本發明涉及植物抗病毒基因工程領域，具體地，本發明涉及抗煙草脈帶花葉病毒和馬鈴薯Y病毒新靶標PsbO1的篩選及其在抗病毒侵染中的應用。
背景技術：
：：病毒病是作物上的重要病害，給農業生產造成巨大損失。種植抗病品種是防治作物病毒病最經濟有效的方法。近年的研究發現，植物也有“阿克琉斯的腳踝”。有些植物蛋白在病毒侵染中起關鍵作用，如果將編碼這些蛋白的基因敲除，植物就會獲得對病毒的抗性。馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)是植物病毒中最大的屬，約占已知植物病毒種類的30％，寄主范圍廣泛，危害嚴重。馬鈴薯Y病毒屬病毒與其他屬多種病毒間存在協生作用，一旦復合侵染會引起更為嚴重的癥狀，造成更大損失。該屬許多病毒的VPg可以和植物的真核生物翻譯起始因子eIF4E互作；如果eIF4E發生突變或者編碼基因被敲除，植株就可以產生對馬鈴薯Y病毒屬病毒的抗性。煙草脈帶花葉病毒(Tobaccoveinbandingmosaicvirus,TVBMV)和馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY,PVY)都屬于馬鈴薯Y病毒屬，主要侵染馬鈴薯、煙草、番茄和辣椒等茄科作物。本發明通過免疫沉淀和質譜技術，獲得了1個能與煙草脈帶花葉病毒6K2互作的光系統Ⅱ放氧復合體蛋白PsbO1；降低PsbO1基因的表達可使植物產生對TVBMV和PVY的抗性。因此，PsbO1是一種新的抗病毒靶標。技術實現要素：本發明提供了一種植物抗馬鈴薯Y病毒屬病毒的新靶標。首先，利用免疫沉淀技術和質譜技術鑒定到可能與TVBMV蛋白互作的寄主蛋白PsbO1；然后通過免疫共沉淀和雙分子熒光互補試驗證明PsbO1和TVBMV6K2互作；最后，利用病毒誘導的基因沉默技術將PsbO1基因沉默后，植株能抵抗TVBMV和PVY的侵染。本發明實施的具體技術方案是：A.與TVBMV蛋白潛在互作寄主蛋白的篩選。TVBMV的侵染性克隆中連入6K1GFP基因。通過農桿菌浸潤法將該克隆接種到寄主植物本氏煙，7天后提取植物總蛋白。利用GFP抗體偶聯的瓊脂糖珠進行免疫沉淀，純化6K1寄主互作蛋白復合體，SDS-PAGE分離蛋白，切取特異性蛋白條帶。經質譜鑒定發現6K1互作蛋白復合體中含有PsbO1。b.PsbO1基因的獲得：根據PsbO1序列設計特異性引物。提取植物總RNA,利用反轉錄PCR擴增PsbO1基因并測序驗證。c.PsbO1和TVBMV6K1、6K2互作的驗證：將PsbO1基因克隆到免疫共沉淀和雙分子熒光互補載體,利用免疫共沉淀和雙分子熒光互補驗證其互作。d.PsbO1基因沉默對馬鈴薯Y病毒屬病毒作用測定：將特定的PsbO1基因片段連接到TRV基因沉默載體，PsbO1沉默后再接種TVBMV或PVY。采用本發明所述的技術方案，可以獲得如下的技術效果：1)獲得了一種抗病毒靶標PsbO1；2)降低PsbO1基因表達可使植株抗馬鈴薯Y病毒屬病毒的侵染。附圖說明圖1PsbO1和TVBMV6K1、6K2互作的驗證a：CO-IP實驗證明PsbO1可以和TVBMV6K2直接互作，但不能與TVBMV6K1直接互作，PsbO1通過6K2與6K1間接互作；b：BiFC實驗證明PsbO1可以和TVBMV6K2直接互作。圖2PsbO1基因沉默后接種TVBMV第6天的癥狀、熒光分布和病毒積累水平a：PsbO1基因沉默后可抑制TVBMV侵染；b：本氏煙PsbO1基因沉默后，植株阻礙了病毒的系統移動和復制；c：PsbO1基因沉默效果；d：PsbO1基因沉默對TVBMV復制水平的影響；e：PsbO1基因沉默TVBMV病毒粒子積累的影響。圖3PsbO1基因沉默后接種PVY第10天的癥狀、熒光分布和病毒積累水平a：本氏煙PsbO1基因沉默后，植株阻礙了PVY的系統移動和復制；b：PsbO1基因沉默效果；c：PsbO1基因沉默對PVY復制水平的影響；d：PsbO1基因沉默PVY病毒粒子積累的影響。具體實施方式以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發明的上述內容做進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。本發明所提供的實施例，均按照常規實驗條件，其中所采用的引物序列如下表：F代表正向引物，R代表反向引物。利用表中引物可以分別擴增PsbO1編碼區全長和用于病毒誘導基因沉默的片段。實施例1：免疫沉淀取TVBMV-GFP或TVBMV-6K1GFP侵染7天后的本氏煙葉片，在研缽中加入液氮充分研磨至粉末狀，加入ExtractionBuffer提取植物總蛋白。ExtractionBuffer組成成分如下：50mMTris-Cl,pH7.5,150mMNaCl,10％[v/v]glycerol,0.5％[v/v]NonidetP-40,1tabletproteaseinhibitorcocktail4℃,20000g離心10min，取上清液加入GFP抗體偶聯的瓊脂糖珠，4℃孵育3小時，用不含NonidetP-40的ExtractionBuffer洗5次，加入2×SDS上樣緩沖液，沸水中煮10分鐘，SDS-PAGE電泳分離各蛋白條帶。將蛋白條帶切下送上海基云生物技術公司進行質譜鑒定。結果表明，有4個肽段和PsbO1同源，說明通過免疫沉淀篩選到的6K1GFP蛋白復合體中存在PsBO1。實施例2：基因擴增以植物總RNA為模板，利用反轉錄PCR擴增PsbO1基因。所用反轉錄酶為M-MLV,DNA聚合酶為Phusion高保真聚合酶。反轉錄反應體系如下：PCR反應體系如下：得到的PsbO1基因長999bp，其序列如SeqIDNo.7所示，編碼的氨基酸序列SeqIDNo.8所示。實施例3：PsbO1和TVBMV6K1、6K2互作的驗證6K1和6K2可以相互作用。6K1GFP復合體中存在的PsbO1可能與6K1直接互作，也可能與6K2直接互作，通過6K2與6K1間接互作。將PsbO1、TVBMV6K1和6K2基因分別克隆到免疫共沉淀載體pCam35S:HA和pCam35S:GFP,雙分子熒光互補載體pYN和pYC。將重組的免疫共沉淀載體轉化農桿菌后，浸潤本氏煙葉片。3天后提取植物總蛋白，加入GFP抗體偶聯的瓊脂糖珠進行免疫沉淀。利用HA抗體通過Westernblot檢測蛋白互作。PsbO1與6K2發生免疫共沉淀反應，而與6K1發生免疫共沉淀反應(圖1，a)，說明PsbO1與6K2能直接互作，而與6K1無直接互作。將重組的雙分子熒光互補載體轉化農桿菌后，浸潤本氏煙葉片。2天后取葉片表皮層在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察熒光。用波長為514nm的氬離子激光激發，在530-600nm波長處檢測YFP熒光。結果表明，PsbO1只與6K2共同表達發出黃色熒光(圖1，b)，證明PsbO1在體內也可以與6K2相互作用。實施例4：PsbO1基因沉默對TVBMV和PVY侵染的影響將PsbO1基因克隆到病毒沉默載體TRV的RNA2后接種本氏煙，然后將病毒載體TRV1,TRV2和TRV2-PsbO1分別轉化農桿菌GV3101。經菌落PCR驗證后，挑單斑接種于含有卡那霉素(50μg/mL)、利福霉素(50μg/mL)、四環素(50μg/mL)的液體LB培養基中。取500μL菌液加至5mL含10mmol/L2-(N-嗎啉)-乙基磺酸(MES)和20μmol/L乙酰丁香酮(AS)及上述三種抗生素的LB培養基中，28℃振蕩培養至對數生長期。離心收集菌體并重新懸浮于10mmol/LMgCl2，10mmol/LMES，150μmol/LAS中，調整濃度使其OD600為1.0左右，室溫靜置3小時。取1mL一次性注射器，去掉針頭吸取農桿菌菌液。將攜帶TRV1和TRV2，或TRV1和TRV2-PsbO1的農桿菌按照1∶1的比例浸潤本氏煙。每株浸潤2片葉。浸潤的植株置于23℃光照培養箱中培養(16小時光照/8小時黑暗交替)。每個處理接種10棵本氏煙，重復3次。14天后，摩擦接種TVBMV-GFP或PVY-GFP。TVBMV-GFP在對照本氏煙植株(煙草脆裂病毒空載體TRV1和TRV2侵染)系統葉上引起明顯的花葉癥狀，而在PsbO1沉默的本氏煙植株(TRV1和TRV2-PsbO1侵染)系統葉幾乎不表現癥狀(圖2，a和b)。紫外燈下，TVBMV-GFP在對照本氏煙系統葉上有強烈的綠色熒光，而在在PsbO1沉默的本氏煙上只有點狀熒光(圖2，a和b)。熒光定量PCR結果表明，在PsbO1基因沉默的本氏煙上(圖2，c；圖3，b)，TVBMV基因組RNA的積累水平葉顯著下降(圖2，d)。免疫印跡實驗結果表明，TVBMV外殼蛋白(coatprotein，CP)表達量顯著降低(圖2，e)。PVY-GFP在對照本氏煙植株(煙草脆裂病毒空載體TRV1和TRV2侵染)系統葉上引起明顯的花葉癥狀，而在PsbO1沉默的本氏煙上無明顯癥狀(圖3，a和b)。紫外燈下，PVY-GFP在對照本氏煙系統葉上有強烈的綠色熒光，而在在PsbO1沉默的本氏煙上只有點狀熒光(圖3，a和b)。熒光定量PCR結果表明，在PsbO1基因沉默的本氏煙上，PVY的基因組RNA的積累水平葉顯著下降(圖3，c)。免疫印跡實驗結果表明，PVYCP表達量也顯著降低(圖3，d)。以上結果表明，降低PsbO1基因的表達量可使植物抵抗煙草脈帶花葉病毒和馬鈴薯Y病毒的侵染。<110>山東農業大學<120>一種植物抗病毒基因的篩選與應用<160>15<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>1ATGGCTGTCTCTTTACAAGCAG22<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2TCATTCAAGTTGGGCATACCAG22<210>3<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>3GCTCTAGACCCCAGATTTCCAGAAAACTAAG32<210>4<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>4CGGGATCCCACATCCTTGGGGACCTTTG28<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>5GCTCTAGAATGGCTGTCTCTTTACAAGCAG30<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>6CGGGATCCTTCAAGTTGGGCATACCAG27<210>7<211>999<212>DNA<213>PsbO1基因序列<400>7ATGGCTGTCTCTTTACAAGCAGCTGCTACTCTTATGCAACCAACAAAGGTTGGTGTTGCC60CCAGCTAGAAACAACCTGCAGTTGAGGTCTGCTCAAAGTGTGTGCAAAGCATTTGGTGTT120GAACCAGCTGCAGCTAGGCTTACTTGCTCTTTGCAAACTGAACTCAAGGACTTGGCTCAA180AAGTGCACTGATGCTGCGAAGGTTGCTGGTTTTGCTCTGGCCACTTCCGCCCTTGTCGTC240TCAGGAGCAAATGCTGAAGGAGCTCCAAAACGTCTAACCTTCGACGAAATTCAAAGCAAG300ACATACATGGAAGTAAAGGGAACTGGAACTGCTAACCAGTGCCCTACCATAGAAGGAGGT360GTTGCCAGCTTTGCCTTCAAGCCAGGCAAATACAATGCCAAGAAATTCTGCTTAGAGCCC420ACATCATTCACGGTCAAGGCAGAGAGTGTGAACAAGAATGCACCCCCAGATTTCCAGAAA480ACTAAGCTCATGACACGCTTAACCTACACCCTTGATGAGATTGAGGGACCATTCGAAGTG540TCTTCTGATGGCACTGTTAAGTTTGAGGAGAAGGATGGAATTGATTATGCTGCTGTTACA600GTTCAGCTTCCTGGTGGTGAGCGTGTGCCCTTCCTCTTCACTATCAAACAGCTAGTGGCA660AGCGGCAAACCAGAAAGCTTTAGCGGTGAATTCCTTGTGCCATCATACAG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