222:581-597 (1991))報道了從噬菌體文庫各自分離小鼠和人抗體。也有報道描述了基于鏈改組(Marks等人，Bio/Technology 10:779-783 (1992))和組合感染和體內重組(這是用于構建大規模噬菌體文庫的方法(Waterhouse 等人，Nucleic Acids Res.21:2265-2266 (1993)))產生高親和力(nM范圍)人抗體。這些技術也可以用于分離單克隆抗體，而不是使用用于產生單克隆抗體的常規雜交瘤技術。
[0095]本發明的抗體是提供成膠質細胞瘤的治療的抗體。
[0096]從獲得的雜交瘤制備單克隆抗體的方法包括標準的細胞培養方法和包括產生腹水的方法。在細胞培養方法中，在標準培養條件(例如，在37°C在5% CO2空氣)下，在用于動物細胞的培養基如含有10至20%胎牛血清的RPM1-1640或MEM或無血清培養基中培養雜交瘤2至14天，并且然后從培養上清液中制備抗體。在包括產生腹水的方法中，將雜交瘤施用于與衍生骨髓瘤細胞并且雜交瘤在其中大量增殖的物種相同的物種的哺乳動物個體的腹腔。然后一至四周后收集腹水或血清。為了增強腹水產生，例如，可以將姥鮫烷(2,6, 10，14 -四甲基十五烷)可以預先施用于腹腔。
[0097]可以通過適當選自已知方法的方法純化待用于本發明中的抗體，所述方法如蛋白A-瓊脂糖法、羥基磷灰石層析法、用硫酸鹽鹽析法、離子交換層析、和親和層析、或通過其組合使用。
[0098]本發明可以使用通過基因工程改造產生的重組抗體。從雜交瘤中分離編碼通過上述方法獲得的抗體的基因。將基因插入適當的載體中，然后引入到宿主(參見，例如，Carl, A.K.Borrebaeck, James, W.Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies,由 Macmillan Publishers Ltd 出版于 United Kingdom, 1990)。本發明提供了編碼本發明的抗體的核酸，和包含這些核酸的載體。具體而言，使用逆轉錄酶，從雜交瘤的mRNA合成編碼抗體的可變區(V區)的cDNA。獲得編碼目的抗體的可變區的DNA后，將它們與編碼期望的抗體的恒定區(C區)的DNA連接，并且將獲得的DNA構建體插入表達載體中。可替代地,可以將編碼抗體的可變區的DNA插入包含抗體C區的DNA的表達載體中。將這些插入表達載體中，使得基因在表達調控區例如增強子和啟動子的調控下表達。然后，用表達載體轉化宿主細胞以表達抗體。本發明提供了表達本發明的抗體的細胞。表達本發明的抗體的細胞包括用這樣的抗體的基因轉化的細胞和雜交瘤。
[0099]在本發明中，可以使用人工修飾以降低針對人的異源抗原性的重組抗體。實例包括嵌合抗體和人源化抗體。可以使用已知的方法產生這些修飾抗體。嵌合抗體包括包含彼此不同的物種的可變和恒定區的抗體，例如，包含非人哺乳動物如小鼠的抗體重鏈和輕鏈可變區和人的抗體重鏈和輕鏈恒定區的抗體。可以通過以下獲得這樣的抗體:(I)將編碼小鼠抗體的可變區的DNA與編碼人抗體的恒定區的DNA連接；(2)將其并入表達載體中；和
(3)將載體并入宿主中用于產生抗體。
[0100]通過用人抗體的CDR取代非人哺乳動`物如小鼠的抗體的H或L鏈互補性決定區(CDR)而獲得也被稱為重構人抗體的人源化抗體。用于制備這樣的抗體的常規基因重組技術是已知的(參見，例如 Jones 等人，Nature 321: 522-525 (1986) ; Reichmann 等人，Nature 332: 323-329 (1988) ; Presta Curr.0p.Struct.Biol.2: 593-596 (1992))。具體而言，使用構建以便在其末端包含重疊部分的數種寡核苷酸，通過PCR合成設計用于將小鼠抗體的CDR與人抗體的構架區(FR)連接的DNA序列。可以通過以下獲得人源化抗體:(I)將獲得的DNA與編碼人抗體恒定區的DNA連接；(2)將其并入表達載體中；和(3)將載體轉染進宿主中以產生抗體(參見，歐洲專利申請號EP 239，400，和國際專利申請號WO96/02576)。當CDR形成有利的抗原結合位點時，選擇經由CDR連接的人抗體FR。人源化抗體可以包含一個或多個額外的氨基酸殘基，所述額外的氨基酸殘基既不包括在引入受體抗體的CDR中，也不包括在構架序列中。通常引入這樣的氨基酸殘基，以便更準確地優化抗體識別和結合抗原的能力。例如，根據需要，可以取代抗體可變區的構架區中的氨基酸，使得重構人抗體的⑶R形成適當的抗原結合位點(Sato, K.等人，Cancer Res.(1993) 53，851-856)。
[0101]用于獲得人抗體的方法也是已知的。例如，可以通過以下獲得具有抗原結合活性的期望的人抗體:(I)用目的抗原或表達目的抗原的細胞在體外敏化人淋巴細胞；和(2)將敏化的淋巴細胞與人骨髓瘤細胞如U266融合(見審查公開的日本專利申請號(JP-B)Hei 1-59878)。可替代地，也可以使用抗原來免疫包含人抗體基因的部分或完整所有組成成分的轉基因(Tg)動物而獲得期望的人抗體(參見Nature Genetics 7:13-21 (1994);Nature Genetics 15:146-156 (1997) ; Nature 368:856-859 (1994);國際專利申請 WO93/12227， WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096,和 WO 96/33735)。具體而言，如下生成這樣的Tg動物:通過生成敲除動物或Tg動物,或交配這種動物而獲得非人哺乳動物，其中內源免疫球蛋白的重和輕鏈的基因座已經破壞，并且相反，已經經由酵母人工染色體(YAC)載體等引入人免疫球蛋白重和輕鏈基因座。免疫球蛋白重鏈基因座可以在功能上失活，例如，通過在J區或C區(例如，Cu區)的特定位點引入缺陷。免疫球蛋白輕鏈(例如，K鏈)可以在功能上失活，例如，通過在J區或C區或包含J和C區的區域中的特定位點引入缺陷。
[0102]也可以通過使用基因工程改造技術來用編碼抗體的重和輕鏈中每一條的cDNA、或優選包含這些cDNA的載體轉化真核細胞，和然后培養產生重組人單克隆抗體的該轉化細胞而從培養物上清液中獲得這種人源化抗體。宿主是，例如，期望的真核細胞，優選哺乳動物細胞，如CHO細胞，淋巴細胞和骨髓瘤。
[0103]此外，通過用人抗體文庫淘選獲得人抗體的技術是已知的。例如，使用噬菌體展示方法，人抗體可變區表達為噬菌體表面上的單鏈抗體(scFv)，并且可以選擇與抗原結合的噬菌體。通過分析選擇的噬菌體的基因，可以確定編碼與抗原結合的人抗體可變區的DNA序列。如果鑒定了與抗原結合的scFv的DNA序列，那么可以構建包含這些序列的適當的表達載體，并且然后引入適當的宿主中并且表達以獲得人抗體。這樣的方法是已經眾所周知的(參見 WO 92/01047，WO 92/20791，WO 93/06213，WO 93/11236，WO 93/19172，WO95/01438，和 WO 95/15388)。
[0104]當抗體基因已經分離并且導入適當的宿主中時，可以適當地組合使用宿主和表達載體以產生抗體。作為真核宿主細胞，可以使用動物細胞、植物細胞、和真菌細胞。動物細胞包括:(I)哺乳動物細胞如CHO、COS、骨髓瘤、幼倉鼠腎(BHK)、HeLa、和Vero細胞；(2)兩棲類細胞如爪蟾卵母細胞；或(3)昆蟲細胞如sf9、sf21、和Tn5、或桑蠶。已知植物細胞包括來源于煙草屬如煙草 iNicotiana tabacum)的細胞,可以對其愈傷組織培養。已知真菌細胞包括酵母如酵母菌屬{Saccharomyces genus)、例如釀酒酵母{Saccharomycescererisiae)、和絲狀菌如曲霉菌屬、例如黑曲霉(Aspergillus niger) 0原核細胞，還可以用在利用細菌細胞的生產系統中。已知細菌細胞包括大腸桿菌和枯草桿菌。可以通過使用轉化將目的抗體基因轉移至這些細胞中并且然后在體外培養轉化的細胞而獲得抗體。
[0105]本發明的抗體的同種型沒有限制。同種型包括，例如，IgG (IgGl、IgG2、IgG3、和IgG4)、IgM、IgA (IgAl和IgA2)、IgD、和IgE0本發明的抗體也可以是包含負責抗原結合的部分的抗體片段或其修飾片段。術語“抗體片段”是指全長抗體的部分，并且通常是指包含抗原結合結構域或可變區的片段。這種抗體片段包括，例如，Fab、F(ab’)2、Fv、包含用適當的接頭偶聯在一起的重鏈Fv和輕鏈Fv的單鏈Fv (scFv)、雙抗體(多種雙抗體)、線性抗體、和從抗體片段制備的多特異性抗體。以前，通過用蛋白酶消化天然抗體產生抗體片段；目前，用于使用基因工程改造技術將它們表達作為重組抗體的方法也是已知的(參見 Morimoto 等人，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992) ; Brennan 等人，Science 229:81 (1985) ; Co, M.S.等人，J.1mmunol.,1994, 152, 2968-2976; Better, M.& Horwitz, A.H., Methods in Enzymology, 1989,178, 476-496, Academic Press, Inc.; Plueckthun, A.& Skerra, A., Methods inEnzymology, 1989, 178, 476-496，Academic Press, Inc.; Lamoyi, E., Methods inEnzymology, 1989，121，663-669; Bird, R.E.等人，TIBTECH, 1991，9，132-137)。
[0106]“Fv”片段是最小的抗體片段，并且含有完整的抗原識別位點和結合位點。該區域是二聚體(Vh-'二聚物)，其中通過非共價鍵強烈連接重鏈和輕鏈中每一條的可變區。每個可變區的3個CDR彼此相互作用以便在Vh-' 二聚體的表面上形成抗原結合位點。換言之，來自重和輕鏈的總共6個CDR—起作為抗體的抗原結合位點發揮作用。然而，已知單獨的可變區(或半Fv，其僅含有三個抗原特異性CDRS)能夠識別和結合抗原，雖然其親和力低于整個結合位點的親和力。因此，本發明的優選的抗體片段是Fv片段，但不限于此。這種抗體片段可以是包含保守的且可以識別和結合抗原的重鏈或輕鏈CDR的抗體片段的多肽。
[0107]Fab片段(也稱為F(ab))還含有輕鏈恒定區和重鏈恒定區(CHl)。例如，抗體的木瓜蛋白酶消化產生兩種片段:抗原結合片段，被稱為Fab片段，其含有重鏈和輕鏈的可變區，其充當單一抗原結合域；和剩余部分，其被稱為“Fe”，因為它很容易結晶。Fab’片段與Fab片段的不同在于Fab’片段也具有源自重鏈CHl區的羧基末端的數個殘基，其含有來自抗體的鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸殘基。然而，Fab’片段在結構上等同于Fab，因為兩者都是包含重鏈和輕鏈的可變區的抗原結合片段，其充當單一抗原結合區。在本文中，包含重鏈和輕鏈的可變區(其充當單一抗原結合區且等同于通過木瓜蛋白酶消化獲得的那種)的抗原結合片段被稱為“Fab樣抗體”，甚至當它不同于通過蛋白酶消化產生的抗體片段時。Fab’-SH是在其恒定區具有游離的硫醇基團的一個或多個半胱氨酸殘基的Fab’。通過裂解在F(ab’)2的鉸鏈區的半胱氨酸殘基之間的二硫鍵而產生F(ab’)片段。其他化學交聯的抗體片段對于本領域技術人員也是已知的。抗體的胃蛋白酶消化產生兩個片段；一個是F (ab’)2片段，其包含兩個抗原結合結構域且可以與抗原交叉反應，而另一個是剩余片段(被稱為pFc’)。在本文中，當其包含兩個抗原結合結構域且可以與抗原交叉反應時，等同于通過胃蛋白酶消化獲得的那種的抗體片段被稱為“F(ab’)2-樣抗體”。也可以，例如，通過基因工程改造產生這種抗體片段。也可以,例如,從上述抗體噬菌體文庫分離這種抗體片段。可替代地，可以從宿主如大腸桿菌直接回收F(ab’)2_SH片段，并且然后通過化學交聯允許形成 F(ab’)2 片段(Carter 等人，Bio/Technology 10:163-167 (1992))。在可替代的方法中，可以從重組宿主的培養物直接分離F(ab’)2片段。
[0108]術語“雙抗體(Db)”是指通過基因融合構建的二價抗體片段(例如，P.Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90: 6444-6448 (1993)，EP 404，097，WO 93/11161)。通常，雙抗體是兩條多肽鏈的二聚體。在每一條多肽鏈中，在相同鏈中的輕鏈可變區域(\)和重鏈可變區域(Vh)經由短接頭、例如約5個殘基的接頭連接，使得它們不可以結合在一起。因為兩者之間的接頭太短，在相同多肽鏈中的\和Vh不能形成單鏈V區片段，但反而形成二聚體。因此，雙抗體具有兩個抗原結合結構域。當組合針對兩種類型的抗原(a和b)的\和Vh區以便經由約5個殘基的接頭形成Vh-Vsb和VurVlla且然后共表達時，它們作為雙特異性Db分泌。本發明的抗體可以是這種Db。
[0109]可以通過連接抗體的重鏈V區和輕鏈V區而制備單鏈抗體(也稱為“scFv”)(對于 scFv 的綜述,參見 Pluckthun "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies"第 113卷，編輯 Rosenburg 和 Moore, Springer Verlag, N.Y.,第 269-315 頁(1994))。用于制備單鏈抗體的方法是本領域已知的(參見，例如，U.S.Pat.Nos.4, 946,778; 5, 260, 203;5，091，513;和5，455，030)。在所述scFv中，重鏈V區和輕鏈V區經由接頭(優選多肽接頭)共同連接(Huston, J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A, 1988，85，5879-5883)。scFv中重鏈V區和輕鏈V區可以來源于相同抗體或不同抗體。用于連接V區的肽接頭可以是任何單鏈肽，所述單鏈肽由12至19個殘基組成。使用作為模板的整個DNA或編碼期望氨基酸序列的部分DNA(其選自編碼上述抗體的重鏈或重鏈的V區的DNA和編碼上述抗體的輕鏈或輕鏈的V區的DNA);和使用定義兩個末端的引物對通過PCR擴增編碼scFv的DNA。隨后可以使用編碼肽接頭部分的DNA和定義用于與重和輕鏈分別連接的DNA的兩個末端的引物對進行進一步擴增。構建編碼scFv的DNA后，可以使用常規方法來獲得包含這些DNA的表達載體，和通過這些表達載體轉化的宿主。此外，可以根據常規方法使用獲得的宿主獲得scFv。可以通過獲得編碼抗體片段的基因且如上文所述表達這些而在宿主中產生這些抗體片段。可以使用與不同類型的分子如聚乙二醇(PEG)結合的抗體作為修飾的抗體。用于修飾抗體的方法是本領域中已經建立的。本發明中的術語“抗體”還包括上述抗體。
[0110]可以將獲得的抗體純化至均一。可以通過常規用來分離和純化蛋白的方法分離和純化抗體。可通過組合使用適當選自以下的一種或多種方法來分離和純化抗體:例如，柱層析法、過濾、超濾、鹽析、透析、制備聚丙烯酰胺凝膠電泳和等點聚焦(Strategies forProtein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, DanielR.Marshak 等人編，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996) ; Antibodies: ALaboratory Manual.Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。此方法不限于以上列出的那些。層析法包括親和層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過濾、反相層析和吸附層析。這些層析法可以利用液相層析(如HPLC和FPLC)來實施。親和層析中所用柱包括 蛋白A柱和蛋白D柱。例如，蛋白A柱包括Hyper D、P0R0S、和Sepharose F.F.(Pharmacia)。抗體可以通過利用抗原結合,使用其上已經固定抗原的載體進行純化。
[0111]可以根據標準方法配制本發明的抗體(參見,例如,Remington’s PharmaceuticalScience,最新版，Mark Publishing Company, Easton, U.S.A),并且可以包含藥學上可接受的載體和/或添加劑.本發明涉及組合物(包括試劑和藥物)，其包含本發明的抗體、和藥學上可接受的載體和/或添加劑。示例性載體包括表面活性劑(例如，PEG和Tween)、賦形劑、抗氧化劑(例如，抗壞血酸)、著色劑、調味劑、防腐劑、穩定劑、緩沖劑(例如，磷酸、檸檬酸和其他有機酸)、螯合劑(例如，EDTA)、懸浮劑、等滲劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、流動性促進劑、和矯味劑。然而，可以用于本發明中的載體不限于此列表中。實際上，可以適當地采用其他常用載體:輕質無水硅酸、乳糖、結晶纖維素、甘露糖醇、淀粉、羧甲纖維素鈣、羧甲纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯乙縮醛二乙氨基乙酯、聚乙烯基吡咯烷酮、明膠、中鏈脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纖維素、玉米淀粉、無機鹽等。組合物還可以包含其他低分子量多肽，蛋白如血清白蛋白、明膠、和免疫球蛋白，和氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和賴氨酸。當組合物作為注射用水溶液制備時，它可以包含等滲溶液，包含例如生理鹽水、葡萄糖和其他佐劑(包括，例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化鈉)，所述溶液還包括合適的助溶劑,例如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇和PEG)、以及非離子性去污劑(聚山梨醇80和HC0-50)。
[0112]如果必要，本發明的抗體可以封裝在微膠囊中(羥甲基纖維素、明膠、聚甲基丙烯酸甲酯等制成的微膠囊)，和制成膠體藥物遞送系統的組分(脂質體、白蛋白微球、微乳劑、納米粒和納米膠囊)(例如，參見"Remington’s Pharmaceutical Science 16thedition", Oslo Ed.(1980))。而且已知制備緩釋藥物的方法，且可以用本發明的抗體應用這些(Langer 等人，J.Biomed.Mater.Res.15: 167-277 (1981) ; Langer, Chem.Tech.12: 98-105 (1982) ; U.S.Pat.N0.3，773，919;歐洲專利申請號 58，481; Sidman等人，Biopolymers 22: 547-556 (1983) ; EP: 133,988)。
[0113]上述本發明的抗體可以用于治療患有成膠質細胞瘤的個體。
[0114]下列實施例用來說明但非限制本發明。
[0115]實施例1
本發明人已經開發了新的療法，其利用用咪喹莫特和腦腫瘤起始細胞(BTIC)疫苗的免疫治療用于治療彌漫性內在腦橋膠質瘤(DIPG)，這是一種致命的腦腫瘤，主要發生在童年和年輕成年期間。大多數DIPG的組織學是多形性成膠質細胞瘤(GBM)，WHO IV 級(Tsuchida T, Shimbo Y，Fukuda M,等人.Computed tomographic andhistopathological studies of pontine glioma.Childf s Nerv Syst.1985;1:223-229)。過去的經驗已經顯示，DIPG對輻射治療響應，但只是短暫的。大多數兒童受這種腫瘤折磨，在診斷兩年內死亡。迄今為止用輔助化療和/或同時輻射敏化劑顯著改善效果的嘗試都失敗了(Frazier JL, Lee J, Ulrich WT,等人? Treatment of diffusebrainstem gliomas:failed approaches and future strategies.y NeurosurgZfetZiatric1S.2009; 3:259-269)。基于來自美國中央腦腫瘤登記處(The Central BrainTumor Registry of the United State, CBTRUS)的統計，在0至19歲年齡組中腦干腫瘤的每年發病率在未來幾年內預計超過450例。在這些中，超過360例將是具有惡性DIPG的兒童和年輕成人(美國中央腦腫瘤登記處。2009年7月16日從報告和表格網站獲得:http://cbtrus.0rg/reports/2009-NPCR-04-05/CBTRUS-NPCR2004-2005-Report-.pdf.2009)。預計這些年輕人中很少存活。這種治療導致在受這種疾病折磨的年輕人中的存活增加。
[0116]樹突狀細胞(DC)在抗原遞呈和引起適應性免疫應答中發揮了關鍵作用的發現打開了操作它們治療GBM的可能性。Liau等人在2000年公開了首次使用腫瘤肽脈沖的DC接種用于神經膠質瘤患者；該研究記載了盡管疾病進展的腫瘤反應性T細胞(Liau LM,等人? Treatment of a patient by vaccination with autologous dendritic cellspulsed with allogeneic major histocompatibility complex class 1-matched tumorpeptides.Case Report.Neurosurg Focus.2000; 9: e8) ? 從那時起，用腫瘤裂解物脈沖的自體DC對GBM患者接種能夠引發抗原特異性CD8+ T細胞并且與接受標準治療的歷史對照患者中30周相比使中值存活增加至133周(Yu JS,等人? Vaccination with tumorlysate-pulsed dendritic cells elicits antigen-specific, cytotoxic T—cells inpatients with malignant glioma.Cancer Tfeseard 2004; 64:4973-4979)。Yamanaka等人報道了在I/II期臨床試驗中在真皮下注射腫瘤裂解物脈沖的DC或同時瘤內和真皮下接種后類似的結果。四位患者顯示臨床響應，10位顯示腫瘤穩定，并且10位具有腫瘤進展(Yamanaka R，等人.Clinical evaluation of dendritic cell vaccination forpatients with recurrent glioma: results of a clinical phase I/II trial.ClinCancer Res.2005; 11:4160-4167) 0在最近的II期研究中，CTL響應于DC接種而精細產生IFN- Y的能力與臨床響應和總體存活顯著相關(Wheeler CJj等人? Vaccination elicitscorrelated immune and clinical responses in glioblastoma multiforme patients.Cancer Research.2008;68:5955-5964)。盡管存在這些有希望的結果，但是大多數患者最終屈服于他們的疾病。如果特異性設計針對耐輻射的腦腫瘤起始細胞，那么免疫治療將更加成功。
[0117]腦腫瘤起始細胞:標記和對免疫治療的意義
過去15年的研究表明，細胞的異質性群體構成腫瘤，并且它們中只有亞組能夠自我更新、起始腫瘤和部分分化(Beachy PA，Karhadkar SSj Berman DM.Tissue repair andstem cell renewal in carcinogenesis.Nature.2004;432:324-331 中綜述)。腫瘤起始細胞在1990年代牢固確立存在于急性骨髓性白血病中(Lapidot T，等人.Acellinitiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice.Nature.1994:367:645-648; Bonnet D，Dick JE.Human acute myeloid leukemiais organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoieticcell.Nature Medicine.1997;3:730-737)，并且最近在原發性腦腫瘤如成膠質細胞瘤和成神經管細胞瘤中(Ignatova TNj 等人.Human cortical glial tumors containneural stem-like cells expressing astroglial and neuronal markers in vitr0.Glia.2002;39:193-206; Singh SKj 等人?Identification of human brain tumourinitiating cells.Nature.2004;432:396-401; Singh SKj.1dentification of
a cancer stem cell in human brain tumors.Cancer Research.2003;63:5821-5828;Galli R,等人.1solation and characterization of tumorigenic，stem-like neuralprecursors from human glioblastoma.Cancer Research.2004;64:7011-7021; LiMCj 等人.1solation and c`haracterization of brain tumor stem cells in humanmedulloblastoma.Ai Zheng.2006; 25:241-246)是在造血和神經干細胞中表達的 120-kDa跨膜糖蛋白，其已經用作腦腫瘤起始細胞(BTIC)的標記。Singh等人表明，少至100個CD133+神經膠質瘤細胞能夠在免疫缺陷小鼠中形成腫瘤，而從移植的相同大腫瘤塊分離的100，000個⑶133—腫瘤細胞但沒有形成腫瘤。(Singh SKj等人.1dentificationof human brain tumour initiating cells.Nature.2004;432:396-401) 0 此外，在復發患者中腫瘤塊中⑶133+細胞的百分比增加，并且⑶133表達現在已經用于預測低級別神經膠質瘤中的疾病進展(Zeppernick F，等人.Stem Cell Marker CD133 AffectsClinical Outcome in Glioma Patients.Clin Cancer Res.2008;14:123-129)。然而，⑶133不是僅有的BTIC的標記，因為來自神經膠質瘤的亞組的⑶133—細胞是腫瘤起始的(Beier Dj 等人.CD133+ and CD133- Glioblastoma-Derived Cancer Stem Cells ShowDifferential Growth Characteristics and Molecular Profiles.Cancer Research.2007;67:4010-4015)。Lee等人已經鑒定了符合BTIC的重要標準的從人GBM分離的巢蛋白+Sox_2+細胞(以低細胞數的腫瘤起始)(Lee Jj等人.Tumor stem cells derivedfrom glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotypeand genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.Cancer Cell.2006;9:391-403)。這些⑶15+ BTIC在移植進小鼠腦部后形成非常侵襲性的腫瘤，并且它們的基因表達信號與原發性腫瘤中的基因表達信號非常相似(Lee J,等人.Tumor stemcells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirrorthe phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.Cancer Cell.2006;9:391-403)。盡管CD133和Sox_2是有用的標記，但是它們不能總是自身預測腫瘤起始。然而，表達CD133的細胞似乎特別優先在輻射和化療后存活，這使得通過免疫治療來靶向它們非常重要。從本研究中出現的關鍵概念是，腦腫瘤由具有有限的腫瘤生成潛能的大塊腫瘤細胞和BTIC構成的。BTIC可能只占總的腫瘤細胞的部分，但是可能是無情的腫瘤更新和疾病進展的來源。
[0118]使用輻射作為疫苗敏化劑的基本原理。Bao等人已經顯示，⑶133+細胞通過優先激活檢查點激酶Chkl、Chk2而表現出相對于它們的CD133_子細胞對電離輻射增加的耐受性(Bao S，等人.Glioma stem cells promote radioresistance by preferentialactivation of the DNA damage response.Nature.2006;444:756-760)。盡管 CD133+和⑶133—細胞表現出類似的DNA損傷，但是相對于⑶133—細胞，⑶133+細胞在每個劑量的福射后修復損傷更迅速并且更富集(Bao S，等人.Glioma stem cells promoteradioresistance by preferential activation of the DNA damage response.Nature.2006; 444:756-760)。在精細的研究中，Gasser等人表明，DNA損傷通路調節NKG2D受體的固有免疫系統配體(Gasser S，Orsulicj S.，Brown, E.J.& Raulet, D.H.The DNA damagepathway regulates innate immune system ligands of the NKG2D receptor.Nature.2005:436:1186-1190)。他們確定，輻射誘導的NKG2D配體表達的分子基礎是誘導Chkl/2激活。此外，Chkl抑制的NKG2D配體增量調節的藥理學抑制清楚地揭示，輻射通過檢查點激酶途徑增加細胞的免疫原性。然而，使用正常細胞和肉瘤細胞進行這些研究(Gasser S，Orsulic, S., Brown, E.J.& Raulet, D.H.The DNA damage pathway regulates innateimmune system ligands of the NKG2D receptor.Nature.2005;436:1186-1190)。然而，如果這些結果適用于神經膠質瘤細胞，那么預計⑶133+細胞用于在輻射治療后存活的相同通路(通過Chkl的信號傳遞)通過增量調節N`KG2D配體而優先使它們對自然殺傷或T細胞的細胞介導的裂解敏感。如果是真實的，這將代表CD133+細胞的“阿喀琉斯之踵”，其被定義為“盡管整體強大，但是具有致命弱點，實際或可能導致衰敗。”在某些實施方案中，本發明使用輻射與BTIC靶向的免疫治療的組合用于治療DIPG。
[0119]靶向BTIC抗原:神經膠質瘤細胞的培養條件對于免疫治療具有至關重要的意義。幾十年來，為了理解神經膠質瘤生物學和研究潛在治療進行的研究已經依賴于使用在血清中培養的神經膠質瘤細胞系。相應地，在最近的臨床試驗(其中GBM患者用腫瘤細胞裂解物或肽脈沖的DC接種)中,在血清中培養和擴增腫瘤細胞(Yu JS,等人.Vaccination withtumor lysate-pulsed dendritic cells elicits antigen-specific, cytotoxic T—cellsin patients with malignant glioma.Cancer Research.2004;64:4973-4979; YamanakaR,等人.Clinical evaluation of dendritic cell vaccination for patients withrecurrent glioma: results of a clinical phase I/II trial.Clin Cancer Res.2005; 11:4160-4167; Yamanaka R,等人.Vaccination of recurrent glioma patientswith tumour lysate-pulsed dendritic cells elicits immune responses: results ofa clinical phase I/II trial.Br J Cancer.2003;89:1172-1179)。兩個很好對照的研究最近已經表明，BTIC在血清中的培養引起分化，導致增強基因組不穩定性，加速遺傳突變,并且導致與原發性腫瘤急劇不同的總體基因表達模式和表型(Lee J,等人.Tumorstem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closelymirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured celllines.Cancer Cell.2006;9:391-403; Gunther HS，等人.Glioblastoma-derivedstem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular andphenotypic criteria.0ncogene.2007)。相比之下，在用EGF和FGF補充的神經干細胞培養基中培養原代腫瘤細胞防止分化。這些神經球培養物當異種移植進小鼠腦部時概括了原發性腫瘤的基因型、基因表達模式和表型(Lee Jj等人.Tumor stem cells derivedfrom glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotypeand genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.Cancer Cell.2006;9:391-403; Gunther HS，等人? Glioblastoma-derived stem cell-enrichedcultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypiccriteria.0ncogene, 2007)。應當考慮這些最近的發現，因為進行了開發更有效的免疫治療的嘗試。當用腫瘤裂解物脈沖DC并且作為疫苗施用時，裂解物中的蛋白抗原在DC內加工并且遞呈至MHC I和MHC II上以便引發對這樣的抗原應答的原初T細胞。因此，可能到現在為止，裂解物脈沖的DC疫苗已經被偏向于僅僅靶向在初始腫瘤上表達的抗原亞組，并且可能這些中的很少(如果有的話)是BTIC特異性抗原，因為抗原來源在血清中培養。一項研究現在已經提供了支持這種假說的證據。Pellegata等人已經顯示，與用血清培養的神經膠質瘤細胞裂解物脈沖的DC接種的小鼠相比，用神經球培養裂解物脈沖的DC接種的小鼠具有優異的治療應答(Pellegatta S，等人.Neurospheres enriched in cancer stem-likecells are highly effective in eliciting a dendritic cell-mediated immuneresponse against malignant gliomas.Cancer Research.2006;66:10247-10252)。換言之，DC疫苗試驗已經進行的方式可能產生信噪比的問題。在目前項目中,膠質瘤細胞培養物源自初始腫瘤，并且在 神經干細胞培養基中培養以富集重要BTIC抗原的臨床相關表型和表達。
[0120]咪喹莫特加上腫瘤細胞裂解物是有效的抗膠質瘤疫苗
咪喹莫特是FDA批準的免疫應答調節劑，其作為霜劑施用在皮膚上用于治療皮膚腫瘤。咪喹莫特在人中通過在DC和B細胞上表達的toll樣受體7 (TLR7)發揮其免疫刺激作用。咪喹莫特治療引起促炎性細胞因子包括干擾素a、干擾素y、IL-12(所有對于在動物中引發與抗腫瘤活性相關的強大的Thl免疫應答都是重要的)的釋放。局部咪喹莫特已經用作疫苗佐劑，在靶向確定的腫瘤和病毒感染的許多研究中取得了成功(Adams S，等人.1mmunization of malignant melanoma patients with full-length NY-ES0-1 proteinusing TLR7 agonist Imiquimod as vaccine adjuvant.J Immunol.2008;181:776-784;Johnston D， Bystryn JC.Topical Imiquimod is a potent adjuvant to aweakly-1mmunogenic protein prototype vaccine.Vaccine.2006;24:1958-1965;Craft N,等人.The TLR7 agonist Imiquimod enhances the ant1-me lanoma effects ofa recombinant Listeria monocytogenes vaccine.J Immunol.2005;175:1983-1990;Harrison CJj Miller RLj Bernstein D1.Reduction of recurrent HSV diseaseusing Imiquimod alone or combined with a glycoprotein vaccine.Vaccine.2001;19:1820-1826; Bernstein DIj Miller RLj Harrison CJ.Adjuvant effects ofImiquimod on a herpes simplex virus type 2 glycoprotein vaccine in guinea pigs.J Infect Dis.1993; 167:731-735)。基于這以前的工作，測試腫瘤細胞裂解物疫苗在小鼠模型中的效力。具有同源GL261膠質瘤的近交系C57BL/6小鼠通過用GL261細胞裂解物的真皮內接種進行處理，藉此在臨注射前將咪喹莫特施加至接種部位。施用鹽水作為對照。與對照相比，用咪喹莫特/腫瘤裂解物接種處理的小鼠明顯存活更長，包括20%的長期存活(圖 2 ；p<0.01)。
[0121]處理模式。本處理模式(圖3)基于上述數據，和關于輻射增加腫瘤細胞的免疫原性的已知信息。BTIC細胞系(GBM-6)被用作疫苗來源。經6至7周給予以180cGy部分的5220 cGy的劑量的共形福射治療用于誘導，以嘗試實現微小殘留病(minimal residualdisease)。在初始輻射治療結束后4周和8周，經連續兩天將額外360 cGy部分以180cGy部分遞送，作為誘導NKG2D配體增量調節的新的努力(從而使殘留腫瘤對結合的淋巴細胞“敏化”)。因此,對于每位患者的總輻射劑量為5940 CGy0患者分為兩組；對于佐劑抗腫瘤作用和輻射敏化，在輻射治療的前四周過程中將替莫唑胺75mg/m2/天給予第I組。據預計，替莫唑胺將引起淋巴細胞減少。為了使免疫恢復向DIPG中表達的腫瘤抗原(如IL-13Ra 2、Epha2、Her-2)特異性的T細胞偏斜，在該組患者中在隨后淋巴細胞恢復過程中遞送疫苗。最近的數據已經顯示，T調節性細胞可能是在替莫唑胺恢復過程中延遲的主要淋巴細胞亞群，因此，第2組用無佐劑的替莫唑胺處理。在初始輻射治療已經完成后，這些患者可能從其他機構轉診后呈現給我們。所有其他患者被隨機分到替莫唑胺或無替莫唑胺組。通過對在疫苗治療開始之前和之后收集的外周血單核細胞進行流式細胞術在兩組之間比較T reg數量和免疫應答。在輻射治療完成后第四周開始疫苗施用，且每兩周給予，共4個劑量。隨后每4周給予增強劑，且繼續至 從輻射治療開始一年的最大量，至此時，基于歷史數據，生存中值將已經通過。
[0122]注意上面的劑量指南，根據明尼蘇達大學兒童醫院的護理標準給予輻射治療。所有患者用強度調節的輻射治療(IMRT)或等同共形技術治療。臨床靶體積被定義為大體腫瘤體積(MRI上可見腫瘤的所有范圍)加I cm邊緣。
[0123]在診斷時，大多數患者，如果不是所有患者，將被置于地塞米松治療上。將做出努力以便至初始輻射治療的第6周使所有患者戒掉地塞米松，以便使疫苗施用前免疫重建成為可能。
[0124]通過首先在兩個肩胛上注射部位局部施用咪喹莫特而完成疫苗施用。然后在每個施用時間點以約2 X IO6裂解的Y-輻射的GBM6-AD細胞/每劑量以兩個分開的劑量真皮內給予疫苗。
[0125]實施例2
樹突狀細胞(DC)接種是強大的癌癥免疫治療方法，其最近已經獲得監管批準，并且腫瘤裂解物脈沖的DC疫苗正在臨床試驗中測試。經常從在大氣氧C20% O2)中培養的細胞生成腫瘤細胞裂解物(TL)，所述大氣氧高于原位腫瘤中的O2張力。已經發現，在5% O2中培養鼠腫瘤細胞深度增強了 TL疫苗的效力。因此，本發明人力圖確定在5% O2中培養原代人腦膠質瘤細胞是否將增強DC功效和腫瘤抗原表達。不同于在20% O2中培養的原代成膠質細胞瘤細胞，在5% O2中培養顯示向在親本腫瘤原位的基因表達模式的部分回復。此外，5% O2 TL被DC更有效地攝取，其表現出將抗原遞呈至⑶8 T細胞的優異能力。由5% O2裂解物-脈沖的DC引發的⑶8 T細胞相對于由20% O2 TL引發的那些具有顯著改進的腫瘤殺傷功能。本發明人的結果共同地表明，組織培養物O2可以:i)使靶抗原的表達偏移以更好地反映原位腫瘤，ii)增加DC對于抗原遞呈的功效，iii)增強⑶8 T細胞的效應功能。這些結果對于增強TL-脈沖的DC疫苗的療效具有廣泛意義。基于這些數據，已經使用用在無血清條件下在5% O2中擴增的膠質瘤細胞脈沖的DC起始臨床試驗。[0126]利用用腫瘤相關抗原脈沖的樹突狀細胞(DCs)的治療性接種是用于癌癥免疫治療的有希望的方法(Ridgway D.The first 1000 dendritic cell vaccines.CancerInvest 2003; 21: 873-86)。美國食品和藥物管理局最近批準了肽脈沖的DC疫苗用于治療去勢耐受的前列腺癌(DeFrancesco L.Landmark approval for Dendreon's cancervaccine.Nat Biotechnol; 28: 531-2; Kantoff Pff, Higano CS, Shore ND,等人.Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer.N Engl JMed; 363: 411-22)。腫瘤細胞經常用作用于DC疫苗的抗原的來源。使用腫瘤細胞和腫瘤細胞裂解物(TL)的疫苗具有多個優勢，包括靶向多個患者特異性的腫瘤抗原。TL-脈沖的DC接種在許多惡性腫瘤的早期臨床試驗中已經表現出令人鼓舞的結果，但是明顯需要額外的改進(Le DTj Pardoll DM, Jaffee EM.Cellular vaccine approaches.Cancer J;16: 304-10)。
[0127]仍然不清楚的是，組織培養可能如何影響腫瘤細胞疫苗誘發的抗腫瘤免疫應答。在含有血清的培養基中培養的原代成膠質細胞瘤細胞在基因和表型上非常不同于初始腫瘤，而相同細胞在無血清條件下的培養更緊密地反映初始腫瘤，并且富集癌干細胞表型(Lee J, Kotliarova S，Kotliarov Y，等人.Tumor stem cells derived fromglioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype andgenotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines.Cancer Cell2006; 9: 391-403)。當用于在小鼠模型中的TL-脈沖的DC疫苗時，與源自含有血清的培養基的那些相比，在無血清條件下生成的膠質瘤細胞裂解物更有效(Pellegatta S，Poliani PLj Corno D，等人.Neurospheres enriched in cancer stem-like cellsare highly effective in eliciting a dendritic cell-mediated immune responseagainst malignant gliomas.Cancer Res 2006; 66: 10247-52)。傳統地，腫瘤細胞疫苗源自在大氣氧r 20.95%;此后為20% O2)中保持的培養物，所述大氣氧遠不同于在原位成膠質細胞瘤中測量的小于6% O2的平均氧張力(Evans SM，Judy KDj Dunphy I，等人.Hypoxia is important in the biology and aggression of human glial braintumors.Clin Cancer Res 2004; 10: 8177-84)。確立的是，氧影響基因表達、細胞代謝、增殖、生存(van den Brenk HAj Moore V，Sharpington C，Orton C.Productionof metastases by a primary tumour irradiated under aerobic and anaerobicconditions in viv0.Br J Cancer 1972; 26: 402-12; Sciandra JJj Subjeck JRjHughes CS.1nduction of glucose-regulated proteins during anaerobic exposureand of heat-shock proteins after reoxygenation.Proc Natl Acad Sci USA 1984;81: 4843-7; Pouyssegur J， Dayan F， Mazure NM.Hypoxia signalling in cancer andapproaches to enforce tumour regression.Nature 2006; 441: 437—43; Gordan JDjSimon MC.Hypoxia-1nducible factors: central regulators of the tumor phenotype.Curr Opin Genet Dev 2007; 17: 71-7)，并且缺氧增加腫瘤干細胞標記⑶133、巢蛋白和 S0X2 的表達(Platet N，Liu SYj Atifi MEj 等人.1nfluence of oxygen tensionon CD133 phenotype in human glioma cell cultures.Cancer Lett 2007; 258:286-90; McCord AM， Jamal M， Shankavaram UTj Lang FFj Camphausen K， Tofilon PJ.Physiologic oxygen concentration enhances the stem-like properties of CDI33+human glioblastoma cells in vitr0.Mol Cancer Res 2009; 7: 489—97; Li Z， Bao S，Wu Q,等人.Hypoxia-1nducible factors regulate tumorigenic capacity of gliomastem cells.Cancer Cell 2009; 15: 501-13)。然而，氧對腫瘤細胞免疫原性的影響卻知之甚少。
[0128]本結果表明，在20% O2中培養原代神經膠質瘤細胞引起了基因表達遠離初始腫瘤的總體偏移，這被在5% O2培養細胞部分逆轉。值得注意的是，已知引發T細胞應答的幾種膠質瘤抗原的表達在5% O2中增加。在5% O2中生長的原代人膠質瘤細胞表現出固有的佐劑特性，如優異的DC攝取、抗原遞呈和腫瘤殺傷性CD8 T細胞的引發所評價的。因此，在5% O2在無血清培養基中生長的原代人膠質瘤細胞作為腫瘤細胞疫苗的演變中最新的改進而出現。
[0129]材料與方法
腫瘤細胞培養:將手術切除的膠質瘤(表1)酶分離，并且在神經干細胞培養基中培養(Wu A, Oh S，Wiesner SM，等人.Persistence of CD133+ cells in human and mouseglioma cell lines: detailed characterization of GL261 glioma cells with cancerstem cell-like propert ies.Stem Cells Dev 2008; 17: 173—8)。
纖1J.? 腫瘤實^-1m
想教 1 *BT130 GBM mwn12
2 #BT132 GBM 徵\Vi 列12
!Mn 3 6BM6 GBM mRNA _ Fe, CTL8
4 MNBT110 GBM TnRUAl Fe,14


Westerns, CTL
tl fi 5 MN8T112 EjxJ CTL12
!Mn 6 MNBT113 GBM mRNA, Fe14


Western
S# I MNBT124 GSM mRNA, Fe15
表1.腫瘤鑒定、患者信息、和其中使用腫瘤的實驗和細胞代數的表格。*表明腫瘤在Mayo Clinic, Rochester MN 切割；其他在 University of Minnesota Medical Center,Fairview切割。GBM=多形性成膠質細胞瘤，Epd =室管膜瘤，FC =流式細胞術，CTL =細胞毒性測定。[0130]除非明確規定，所有組織培養均保持在20% 02。在如所述使用之前，通過在5% O2維持至少30天從20% O2培養物轉化標記為“5% O2”的培養物(Olin MR, Andersen BM,Zellmer DM,等人.Superior efficacy of tumor cell vaccines grown in physiologicoxygen.Clin Cancer Res; 16: 4800-8)。
[0131]微陣列:從切割時突然冷凍的組織或來自5%或20% O2的培養細胞分離總RNA。使用全基因組基因表達DASL測定(Illumina，San Diego, CA)分析18，401個基因的表達水平。
[0132]根據制造商說明使用RNEasy? Plus Mini試劑盒(Qiagen?, Valencia, CA)從在切割時突然冷凍的組織或在5%和20% O2生長的細胞分離總RNA。用Agilent 2100生物分析儀(Santa Clara, CA.)進行質量對照。使用全基因組基因表達DASL測定(Illumina, SanDiego, CA)來分析18，401個基因的表達水平。簡而言之,使用混合的poly-T和隨機九聚引物從來自每份樣品的100 ng總RNA合成生物素化的cDNA。雜交生物素化的cDNA以測定寡核苷酸，其隨后與鏈霉親和素綴合的順磁顆粒結合。延伸和連接寡核苷酸，生成模板，所述模板用隨機的突光引物擴增。突光標記的產物與在Illumina HumanRef-8_VI ExpressionBeadChip上每個微陣列上含有的24，631個寡核苷酸探針結合，并且用激光共聚焦顯微鏡分析。對于患者2的每種條件和來自患者I的組織，分析三個技術重復。對于源自患者I的細胞系進行兩個技術復制。
[0133]如前所述分析陣列數據的質量對照(Sarver AL.Toward understanding theinformatics and statistical aspects of micro-RNA profiling.J Cardiovasc TranslRes; 3: 204-11)，分位數均一化，并且將每種基因的多個探針平均化。對于每組實驗(腫瘤，20%和5%氧)，將每個實驗值除以20% O2培養物的平均值，以確定不依賴于不同腫瘤之間差異的狀態之間的差異。使用兩組t檢驗以及平均倍數變化來確定差異表達的基因。
[0134]定量RT-PCR:使用SY`BR Green 一步PCR母液混合物(Qiagen?)通過實時RNA分析提取的RNA。以下條件用于在ABI PRISM 7500熱循環儀中的PCR:95°C持續15 min;94°C持續30s, 55°C持續30s, 68°C持續30s，總共40個循環；72°C持續10 min ;和10°C，直到收集。使用2_AAet*法計算基因表達的相對定量，并且均一化至GAPDH表達水平(Livak KJ, Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data usingreal-time quantitative PCR and the 2 (-Delta Delta C (T)) Method.Methods 2001;25: 402-8)。引物列于表2中。
【權利要求】
1.抗腫瘤組合物，其包含純化的成膠質細胞瘤GBM6-AD干細胞。
2.權利要求1的抗腫瘤組合物，其中所述純化的GBM6-AD干細胞是貼壁細胞。
3.權利要求2的抗腫瘤組合物，其中所述純化的貼壁成膠質細胞瘤GBM6-AD干細胞是ATCC?專利保藏名稱PTA-11498。
4.權利要求1或權利要求2的抗腫瘤組合物，其中所述GBM6-AD細胞是裂解的。
5.權利要求1至4中任一項的抗腫瘤組合物，其中所述GBM6-AD細胞是輻射的。
6.權利要求1至5中任一項的抗腫瘤組合物，進一步包含藥學上可接受的無毒媒介物。
7.權利要求1至6中任一項的抗腫瘤組合物，進一步包含佐劑。
8.權利要求7的抗腫瘤組合物，其中所述佐劑是CpGODN、聚ICLC、膜聯蛋白A2、或TLR配體。
9.權利要求8的抗腫瘤組合物，其中所述佐劑是TLR7、TLR8或TLR7/8配體。
10.權利要求9的抗腫瘤組合物，其中所述試劑是咪喹莫特。
11.權利要求7的抗腫瘤組合物，其中所述佐劑是刺激免疫應答的非TLR配體。
12.權利要求1至11中任一項的抗腫瘤組合物，其中所述細胞或細胞裂解物與載體綴八口 o
13.權利要求12的抗腫瘤組合物，其中所述載體是樹突狀細胞或巨噬細胞。
14.權利要求1至13中任一項的抗腫瘤組合物，其中所述組合物包含在非細胞載體中。
15.權利要求1至14中任一項的抗腫瘤組合物，其中所述組合物包含在脂質體中。
16.引發需要免疫應答的動物中的免疫應答的方法，其包括將權利要求1至15中任一項的抗腫瘤組合物施用于所述動物。
17.權利要求16的方法，其進一步包括將咪喹莫特施用于所述動物。
18.權利要求17的方法，其中在施用所述抗腫瘤組合物之前施用所述咪喹莫特。
19.權利要求16至18中任一項的方法，其中腸胃外施用所述抗腫瘤組合物。
20.權利要求19的方法，其中肌內、皮下、真皮內或靜脈內施用所述組合物。
21.權利要求16至19中任一項的方法，其中口服或鼻內施用所述組合物。
22.權利要求16至21中任一項的方法，其中在多于一個時間點施用所述抗腫瘤組合物。
23.權利要求22的方法，其中在兩個時間點施用所述抗腫瘤組合物。
24.權利要求16至23中任一項的方法，其中在每個施用時間點以100，000- 100百萬個GBM6-AD細胞的劑量施用所述抗腫瘤組合物。
25.權利要求24的方法，其中在每個施用時間點以2X IO6個GBM6-AD細胞的劑量施用所述抗腫瘤組合物。
26.權利要求17的方法，其中局部、真皮內、皮下、和/或經由淋巴節內注射施用所述咪喹莫特。
27.權利要求17的方法，其中在兩個肩胛上注射部位局部施用所述咪喹莫特。
28.權利要求16至27中任一項的方法，其進一步包括將輻射治療施用于所述動物。
29.權利要求28的方法，其中在施用所述抗腫瘤組合物之前、期間或之后施用所述輻射治療。
30.權利要求28或29的方法，其中以小于6，000cGY的劑量施用所述輻射治療。
31.權利要求28至30中任一項的方法，其中在多個時間點施用所述輻射治療。
32.權利要求31的方法，其中在三個時間點施用所述輻射治療。
33.權利要求28至32中任一項的方法，其中以5220cGY的劑量、和隨后的每個360cGY的兩個額外劑量施用所述輻射治療。
34.權利要求33的方法，其中在5220cGY的劑量后10周施用360 cGY的第一額外劑量，且在5220 cGY的劑量后14周施用360 cGY的第二額外劑量。
35.權利要求28至34中任一項的方法，其進一步包括將輻射敏化劑施用于所述動物。
36.權利要求35的方法，其中所述輻射敏化劑是parp抑制劑。
37.權利要求35的方法，其中所述輻射敏化劑是替莫唑胺。
38.權利要求37的方法，其中在初始輻射治療期間施用所述替莫唑胺。
39.權利要求37的方法，其中以5-200mg/m2/天的劑量施用所述替莫唑胺。
40.權利要求37的方法，其中以75mg/m2/天的劑量施用所述替莫唑胺。
41.權利要求28至40中任一項的方法，其中所述輻射治療是以180cGy的部分的5220cGy的劑量。
42.權利要求41的方法，其中經6至7周施用所述輻射治療。
43.權利要求41的方法，其進一步包括在所述初始輻射治療后4周和8周經連續兩天以180cGy部分施用額外360 cGY部分。
44.權利要求16至43中任一項的方法，其中所述動物是哺乳動物。
45.權利要求44的方法，其中所述哺乳動物是人。
46.權利要求16至45中任一項的方法，其進一步包括將地塞米松治療施用于所述動物。
47.權利要求46的方法，其中在診斷時施用所述地塞米松治療。
48.權利要求46的方法，其中到所述初始輻射治療的第6周使所述動物斷絕地塞米松。
49.權利要求16至48中任一項的方法，其進一步包括施用耗竭調節性T細胞或骨髓源性抑制細胞的化療劑或藥物。
50.權利要求49的方法,其中所述化療劑是舒尼替尼(sunititib)、ontak、環磷酰胺、吉西他濱、和/或維甲酸。
51.引發動物中的免疫應答的方法，其包括將權利要求1至15中任一項的組合物引入所述動物中。
52.產生對GBM6-AD特異性的抗體的方法，其包括將權利要求1至15中任一項的組合物引入動物中，且分離對GBM6-AD特異性的抗體。
53.產生樹突狀細胞疫苗的方法，其包括用權利要求1至15中任一項的抗腫瘤組合物脈沖樹突狀細胞。
54.純化的抗體，其與純化的貼壁成膠質細胞瘤GBM6-AD干細胞特異性結合。
55.權利要求54的抗體，其中所述純化的貼壁成膠質細胞瘤GBM6-AD干細胞是ATCC?專利保藏名稱PTA-11498。
56.權利要求54或55的抗體,其中所述抗體是`人抗體或人源化抗體。
57.權利要求56的抗體，其中所述抗體是人源化抗體。
58.權利要求56的抗體，其中所述抗體是完全人源化抗體。
59.權利要求56的抗體,其中所述抗體是單鏈Fv或scFv片段。
60.治療需要治療的患者中的原發性腦腫瘤的方法，其包括將權利要求1至15中任一項的抗腫瘤組合物或權利要求54-59中任一項的純化的抗體施用于所述患者。
61.權利要求1至15中任一項的抗腫瘤組合物或權利要求54-59中任一項的純化的抗體用于治療癌癥的用途。
62.權利要求1至15中任一項的抗腫瘤組合物或權利要求54-59中任一項的純化的抗體用于癌癥的預防或治療性處理中的用途。
63.權利要求60的方法或權利要求61或62的用途，其中所述原發性腦腫瘤是星形細胞瘤、多形性成膠質細胞瘤、成神經管細胞瘤或室管膜細胞瘤。
64.權利要求63的 方法，其中所述原發性腦腫瘤是多形性成膠質細胞瘤。
【文檔編號】A61K39/00GK103491978SQ201180062375
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2011年10月25日 優先權日:2010年10月25日
【發明者】J.R.奧爾費斯特, M.R.奧林, W.羅 申請人:明尼蘇達大學評議會