專利名稱：在植物中表達(dá)除草劑結(jié)合多肽以產(chǎn)生除草劑耐受性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過在植物中或植物器官中表達(dá)外源除草劑結(jié)合多肽制備耐除草劑植物的方法。本發(fā)明還涉及編碼在轉(zhuǎn)基因植物中有除草劑結(jié)合特性的多肽、抗體或抗體部分的相應(yīng)核酸及轉(zhuǎn)化植物本身的用途。
已知遺傳工程方法允許外源基因特異轉(zhuǎn)移到植物基因組中。將這種方法稱為轉(zhuǎn)化，得到的植物為轉(zhuǎn)基因植物。目前，轉(zhuǎn)基因植物用于生物技術(shù)的許多領(lǐng)域。如抗昆蟲植物(Vaek等，植物細(xì)胞5(1987)，159-169)，抗病毒植物(Powell等，科學(xué)232(1986)，738-743)和抗臭氧植物(Van Camp等，生物技術(shù)12(1994)，165-168)。通過遺傳工程得到的改良性狀的例子有改良的果實(shí)貯存期(Oeller等，科學(xué)254(1991)，437-439)、土豆塊莖中提高的淀粉產(chǎn)量(Stark等，科學(xué)242(1992)，419)、淀粉組分改變(Visser等，Mol.Gen.Genet.225(1991)，289-296)和脂類組分改變(Voelker等，科學(xué)257(1992)，72-74)以及外源高分子的合成(Poirer等，科學(xué)256(1992)，520-523)。
植物分子遺傳學(xué)領(lǐng)域中進(jìn)行的工作的重要目標(biāo)是產(chǎn)生除草劑耐受性。除草劑耐受性的特征在于植物或植物器官與所用除草劑的相容性得到改善(就類型或水平而言)。這可通過多種途徑實(shí)現(xiàn)。已知的方法聯(lián)合應(yīng)用代謝基因如pat基因和草銨膦抗性(WO8705629)或抗除草劑的靶酶如抗草甘膦的烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(WO9204449)，并在細(xì)胞和組織培養(yǎng)中使用除草劑選擇耐受性植物細(xì)胞和得到的抗性植物，如在關(guān)于乙酰輔酶A羧化酶抑制劑中描述的(US5162602，US5290696)。
抗體是作為免疫系統(tǒng)組分的蛋白。所有抗體的共同特征是它們的立體球形結(jié)構(gòu)、輕鏈和重鏈的構(gòu)成及其高特異性地與分子或分子部分結(jié)構(gòu)結(jié)合的基本能力(Alberts等，在Molekularbiologie，derZelle[細(xì)胞分子生物學(xué)]，第2版，1990，VCH Verlag，ISBN 3-527-27983-0，1198-1237)。根據(jù)這些特征，將抗體用于多種任務(wù)。應(yīng)用可分為在產(chǎn)生抗體的動物和人體內(nèi)應(yīng)用抗體，即所謂的原位應(yīng)用，和ex-sita應(yīng)用，即從產(chǎn)生抗體的細(xì)胞和生物體分離抗體后應(yīng)用抗體(Whitelam und Cockburn，TIPS第1卷，8(1996)，268-272)。
用體細(xì)胞雜交細(xì)胞系(雜交瘤)作為針對十分特異的抗原的抗體源的根據(jù)是Kohler和Milstein進(jìn)行的工作(自然256(1975)495-97)。這種方法允許有統(tǒng)一的結(jié)構(gòu)并由細(xì)胞融合方法產(chǎn)生的所謂單克隆抗體產(chǎn)生。免疫小鼠的脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合。這可使雜交瘤細(xì)胞無限繁殖。同時，細(xì)胞分泌針對免疫小鼠所用抗原的特異性抗體。脾細(xì)胞提供產(chǎn)生抗體的能力而骨髓瘤細(xì)胞使細(xì)胞無限生長并不斷地分泌抗體。作為克隆，因為每個雜交瘤細(xì)胞來自單個B細(xì)胞，產(chǎn)生的所有抗體分子有相同的結(jié)構(gòu)，包括抗原結(jié)合位點(diǎn)。因為可以無限得到有單一的、已知特異性和共同結(jié)構(gòu)的抗體，所以這種方法大大促進(jìn)了抗體的應(yīng)用。單克隆抗體廣泛應(yīng)用于免疫診斷學(xué)和治療學(xué)。
在最近幾年中，所謂的噬菌體展示方法已用于制備抗體，避免了免疫系統(tǒng)和多次免疫動物。抗體的親和性和特異性得到體外測量(Winter等，免疫學(xué)年評12(1994)，433-455；Hoogenboom，TIBTech，第15卷(1997)，62-70)。含有編碼抗體可變區(qū)，即抗原結(jié)合位點(diǎn)序列的基因片段與噬菌體外殼蛋白基因融合。然后，用含有這樣的融合基因的噬菌體感染細(xì)菌。得到的噬菌體顆粒具有含抗體樣融合蛋白的外殼，抗體結(jié)合區(qū)指向外側(cè)。這樣的噬菌體展示文庫可用于分離含希望的抗體片段并與某抗原特異性結(jié)合的噬菌體。通過這種方式分離到的每個噬菌體產(chǎn)生與單克隆抗體一致的單克隆抗原結(jié)合多肽。每個噬菌體獨(dú)特的抗原結(jié)合位點(diǎn)基因可從噬菌體DNA中分離到并用于構(gòu)建完整抗體的基因。
在農(nóng)作物保護(hù)領(lǐng)域，抗體特別用作抗原的質(zhì)量和數(shù)量檢測的ex-sita分析工具。這包括在飲用水中(Sharp等，(1991)ACS Symp Ser.，446(Pestic.Residues Food Saf.)87-95)、土壤樣品中(WO9423018)或植物或植物器官中植物成分、除草劑或殺真菌劑的檢測，并且將抗體用作結(jié)合分子純化的輔助。
Hiatt等，自然，342(1989)，76-78首次描述了在植物中制備免疫球蛋白。范圍包括單鏈抗體至多聚體分泌抗體(J.Ma和Mich Hein，1996，Annuals New York Academy of Sciences，72-81)。
更近期的嘗試?yán)每贵w原位保護(hù)植物免受病原體侵襲，尤其是病毒疾病，是通過在植物細(xì)胞中表達(dá)針對病毒外殼蛋白特異的抗體或其部分實(shí)現(xiàn)的(Tavlacloraki等，自然366(1993)，469-472；Voss等，分子育種1(1995)，39-50)。
相似的方法也用于保護(hù)植物免受線蟲感染(Rosso等，生物化學(xué)和生物物理研究通訊，220(1996)255-263)。也存在藥物學(xué)中應(yīng)用的例子，其中抗體在植物中的原位表達(dá)用于口腔免疫(Ma等，科學(xué)268(1995)，716-719；Mason和Arntzen，Tibtech第13卷(1996)，388-392)。通過口、喉或消化道給身體提供植物形成的或來自植物或植物器官、適于消費(fèi)的抗體，可產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)。而且，已在植物中表達(dá)了針對低分子量植物激素脫落酸的單鏈抗體，由于植物中脫落酸的結(jié)合，觀察到了植物激素可得到性降低(Artsaenko等，植物雜志8(5)(1995)，754-750)。
農(nóng)學(xué)上重要農(nóng)作物中雜草的化學(xué)控制需要高選擇性的除草劑。然而，在某些情況下，難以發(fā)展選擇性足夠的、不導(dǎo)致在任何農(nóng)作物中提供產(chǎn)量的植物破壞的除草劑。導(dǎo)入除草劑抗性或耐受性農(nóng)作物植物有助于解決這個問題。
通過組織培養(yǎng)或種子誘變和自然選擇發(fā)展抗除草劑農(nóng)作物植物受到限制。只有這些植物可通過組織培養(yǎng)技術(shù)操作，從細(xì)胞培養(yǎng)成功再生整株植物。而且，誘變和選擇后，植物可能表現(xiàn)出不希望的、必須通過，甚至在某些情況下重復(fù)回交才能去除的不希望特征。而且，通過雜交導(dǎo)入的抗性將局限于同一物種的植物。
由于上述原因，分離抗性編碼基因并以靶向方式將它導(dǎo)入農(nóng)作物植物的遺傳工程方法比傳統(tǒng)的植物育種方法優(yōu)越。
到目前為止，通過分子生物學(xué)方法發(fā)展除草劑耐受性或抗除草劑農(nóng)作物植物需要了解除草劑在植物中的作用機(jī)制并且發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生對除草劑抗性的基因。目前商業(yè)上使用的許多除草劑通過阻斷必需氨基酸、脂類或色素生物合成步驟的酶起作用。通過使除草劑不再受到結(jié)合的方式改變這些酶的基因并將這些改變的基因?qū)朕r(nóng)作物植物產(chǎn)生除草劑耐受性。可選擇的例子是在自然中，例如在微生物中發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出對除草劑有天然抗性的類似酶。從這樣的微生物中克隆到此賦予抗性的基因，將它再克隆至合適的載體，然后經(jīng)過成功轉(zhuǎn)化，在除草劑敏感的農(nóng)作物植物中表達(dá)(WO96/38567)。
本發(fā)明的目的之一是發(fā)展新型的、制備除草劑耐受性轉(zhuǎn)基因植物的通用遺傳工程方法。
我們驚奇地發(fā)現(xiàn)通過在植物中表達(dá)有除草劑結(jié)合特性的外源多肽、抗體或抗體的部分達(dá)到了這個目的。
本發(fā)明首先涉及制備除草劑結(jié)合抗體和克隆相關(guān)基因或基因片段。
第一步是制備合適的與除草劑結(jié)合的抗體。這特別是通過用抗原免疫脊椎動物，大多數(shù)情況下小鼠、大鼠、狗、馬、驢或山羊?qū)崿F(xiàn)。在此情況下，此抗原是通過功能基團(tuán)與諸如牛血清白蛋白(BSA)、雞卵白蛋白、匙孔血藍(lán)蛋白(KLA)的高分子量載體或其它載體相關(guān)或偶聯(lián)的有殺真菌活性的化合物。重復(fù)施用抗原后，用常規(guī)方法監(jiān)測免疫反應(yīng)，由此分離到了合適的抗血清。最初，這種方法產(chǎn)生含有不同特異性抗體的多克隆血清。為了定向原位應(yīng)用，必需分離編碼單個、特異的單克隆抗體的基因序列。多種途徑可用于此目的。第一種方法利用產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生持續(xù)產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)，最后，通過挑選得到的克隆導(dǎo)致產(chǎn)生特定單克隆抗體的均一的細(xì)胞系。
抗體或抗體的部分即，所謂的單鏈抗體(SCFV)的cDNA是從這樣的單克隆細(xì)胞系中分離到的。這些cDNA序列克隆至表達(dá)盒并在原核和真核生物，包括植物中進(jìn)行功能表達(dá)。
選擇性地，可能通過噬菌體展示文庫選擇抗體，并且這些抗體與除草劑分子結(jié)合繼而將其催化轉(zhuǎn)變成無殺真菌特性的產(chǎn)物。制備催化抗體的方法在Janda等，科學(xué)275(1997)945-948，聯(lián)合抗體文庫中化學(xué)選擇催化作用；催化抗體，1991，Ciba Foundation Symposium159，Wiley-Interscience Publication中得到描述。理論上，克隆此催化抗體基因并在植物中表達(dá)可導(dǎo)致產(chǎn)生抗除草劑植物。
本發(fā)明具體涉及編碼序列編碼除草劑結(jié)合多肽或其功能類似物的表達(dá)盒及用這些表達(dá)盒制備除草劑耐受性植物。此核酸序列可以是DNA序列或cDNA序列。適于插入根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒的編碼序列例如那些來自雜交瘤細(xì)胞的、編碼有除草劑結(jié)合特性多肽由此使宿主產(chǎn)生對植物酶抑制劑抗性的DNA序列。
而且，根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒含控制編碼序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控核酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒包括上游，即在編碼序列的5’-端；啟動子和下游即3’端聚腺苷酸化信號并且如果合適，其它與有除草劑結(jié)合特性的多肽和/或轉(zhuǎn)送肽的中間物編碼序列可操作連接的調(diào)控元件。可操作連接應(yīng)理解為指啟動子、編碼序列、終止子及如果合適，其它調(diào)控元件的順序安排使得編碼序列得到表達(dá)時，調(diào)控元件能按所想的發(fā)揮功能。可操作連接的優(yōu)選順序是但不限于，保證質(zhì)外體、質(zhì)膜、液泡、質(zhì)體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)、核、脂質(zhì)體、或其它區(qū)室亞細(xì)胞定位的靶序列和翻譯增強(qiáng)子，例如來自煙草花葉病毒的5’前導(dǎo)序列(Gallie等，核酸研究15(1987)，8693-8711)。
理論上，根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒的適當(dāng)啟動子[sic]是能保證外源基因表達(dá)的任何啟動子。優(yōu)選使用的啟動子具體地是來自植物的啟動子或來自植物病毒的啟動子。特別優(yōu)選的是來自花椰菜花葉病毒的CaMV35S啟動子(Franck等，細(xì)胞21(1980)285-294)。此啟動子含轉(zhuǎn)錄效應(yīng)物的多個識別序列，它們的共同作用導(dǎo)致導(dǎo)入基因永久的組成型表達(dá)(Benfey等，歐洲分子生物學(xué)組織雜志，8(1989)2195-2202)。
根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒也可包含化學(xué)誘導(dǎo)啟動子，借助于它將外源多肽在植物中的表達(dá)控制在具體的時間點(diǎn)。這樣的啟動子例如PRP1啟動子(Ward等，植物分子生物學(xué)22(1993)，361-366，可由水楊酸誘導(dǎo)的啟動子(WO95/1919443)、由脫落酸誘導(dǎo)的啟動子(EP335528)或由乙酸或環(huán)己酮誘導(dǎo)的啟動子(WO9321334)已在參考中得到描述并且可在其它中應(yīng)用。
其它特別優(yōu)選的啟動子保證在除草活性發(fā)揮作用的組織或植物器官中表達(dá)。保證葉特異性表達(dá)的啟動子值得特別一提。必需提到土豆胞質(zhì)FBPase啟動子或土豆ST-LST啟動子(Stockhans等，歐洲分子生物學(xué)組織雜志8(1989)2445-245)。
在種子特異啟動子幫助下，可使單鏈抗體的穩(wěn)定表達(dá)高達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草種子全部可溶種子蛋白的0.67％(Fiedler和conrad生物/技術(shù)10(1995)，1090-1094)。因為播種的或發(fā)芽過程中的種子也可表達(dá)并且也是本發(fā)明目的希望的，根據(jù)本發(fā)明，這樣的發(fā)芽和種子特異的啟動子也是優(yōu)選的調(diào)控元件。因此，根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒含例如，種子特異的啟動子(優(yōu)選的USP或LEB4啟動子)，LEB4信號肽，將表達(dá)的基因和ER滯留信號。參照單鏈抗體(ScFV基因)，在

圖1中以圖解的形式舉例說明表達(dá)盒的構(gòu)建。
根據(jù)例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，分子克隆實(shí)驗室手冊，冷泉港實(shí)驗室，冷泉港(1989)、T.J.Silhavy，M.L，Berman和L.W.Enquist，基因融合實(shí)驗，冷泉港實(shí)驗室，冷泉港，NY(1984)及Ausubel，F(xiàn).M.等，當(dāng)代分子生物學(xué)方法，GreenePublishing Assoc and Wiley-Interscience(1987)描述的常規(guī)重組和克隆技術(shù)，根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒是將合適的啟動子與合適的多肽DNA及優(yōu)選地，插入啟動子和多肽DNA之間編碼葉綠體特異的轉(zhuǎn)運(yùn)肽DNA和聚腺苷酸化信號融合產(chǎn)生的。
特別優(yōu)選的序列允許定位到質(zhì)外體、質(zhì)體、濾泡、質(zhì)膜、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)或沒有合適的操作序列時，留在形成的區(qū)室中，即細(xì)胞溶膠中(Kermode，Crit.Rev.Plant Sci.15，4(1996)，285-423)。ER和細(xì)胞壁中的定位已證明對于定量蛋白在轉(zhuǎn)基因植物中的積累尤其有利(Schouten)等，植物分子生物學(xué)30(1996)，781-792；Artsaenko等，植物雜志8(1995)745-750)。
本發(fā)明也涉及編碼序列編碼除草劑結(jié)合融合蛋白，部分融合蛋白是控制多肽運(yùn)輸?shù)霓D(zhuǎn)運(yùn)肽的表達(dá)盒。特別優(yōu)選的是葉綠體特異的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，它是在除草劑結(jié)合多肽運(yùn)輸?shù)街参锏娜~綠體后從除草劑結(jié)合多肽部分酶切下來。特別優(yōu)選的來自質(zhì)體轉(zhuǎn)羥乙醛酶(TK)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽或其功能相似物(例如，核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亞基或鐵氧還蛋白NADP氧化還原酶的轉(zhuǎn)運(yùn)肽)。
制備根據(jù)本發(fā)明表達(dá)盒需要的多肽DNA或多肽cDNA優(yōu)選地是借助于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增來的。已知用PCR的DNA擴(kuò)增方法，例如Innis等，PCR方法，方法和應(yīng)用指南，Academic Press(1990)。很方便地用序列分析檢測PCR產(chǎn)生的DNA片段以避免將要表達(dá)的構(gòu)建體中的聚合酶錯誤。
插入的編碼除草劑結(jié)合多肽的核苷酸序列可合成或自然獲得或是含合成和自然DNA成分的混合物。總的來說，制備含植物喜愛的密碼子的合成核苷酸序列。通過出現(xiàn)頻率高的蛋白和大多數(shù)興趣植物物種中表達(dá)的蛋白的密碼子確定植物喜愛的密碼子。當(dāng)制備表達(dá)盒時，可操作多個DNA片段以得到在合適的有意義閱讀和裝備有正確的閱讀框架的核苷酸序列。為了使DNA片段彼此連接，將連接物或接頭加在片段上。
根據(jù)本發(fā)明的啟動子和終止子區(qū)域應(yīng)該以轉(zhuǎn)錄意義提供，并且?guī)в泻粋€或多個限制位點(diǎn)的接頭或多接頭以插入這個序列。原則上，接頭有1-10個，通常1-8個，優(yōu)選地2-6個限制位點(diǎn)。調(diào)控區(qū)域內(nèi)，接頭的大小通常少于100bp，通常少于60bp，但甚至是5bp。根據(jù)本發(fā)明的啟動子是宿主植物天生的或同源的，或與它是外源的或不同。根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒包含以5’-3’的轉(zhuǎn)錄意義的根據(jù)本發(fā)明的啟動子、任何希望的序列和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。多種終止區(qū)是可以相互交換的。
而且，可以采用提供適當(dāng)?shù)南拗莆稽c(diǎn)或去除多余的DNA或限制位點(diǎn)的操作。如果插入、刪除、替代如轉(zhuǎn)換和顛換可能的話，可采用體外誘變、“引物修補(bǔ)”、限制或連接。就合適的操作諸如限制、“chewing-back”或補(bǔ)平以得到“平端”而言，需要提供片段的互補(bǔ)末端以進(jìn)行連接。
根據(jù)本發(fā)明，對于成功尤其重要的是添加使平均表達(dá)水平提高三倍至四倍的特異的ER滯留信號SEKDEL(Schuoten，A.等，植物分子生物學(xué)30(1996)，781-792)。其它在植物和動物蛋白中天然存在的定位于ER的滯留信號也可用于構(gòu)建此表達(dá)盒。
優(yōu)選的多腺苷酸化信號是植物多腺苷酸化信號，優(yōu)選的是與來自根瘤土壤桿菌的T-DNA邊緣序列多腺苷酸化信號一致的，尤其是Ti質(zhì)粒pTiACH5 T-DNA邊緣序列的基因3(章魚堿合酶)(Gielen等，歐洲分子生物學(xué)組織雜志3(1984)835，et seq.)或其功能類似物。
根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒可包含例如，組成型啟動子(優(yōu)選的是CaMV35S啟動子)、LeB4信號肽、將要表達(dá)的基因和ER滯留信號。參照單鏈抗體(scFv基因)，在圖2中以圖解形式表示了表達(dá)盒的構(gòu)建。將氨基酸序列KDEL(賴氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸)優(yōu)選地用作ER滯留信號。
將編碼有除草劑結(jié)合特性多肽的融合表達(dá)盒優(yōu)選地克隆至載體，例如適于轉(zhuǎn)化根瘤土壤桿菌的pBin19。用已知的方法用轉(zhuǎn)化了這樣載體的土壤桿菌轉(zhuǎn)化植物，尤其是農(nóng)作物，例如煙草，通過如將愈傷葉或葉部分浸沒在土壤桿菌溶液中，隨后在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)。用土壤桿菌轉(zhuǎn)化植物是已知的，特別是F.F.White，用于高等植物基因轉(zhuǎn)移的載體，轉(zhuǎn)基因植物，第1卷，工程和應(yīng)用，S.D.Kung和R.Wu編輯，Academic Press，1993，第15-38頁及S.B.Gelvin，從土壤桿菌至植物T-DNA邊緣序列轉(zhuǎn)移的分子遺傳學(xué)，轉(zhuǎn)基因植物，第49-78頁。可以已知的方式從愈傷葉或葉片部分轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植物，這些轉(zhuǎn)基因植物含有整合到根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒的表達(dá)有除草劑結(jié)合特性多肽的基因。
為了用編碼除草劑結(jié)合多肽的DNA轉(zhuǎn)化宿主植物，將根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒以插入整合到重組載體中，該載體DNA含額外的功能調(diào)節(jié)信號，例如用于復(fù)制或整合的序列。合適的載體尤其在“植物分子生物學(xué)方法和生物技術(shù)”(CRC Press)，(1993)第6/7章第71-119頁中得到描述。
利用上述的重組和克隆技術(shù)，可將根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒克隆至允許它們例如在大腸桿菌中擴(kuò)增的適當(dāng)?shù)妮d體中。適當(dāng)?shù)目寺≥d體特別是pBR332、pUC系列、M13mp系列和pACYC184。尤其合適的是能在大腸桿菌和土壤桿菌中復(fù)制的雙元載體，例如pBin19(Bevan等，(1980)，核酸研究12，8711)。
本發(fā)明另外涉及用根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物、植物細(xì)胞、植物組織或植物器官。使用的優(yōu)選目的是對植物酶抑制劑抗性的調(diào)節(jié)。
根據(jù)啟動子的選擇，表達(dá)可特異地發(fā)生在葉中、種子中或其它植物器官中。這樣的轉(zhuǎn)基因植物、其繁殖材料及其植物細(xì)胞、植物組織或植物器官是本發(fā)明另外的主題。
將外源基因轉(zhuǎn)入植物基因組稱為轉(zhuǎn)化。在此過程中，上述的轉(zhuǎn)化和從植物組織或植物細(xì)胞再生植物的方法用于瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。合適的方法有由聚乙二醇介導(dǎo)DNA攝入的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、用基因槍的biolistic[sic]方法、電穿孔、干胚在含DNA溶液中溫育、顯微注射和土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。提到的方法得到描述，如，B.Jenes等，基因轉(zhuǎn)移技術(shù)在轉(zhuǎn)基因植物，第1卷工程和應(yīng)用，編輯S.D.Kung和R.Wu.Academic Press(1993)128-143和在Potrykus，Annu，Rev.Plant.Physiol.Plant.Molec.Biol.42(1991)205-225)中。將要表達(dá)的構(gòu)建物優(yōu)選地克隆至適于轉(zhuǎn)化根瘤土壤桿菌的載體，例如pBin19(Bevan等，核酸研究，12(1984)8711)。
轉(zhuǎn)化了根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒的土壤桿菌可用已知的方法轉(zhuǎn)化植物，尤其是農(nóng)作物如谷物、玉米、大豆、水稻、棉花、甜菜、Canola、向日葵、亞麻、土豆、煙草、西紅柿、油菜、苜蓿、萵苣及各種樹、堅果和葡萄，例如通過將愈傷葉或葉部分浸沒在土壤桿菌溶液中，隨后在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)。
根據(jù)本發(fā)明，編碼除草劑結(jié)合多肽的功能上相當(dāng)?shù)男蛄腥匀挥邢Ｍ墓δ埽M管核苷酸序列不同。因此，功能類似物包括天然存在的此處所述序列的變異體及人工核苷酸序列如用化學(xué)合成得到的適合于植物密碼子使用的人工核苷酸序列。
具體地，功能類似物應(yīng)理解為最初分離的編碼除草劑結(jié)合特性多肽的自然或人工突變，此突變?nèi)员憩F(xiàn)出希望的功能。突變包括一個或多個核苷酸殘基的替代、添加、刪除、交換或插入。因此，本發(fā)明也包括通過修飾此核苷酸序列得到的核苷酸序列。這種修飾的目的可以是，例如，進(jìn)一步限制編碼序列中或其它的，例如，插入限制性酶的多個切割位點(diǎn)。
其它的功能類似物是與開始基因或基因片段相比，功能減弱或更強(qiáng)的那些變異體。
而且，只要能誘導(dǎo)如上所述的希望的除草劑抗性，人工DNA序列都適合。這樣的人工DNA序列可通過例如反翻譯有除草劑結(jié)合活性并通過分子塑形或體外選擇構(gòu)建的蛋白得到鑒定。特別適當(dāng)?shù)氖歉鶕?jù)宿主植物特異的密碼子應(yīng)用反翻譯多肽序列得到的DNA編碼序列。通過計算機(jī)輔助分析被轉(zhuǎn)化植物其它已知基因，熟悉植物遺傳學(xué)方法的專家很容易確定特定的密碼子使用。
另外必需提到的根據(jù)本發(fā)明適當(dāng)?shù)念愃坪怂嵝蛄惺蔷幋a融合蛋白的序列，其中融合蛋白部分是非植物來源的除草劑結(jié)合多肽或其功能上類似部分。例如，融合蛋白的第二部分可以是另外的有酶活性的多肽，或借其輔助可以檢測scFvs表達(dá)的抗原多肽序列(例如myc-tag或his-tag)。然而，它優(yōu)選的是調(diào)控蛋白序列，例如，指導(dǎo)有除草劑結(jié)合特性的多肽到達(dá)希望的作用位點(diǎn)的信號或轉(zhuǎn)運(yùn)肽。
然而，本發(fā)明也涉及根據(jù)本發(fā)明制備的表達(dá)產(chǎn)物和轉(zhuǎn)運(yùn)肽與有除草劑結(jié)合特性多肽的融合蛋白。
就本發(fā)明目的而言，抗性/耐受性指人工獲得的植物抵卸植物酶抑制劑作用的能力。它包括至少植物一代期間對抑制劑部分及尤其是完全的不敏感性。
除草劑最初的作用位點(diǎn)通常是葉組織，所以外源除草劑結(jié)合多肽葉特異性的表達(dá)能提供足夠的保護(hù)。然而，一個人很容易理解除草劑的作用不需限制在葉組織，也可以組織特異的方式在植物其它所有器官中實(shí)現(xiàn)。
另外，外源除草劑結(jié)合多肽的組成型表達(dá)是有優(yōu)勢的。另外，可誘導(dǎo)表達(dá)也可取。
例如，體外通過根分生組織在含有系列濃度梯度除草劑培養(yǎng)基中繁殖或通過種子發(fā)芽實(shí)驗確定轉(zhuǎn)基因表達(dá)的具除草劑結(jié)合特性表達(dá)多肽的效率。另外，可在溫室實(shí)驗中檢測類型和水平都改變了的受試植物的除草劑耐受性。
本發(fā)明另外涉及轉(zhuǎn)化了根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、組織、器官和這些植物的繁殖材料。特別優(yōu)選的是轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物如谷物、玉米、大豆、水稻、棉花、甜菜、Canola、向日葵、亞麻、土豆、煙草、西紅柿、油菜、苜蓿、萵苣和各種樹、堅果和葡萄。
可用抑制植物酶的活性成分處理轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞、植物組織或植物器官，由此未成功轉(zhuǎn)化的植物、植物細(xì)胞、植物組織或植物器官死亡。適當(dāng)?shù)幕钚猿煞值睦泳唧w是5-(2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基)-2-硝基苯甲酸(三氟羧草酸)和7-氯-3-甲基喹啉-8-羧酸(氯甲喹啉酸)及這些化合物的代謝物和功能衍生物。編碼具有除草劑結(jié)合特性多肽并插入根據(jù)本發(fā)明表達(dá)盒的DNA也可用作選擇標(biāo)記。
本發(fā)明的優(yōu)勢，特別是就農(nóng)作物而言，一旦誘導(dǎo)了農(nóng)作物對植物酶抑制劑的抗性，該抑制劑可用作無抗性植物特異的除草劑。b1-641群體中的除蟲劑化合物作為這樣抑制劑的例子，而不是限制b1 1，3，4-噻二唑buthidazole，cyprazoleb2酰胺二丙烯草胺(CDAA)、新燕靈、溴丁酰草胺、氯硫酰草胺、哌草丹、二甲吩草胺、雙苯酰草胺、etobenzanid(benzchlomet)、麥草氟甲酯、fosamin、isoxaben、庚酰草胺、萘草胺、pronamid(炔苯酰胺)、敵稗b3 氨基磷酸bilanafos、(雙丙氨膦)、buminafos、草銨膦、草甘膦、草硫膦b4 氨基三唑氨基三唑b5 Anillides莎稗磷、苯噻酰草胺b6 Aryloxyalkanoic acids2，4-滴、2，4-滴丁酸、氯甲酰草胺、2，4-滴丙酸、精2，4-滴丙酸、精2，4-滴丙酸(2，4-DP-P)、fenoprop(2，4，5-TP)、氯氟吡氧乙酸、2甲4氯、2甲4氯丁酸、2甲4氯丙酸、精2甲4氯丙酸、敵草胺、萘丙胺、三氯吡氧乙酸b7 苯甲酸草滅畏、麥草畏b8 Benzothiadiazinonesbentazoneb9 漂白劑異惡草松(dimethazone)、吡氟酰草胺、氟咯草酮、氟胺草唑、氟啶草酮、吡唑特、磺草酮(chlormesulone)b10 氨基甲酸磺草靈、燕麥靈、丁草敵、雙酰草胺、氯炔靈、氯苯胺靈、環(huán)草敵、甜菜安、燕麥敵、茵草敵、戊草丹、禾草敵、坪草丹、克草敵、棉胺寧、甜菜寧、苯胺靈、芐草丹、稗草丹、菜草畏(CDEC)、特草靈、禾草丹(benthiocarb)、仲草丹、野麥畏、滅草敵b11 喹啉[lacuna]酸二氯喹啉酸、氯甲喹啉酸b12 Chloroacetanilides
乙草胺、甲草胺、丁草胺、丁烯草胺、乙酰甲草胺、二甲草胺、吡唑草胺、異丙甲草胺、丙草胺、毒草胺、丙炔草胺、特丁草胺、噻吩草胺、二甲苯草胺。b13 環(huán)己烯酮禾草滅、Caloxydim、烯草酮、cloproxydim、噻草酮、稀禾啶、三甲苯草酮、2-{1-[2-(4-氯苯氧基)丙氧亞氨基]丁基}-3-羥基-5-(2H-四羥硫代吡喃-3-基)-2-環(huán)己烯-1-酮b14 二氯丙酸茅草枯b15 二氫苯比呋喃乙氧呋草黃b16 二氫呋喃-3-酮呋草酮b17 二硝基苯胺benefin、仲丁靈、dinitramin、乙丁烯氟靈、氯乙氟靈、異丙樂靈、甲磺樂靈、氨磺樂靈、二甲戊靈、氨基丙氟靈、環(huán)丙氟靈、氟樂靈b18 二硝基苯酚溴酚肟、地樂酚、地樂酯、特樂酚、DNOCb19 二苯基醚三氟羧草醚、苯草醚、甲羧除草醚、草枯醚(CNP)、枯莠隆、醚菊酯、三氟硝草醚、乙羧氟草醚、氟磺胺草醚、呋氧草醚、乳氟禾草靈、除草醚、nitrofluorfen、乙氧氟草醚b20 雙啶啶cyperquat difenzoquat-methylsulfate、敵草快、paraquatdichloridb21 脲苯噻隆、炔草隆、氯溴隆、枯草隆、chlortoluron、cumyluron、dibenzyluron、環(huán)莠隆、惡唑隆、敵草隆、殺草隆、磺噻隆、非草隆、氟草隆、isoprotuion、異惡隆、特胺靈、利谷隆、甲基苯噻隆、吡喃隆、綠谷隆、滅草隆、草不隆、環(huán)草隆、丁噻隆、trimeturonb22 咪唑丁咪酰胺b23 咪唑酮imazamethapyr、咪唑煙酸、咪唑喹啉酸、imazethabenz-methyl(imazame)、咪唑乙煙酸b24 Oxadiazoles滅草唑、oxadiargyl、惡草酮b25 環(huán)氧乙烷滅草環(huán)b26 酚溴苯腈、碘苯腈b27 苯氧丙酯炔草酸、氰氟草酯、禾草靈、惡唑禾草靈、精惡唑禾草靈、噻唑禾草靈、吡氟禾草靈、精吡氟禾草靈、氟吡乙禾靈(haloxyfop-ethoxyethyl)、氟吡甲禾靈、精氟吡甲禾靈、異惡草醚、惡草酸、喹禾靈、精喹禾靈、喹禾糖酯b28 苯乙酸Chlorfenac(fenac)b29 苯丙酸Chlorophenprop-Methylb30 原卟啉IX氧化酶抑制劑吡草酮、cinidon-ethyl、氟烯草酸、丙炔氟草胺、flumipropyn、flupropacil、fluthiacet-methyl、芐草唑、甲磺草胺、thidiaziminb31 吡唑氟氯草胺b32 Pyridazines氯草敏、抑芽丹、氟草敏、噠草特b33 吡啶羧酸二氯吡啶酸、氟硫草定、氨氯吡啶酸、噻唑煙酸b34 Pyrimidyl ethers嘧草硫酸、嘧草硫醚、雙草醚、嘧草醚b35 磺胺唑嘧磺草胺、磺草唑胺b36 磺酰脲酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、芐嘧磺隆、氯嘧磺隆、醚黃隆、環(huán)丙嘧磺隆、胺苯磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氯嘧啶磺隆、唑吡嘧磺隆、甲磺隆、煙嘧磺隆、氟嘧磺隆氟磺隆、吡嘧磺隆、砜嘧磺隆、甲嘧磺隆、噻吩磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、氟胺磺隆b37 三嗪莠滅凈、莠去津、aziprotryn、氰草津、環(huán)丙津、敵草凈、異戊乙凈、異丙凈、eglinazine-ethyl、環(huán)嗪酮、環(huán)丙青津、撲滅通、撲草凈、撲滅津、密草通、西瑪津、西草凈、特丁通、特丁凈、特丁津、草達(dá)津b38 三嗪酮乙嗪草酮、苯嗪草酮、嗪草酮b39 三唑羧酰胺triazofenamidb40 尿嘧啶除草定、環(huán)草啶、特草定b41 其它草除靈、呋草黃、地散磷、benzofluor、抑草磷、苯酮唑、氯酞酸(DCPA)、環(huán)庚草醚、敵草腈、茵多酸、flurobentranil、氯磺酰草胺、黃草伏、哌草磷植物酶抑制劑的功能上相當(dāng)?shù)难苌镒饔梅秶c單獨(dú)命名物質(zhì)的作用范圍相當(dāng)，而抑制活性(例如，表示為完全抑制非抗性植物的生長每公頃栽培物抑制劑的克數(shù))更低，相同或更高。
通過下列例子說明而不是限制本發(fā)明一般克隆方法在本發(fā)明范圍內(nèi)執(zhí)行的步驟例如限制性切割、瓊脂糖凝膠電泳、DNA片段的純化、將核酸轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素和尼龍膜、DNA片段的連接、大腸桿菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)菌培養(yǎng)、噬菌體操作和重組DNA序列分析根據(jù)Sambrook等(1989)冷泉港實(shí)驗室出版社，ISBN 0-87969-309-6描述的進(jìn)行。
下文所用的細(xì)菌菌株(大腸桿菌XL-I Blue)來自Stratagene。用于植物轉(zhuǎn)化的土壤桿菌菌株(根瘤土壤桿菌。含質(zhì)粒pGV2260或pGV3850Kan的C58C1)由Deblaere等描述(核酸研究13(1985)4777)。選擇性地，可用土壤桿菌株LBA4404(clontech)或其它合適的株系。載體pUC19(Yanish-Perron，基因33(1985)103-119)、pBluscript.SK-(Stratagene)、pGEM-T(Promega)、pZero(Invitrogen)、pBin19(Bevan等，核酸研究12(1984)8711-8720)和pBinAR(Hofgen和Willmitzer，植物科學(xué)66(1990)221-230)用于克隆目的。重組DNA的序列分析以Sanger方法(Sanger等，美國國家科學(xué)院院報74(1977)，5463-5467)，用pharmacia公司的激光熒光DNA測序裝置測定重組DNA分子的序列。植物表達(dá)盒的制備以EcoRI-KpnI片段(相當(dāng)于花椰菜花葉病毒的核苷酸6909-7437)(Franck等，細(xì)胞21(1980)285)的形式將35S CaMV啟動子插入質(zhì)粒pBin19(Bevan等，核酸研究12，8711(1984))。Ti質(zhì)粒pTiACH5(Gielen等，歐洲分子生物學(xué)組織雜志3(1984)835)T-DNA邊緣序列的基因3的多腺苷酸化信號；核苷酸11749-11939以PvuII-HindIII片段分離到，加上SphI接頭后；克隆到載體的SphI-HindIII切割位點(diǎn)之間的PvuII位點(diǎn)。產(chǎn)生了質(zhì)粒pBinAR(Hofgen和Willmitzer，植物科學(xué)66(1990)221-230)。應(yīng)用實(shí)施例實(shí)施例1因為除草劑無免疫原性，它們必需與載體材料偶聯(lián)，例如KLH。如果分子有反應(yīng)基，則可直接偶聯(lián)；如果沒有，在合成除草劑時引入功能基或在合成過程中選擇反應(yīng)前體以在簡單的反應(yīng)步驟將這些分子偶聯(lián)到載體分子上。在Miroslavic Ferencik的“免疫化學(xué)手冊”，1993，Chapman & Hall，抗原一章第20-49頁發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)反應(yīng)的例子。
反復(fù)注射此修飾的載體分子(抗原)用于免疫，例如，Balb/c小鼠。一旦用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)檢測到足夠量的與抗原結(jié)合的抗體，就取出這些動物的脾細(xì)胞并與骨髓瘤細(xì)胞融合以培養(yǎng)雜種。另外用“除草劑修飾的BSA”作為ELISA中的抗原以區(qū)分針對半抗原的免疫反應(yīng)和針對KLH的免疫反應(yīng)。
用與已知方法相似的方法制備單克隆抗體，例如在“實(shí)用免疫學(xué)”Leslie Hudson和Frank Hay，Blackwell Scientific Publications，1989或在“單克隆抗體理論和實(shí)踐”James Goding，1983，AcademicPress，Inc，或在“單克隆抗體實(shí)用指南”，J.Liddell和A.Cryer，1991 John Wiley & Sons；或Achim Moller和Franz Emling″Monoklonale Antikorper gegen TNF und deven Verwendung″[針對TNF的單克隆抗體及其應(yīng)用]所述的方法。歐洲專利說明書EP-A260610。實(shí)施例2本研究的起始點(diǎn)是特異性地識別除草劑氯甲喹啉酸且有高親和性的單克隆抗體。所選的雜交瘤細(xì)胞系的特征在于分泌的針對除草劑抗原氯甲喹啉酸的單克隆抗體有高親和性并且可得到此免疫球蛋白的特異序列(Berek，C.等，自然316，(1985)412-418)。該針對氯甲喹啉酸的單克隆抗體是單鏈抗體片段(scFv-抗氯甲喹啉酸)構(gòu)建的起始點(diǎn)。
首先，從雜交瘤細(xì)胞中分離mRNA并轉(zhuǎn)錄成cDNA。此cDNA作為擴(kuò)增可變免疫球蛋白基因VH和VK的模板，其中重鏈的特異性引物為VH1BACK和VH FOR-2，輕鏈引物為VK2BACK和MJK5 FONX(Clackson等，自然352，(1991)624-628。分離的可變免疫球蛋白是單鏈抗體片段(scFv-抗氯甲喹啉酸)構(gòu)建的起始點(diǎn)。在隨后的融合PCR中，三個成分VH、VK和接頭片段在PCR反應(yīng)中聯(lián)合起來，從而ScFv-抗氯甲喹啉酸得到擴(kuò)增(圖3)。
在細(xì)菌體系中表達(dá)后對構(gòu)建的scFv-抗氯甲喹啉酸基因進(jìn)行功能鑒定(抗原結(jié)合活性)。為了達(dá)到這個目的，用Hoogenboom，H.R.等核酸研究19(1991)，4133-4137的方法，在大腸桿菌中以可溶抗體片段合成scFv-抗氯甲喹啉酸。以ELISA測定檢測構(gòu)建的抗體片段的活性和特異性(圖4)。
為了允許抗體片段在煙草中種子特異性表達(dá)，將scFv-抗氯甲喹啉酸基因克隆在LeB4啟動子的下游。從Vicia fqba中分離的LeB4啟動子表現(xiàn)出多種外源基因在煙草中嚴(yán)格的種子特異性表達(dá)(Baumlein，H.等，Mol.Gen.Genet.225，(1991)121-128)。scFv-抗氯甲喹啉酸多肽轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)導(dǎo)致大量抗體片段的穩(wěn)定積累。為了達(dá)到這個目的，scFv抗氯甲喹啉酸基因與信號肽序列融合以保證其進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，與ER滯留信號SEKDEL融合以保證多肽保留在ER中(Wandelt等，1992)(圖5)。
將構(gòu)建的表達(dá)盒克隆至雙元載體pGSGLUC1(Saito等，1990)并通過電穿孔轉(zhuǎn)移至土壤桿菌株系EHA101中。重組土壤桿菌克隆用于隨后的煙草轉(zhuǎn)化。每個構(gòu)建體再生出70-140株煙草。自花傳粉后，從再生的轉(zhuǎn)基因煙草植物上收獲不同發(fā)育階段的種子。抽提后從這些種子中獲得處于水緩沖體系中的可溶性蛋白。分析轉(zhuǎn)基因植物表明scFv-抗氯甲喹啉酸基因與ER滯留信號SEKDEL的融合允許成熟種子中得到的scFv-抗氯甲喹啉蛋白最大積累為1.9％。
構(gòu)建的scFv-抗氯甲喹啉酸基因大小約為735bp。可變結(jié)構(gòu)域以VH-L-VL順序彼此融合。
用直接ELISA鑒定成熟煙草種子抽提物中特異的選擇性。得到的值清楚地表明蛋白抽提物含功能上有活性的抗體片段。實(shí)施例3
在USP啟動子控制下，單鏈抗體片段在轉(zhuǎn)基因煙草種子細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中種子特異性表達(dá)和積聚。
此研究的起始點(diǎn)是針對除草劑氯甲喹啉酸的單鏈抗體片段(scFv-抗氯甲喹啉酸)。在細(xì)菌體系中表達(dá)后和在煙草葉子中表達(dá)后進(jìn)行該構(gòu)建的scFv-抗氯甲喹啉酸基因的功能鑒定(抗原結(jié)合活性)。用ELISA測定檢測構(gòu)建的抗體片段的活性和特異性。
為了允許抗體片段在煙草中種子特異性表達(dá)，將scFv-抗氯甲喹啉酸基因克隆在USP啟動子的下游。從Vicia faba中分離的USP啟動子表現(xiàn)出多種外源基因在煙草中嚴(yán)格的種子特異性表達(dá)(Fiedler，U.等，植物分子生物學(xué)22，(1993)669-679)。scFv-抗氯甲喹啉酸多肽轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)導(dǎo)致大量抗體片段的穩(wěn)定積累。為了達(dá)到這個目的，scFv-抗氯甲喹啉酸基因與信號肽序列融合以保證其進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，與ER滯留信號SEKDEL融合以保證多肽保留在ER中(Wandelt等，1992)(圖1)。
將構(gòu)建的表達(dá)盒克隆至雙元載體pGSGLUC1(Saito等，1990)并通過電穿孔轉(zhuǎn)移至土壤桿菌株系EHA101中。重組土壤桿菌克隆用于隨后的煙草轉(zhuǎn)化。自花傳粉后，從再生的轉(zhuǎn)基因煙草植物上收獲不同發(fā)育階段的種子。抽提后從這些種子中獲得處于水緩沖體系中的可溶性蛋白。分析轉(zhuǎn)基因植物表明scFv-抗三氟羧草醚[sic]基因與ER滯留信號SEKDEL的融合在USP啟動子的控制下導(dǎo)致與氯甲喹啉酸有結(jié)合親和性的單鏈抗體片段早在種子發(fā)育的第10天就合成了。實(shí)施例4為了得到抗體片段在植物中的廣泛表達(dá)，尤其是在葉中，將scFv-抗氯甲喹啉酸基因克隆在CaMV35S啟動子下游。該強(qiáng)組成型啟動子介導(dǎo)外源基因在所有植物組織中的表達(dá)(Benfey和Chaua，科學(xué)250(1990)，956-966。scFv-抗氯甲喹啉酸蛋白到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)允許要得到的大量抗體片段穩(wěn)定積累在葉中。首先，將scFv-抗氯甲喹啉酸基因與保證進(jìn)入內(nèi)質(zhì)肉的信號肽序列和保證產(chǎn)物保留在ER中的ER滯留信號KDEL融合(Wandelt等，植物雜志2(1992)，181-192)。將構(gòu)建的表達(dá)盒克隆至雙元載體pGSGLUC1(Saito等，植物細(xì)胞繁殖8(1990)，718-721)并通過電穿孔轉(zhuǎn)移入土壤桿菌菌株EHA101。重組土壤桿菌克隆用于隨后的煙草轉(zhuǎn)化。再生出約100株煙草植株。從再生的轉(zhuǎn)基因煙草植株上取下處于不同發(fā)育階段的葉。抽提后從這些種子中獲得處于水緩沖體系中的可溶性蛋白。隨后的分析(Western印跡分析和ELISA測定)表明從葉中獲得的有生物學(xué)活性的抗原結(jié)合scFv-抗氯甲喹啉多肽最大積累為2％以上。在完全生長的綠色葉中鑒定了高表達(dá)值，但是在衰老葉材料中也檢測到了抗體片段。實(shí)施例5借助于合成的寡核苷酸，編碼針對三氟羧草醚和氯甲喹啉酸的單鏈抗體的cDNA片段得到PCR擴(kuò)增。
單鏈抗體cDNA的PCR擴(kuò)增在Perkin Elmer公司的DNA熱循環(huán)儀上進(jìn)行。反應(yīng)混合物含8ng/μl單鏈模板cDNA、0.5μM相關(guān)寡核苷酸、200μM核苷酸(pharmacia)、50mM KCl、10mM Tris-Hcl(25℃時pH8.3，1.5mM Mgcl2)及0.02μ/nl Taq聚合酶(Perkin Elmer)。反應(yīng)條件設(shè)置如下退火溫度45℃變性溫度94℃延伸溫度72℃循環(huán)數(shù) 40結(jié)果得到約735個堿基對的片段，并將它連接到載體pBluescript中。連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-I Blue，質(zhì)粒得到擴(kuò)增。關(guān)于聚合酶鏈反應(yīng)的應(yīng)用和最優(yōu)化，參見Innis等，1990，PCR方法，方法和應(yīng)用指南，Academic Press。實(shí)施例6表達(dá)編碼有除草劑結(jié)合特性的單鏈抗體cDNA的轉(zhuǎn)基因煙草的制備將質(zhì)粒pGSGLUC1轉(zhuǎn)化到根瘤土壤桿菌C58C1pGV2260中。用在含2％蔗糖的Murashige-Skoog培養(yǎng)基(2MS培養(yǎng)基)中培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化陽性的土壤桿菌克隆的過夜培養(yǎng)物1∶50稀釋液轉(zhuǎn)化煙草植株(煙草栽培品種Samsun NN)。在培養(yǎng)皿中，無菌植物的葉片(每個約1cm2)在1∶50土壤桿菌稀釋液中溫育5-10分鐘。然后在含0.8％Bacto-Agar的2MS培養(yǎng)基上避光培養(yǎng)2天。在16小時光照/8小時黑暗下繼續(xù)培養(yǎng)2天后，在含500mg/l頭孢噻肟(cefotaxim-Sodium)、500mg/l卡那霉素、1mg/l芐氨基嘌呤(BAP)、0.2mg/l萘乙酸和1.6g/l葡萄糖的MS培養(yǎng)基上以每周節(jié)律繼續(xù)培養(yǎng)。將生長的枝條轉(zhuǎn)移至含2％蔗糖、250mg/l頭孢噻肟和0.8％Bacto-Agar的MS培養(yǎng)基上。實(shí)施例7針對除草劑氯甲喹啉酸的單鏈抗體片段在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的穩(wěn)定積累本研究的起始點(diǎn)是在煙草植物中表達(dá)的針對除草劑氯甲喹啉酸的單鏈抗體(scFv-抗氯甲喹啉酸。用Western印跡分析和ELISA測定鑒定合成的scFv-抗氯甲喹啉酸多肽的數(shù)量和活性。
要表達(dá)的外源基因與LeB4信號肽(N-末端)和ER滯留信號KDEL(C-末端)以翻譯融合的形式在CaMV35S啟動子的控制下表達(dá)使scFv-抗氯甲喹啉酸基因有可能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中表達(dá)。scFv-抗氯甲喹啉酸多肽向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的轉(zhuǎn)運(yùn)允許大量的活性抗體片段穩(wěn)定積累。收獲葉材料后，將其凍存于-20℃(1)、凍干(2)或在溫室下干燥(3)。從待檢葉片中通過抽提獲得處于水緩沖液中的可溶性蛋白并以親合層析純化scFv-抗氯甲喹啉酸多肽。等量的純化的scFv-抗氯甲喹啉酸多肽(凍的、凍干的和干燥的)用于鑒定抗體片段的活性(圖6)。圖6A表示來自新鮮(1)、凍干(2)和干燥(3)葉片的scFv-抗氯甲喹啉酸多肽的抗原結(jié)合活性。圖6B表示由Western印跡分析鑒定的用于ELISA測定的分別的scFv-抗氯甲喹啉酸蛋白的量(約100ng)。左側(cè)表示了蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)的大小。發(fā)現(xiàn)抗原結(jié)合活性基本相同。實(shí)施例8為了驗證產(chǎn)生有除草劑結(jié)合特性多肽的轉(zhuǎn)基因煙草植物的除草劑耐受性，用各種量的三氟羧草醚和氯甲喹啉酸處理這些煙草植物。在溫室中，所有實(shí)驗都證明與對照相比，分別表達(dá)scFv-抗三氟羧草醚[lacuna]和scFv-抗氯甲喹啉酸[lacuna]的植物表現(xiàn)出對待檢除草劑的[lacuna]耐受性。
權(quán)利要求
1.一種通過在植物中表達(dá)外源除草劑結(jié)合多肽制備除草劑耐受性植物的方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中外源除草劑結(jié)合多肽是單鏈抗體片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中外源除草劑結(jié)合多肽是完全抗體或其片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中除草劑是5-(2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基)-2-硝基苯甲酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中除草劑是7-氯-3-甲基喹啉-8-羧酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項所述的方法，其中植物是單或雙子葉植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中植物是煙草。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項所述的方法，其中外源多肽在植物中組成型表達(dá)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項所述的方法，其中誘導(dǎo)外源多肽在植物中的表達(dá)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項所述的方法，其中外源多肽在植物葉中表達(dá)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項所述的方法，其中外源多肽在植物種子中表達(dá)。
12.一種植物表達(dá)盒，由啟動子、信號肽、編碼外源殺真菌劑結(jié)合多肽的基因、ER滯留信號和終止子組成。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的表達(dá)盒，其中所用的組成型啟動子是CaMV35S啟動子。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的表達(dá)盒，其中要表達(dá)的基因是單鏈抗體片段的基因。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的表達(dá)盒，其中以與其它功能蛋白如酶、毒素、生色團(tuán)和結(jié)合蛋白翻譯融合形式使用的除草劑結(jié)合多肽的基因或基因片段是要表達(dá)的基因。
16.根據(jù)權(quán)利要求12所述的表達(dá)盒，其中要表達(dá)的多肽基因從雜交瘤細(xì)胞或借助其它重組方法如抗體噬菌體展示方法獲得。
17.根據(jù)權(quán)利要求12所述的表達(dá)盒的用途，用于雙子葉或單子葉植物的轉(zhuǎn)化使植物種子或葉特異性地組成型表達(dá)外源除草劑結(jié)合多肽。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的用途，其中將表達(dá)盒轉(zhuǎn)入細(xì)菌菌株并將所得的重組克隆用于轉(zhuǎn)化雙子葉或單子葉植物使植物種子或葉特異性地組成型表達(dá)外源殺真菌劑結(jié)合多肽。
19.根據(jù)權(quán)利要求12所述的表達(dá)盒的用途，用作選擇標(biāo)記。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19獲得的轉(zhuǎn)化植物的用途，用于制備除草劑結(jié)合多肽。
21.一種通過將編碼除草劑結(jié)合多肽的基因序列導(dǎo)入植物細(xì)胞、愈傷組織、完整植物和植物細(xì)胞原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化植物的方法。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中轉(zhuǎn)化借助土壤桿菌、具體地根瘤土壤桿菌進(jìn)行。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中轉(zhuǎn)化借助電穿孔進(jìn)行。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中轉(zhuǎn)化借助微粒轟擊方法進(jìn)行。
25.除草劑結(jié)合多肽的生產(chǎn)方法，通過在植物或植物細(xì)胞中表達(dá)編碼這樣的多肽的基因，然后分離多肽。
26.含有根據(jù)權(quán)利要求12所述的表達(dá)盒的植物，其中的表達(dá)盒賦予除草劑耐受性。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的植物，對5-(2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基)-2-硝基苯甲酸有耐受性。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的植物，對7-氯-3-甲基喹啉-8-羧酸有耐受性。
29.一種在轉(zhuǎn)基因除草劑抗性農(nóng)作物中控制不需要的生長的方法，包括針對形成除草劑結(jié)合多肽或抗體的農(nóng)作物使用除草劑。
30.對5-(2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基)-2-硝基苯甲酸有高結(jié)合親和性的除草劑結(jié)合多肽或抗體，其中除草劑結(jié)合多肽或抗體按照權(quán)利要求25所述的得到制備。
31.對7-氯-3-甲基喹啉-8-羧酸有高結(jié)合親和性的除草劑結(jié)合多肽或抗體，其中除草劑結(jié)合多肽或抗體按照權(quán)利要求25所述的得到制備。
全文摘要
本發(fā)明公開的是通過在植物中表達(dá)除草劑結(jié)合抗體制備除草劑耐受性植物的方法。
文檔編號C12N15/82GK1253593SQ98804539
公開日2000年5月17日 申請日期1998年3月24日 優(yōu)先權(quán)日1997年3月25日
發(fā)明者J·勒赫爾, A·莫勒, R－M·施密德, H·施弗爾, U·拉伯, U·康拉德 申請人:巴斯福股份公司