本發明涉及5-醛基胞嘧啶的標記
技術領域：
，特別是涉及5-醛基胞嘧啶的標記方法及其在單堿基分辨率測序中的應用。
背景技術：
：dna甲基化與去甲基化研究是表觀遺傳學領域最為重要的研究內容之一。基因調控區的甲基化與去甲基化調控關系到下游基因的表達激活與抑制，從而參與相應的生物學過程。在哺乳動物中，dna的甲基化主要發生在胞嘧啶的5號位上形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mc)。5mc的去甲基化過程是通過tet(ten-eleventranslocation)家族蛋白的氧化完成的：5mc被氧化逐步產生5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5hmc)、5-醛基胞嘧啶(5-formylcytosine，5fc)和5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine，5cac)，并通過堿基切除修復通路切除5fc及5cac實現dna的去甲基化過程(mamtatahiliani,etal.,science,2009,324:931-935；skirmantaskriaucionisandnathanielheintz,science,2009,324:929-930；tonipfaffeneder,etal.,angewandtechemieinternationaledition,2011,123:7146–7150；shinsukeito,etal.,science,2011,333:1300-1303；yufeihe,etal.,science,2011,333:1303-1307)。為了研究這一類表觀遺傳修飾堿基的生物學功能，了解其在基因組中的分布區域和具體序列信息是重要前提。成熟的dna甲基化分析方法有亞硫酸氫鈉測序方法(bisulfitesequencing)，可以鑒定出單堿基分辨率的5mc序列信息。通過亞硫酸氫鈉的處理，基因組中的普通的胞嘧啶c轉變為尿嘧啶u，通過聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction,pcr)擴增并測序讀取為胸腺嘧啶t；而5mc由于5號位供電子效應的甲基存在，使得亞硫酸氫鈉處理過程難以發生脫氨基化轉變，因而在pcr擴增和測序過程中仍舊讀取c(michaelj.booth,etal.,science,2012,336:934-937.)。在dna的甲基化之外，5hmc、5fc及5cac作為能穩定存在于基因組中的修飾堿基，也可能存在特有的生物學功能，因此確定這三種胞嘧啶衍生物在基因組中的分布信息對于探索其功能至關重要。但5hmc、5fc及5cac的發現使得亞硫酸氫鈉測序變得更為復雜。如在正常亞硫酸氫鈉測序過程中，5hmc會對亞硫酸氫鹽處理有抵抗力，因此會被讀取為c，而5fc和5cac均讀取為t(michaelj.booth,etal.,science,2012,336:934-937)。為了區分這些胞嘧啶衍生物，需要發展新的單堿基分辨率測序技術來鑒定這些新修飾堿基在基因組中的位置。目前已有一些針對5-醛基胞嘧啶相關化學反應的研究，這些研究主要著眼于5fc胞嘧啶環上5號位醛基。基于醛基能夠與羥胺化合物的氨基反應生成肟，研究人員設計了針對5fc醛基的反應(shinsukeito,etal.,science,2011,333:1300-1303；eun-angraiber,etal.,genomebiology,2012,13:r69；chunxiaosong,etal.,cell,2013,153:678–691)，并將其應用于檢測基因組中5fc的位置；利用醛基與氨基的反應發展了熒光基團標記5fc的方法(jianlinhu,etal.,chemistry-aeuropeanjournal,2013,19:5836-5840)；利用nabh4將醛基還原為羥甲基從而使5fc還原為5hmc，并在亞硫酸氫鈉測序過程中5fc位點轉變讀取為c，也可在特定區域鑒定出5fc堿基的位置(chunxiaosong,etal.,cell,2013,153:678–691；michaelj.booth,etal.,naturechemistry,2014,6:435-440)。遺憾的是，這些方法都不適用于單細胞基因組中5fc的檢測。因此，需要發展一種新的高生物兼容性、高靈敏度的單細胞水平的5fc標記和檢測方法，這對進一步推進dna主動去甲基化的研究具有關鍵作用，同時對于表觀遺傳在臨床檢測和疾病診療方面的研究(例如胚胎、癌細胞等)也具有重要意義。目前在單細胞水平上進行對dna表觀遺傳學修飾的測序技術主要集中于5mc及5hmc。單細胞5mc測序技術基于亞硫酸氫鈉處理(hongshanguo,etal.,genomeresearch,2013；sebastienasmallwood,etal.,naturemethods,2014；matthiasfarlik,etal.,cellreports,2015)。通過對亞硫酸氫鈉處理與建庫流程進行優化，可以穩定檢測到約18％的cpg位點(sebastienasmallwood,etal.,naturemethods,2014)。因為單細胞基因組中5fc的含量相比5mc非常低，且亞硫酸氫鈉處理會對dna造成較大的損傷，導致大量dna降解，所以基于亞硫酸氫鈉處理的測序技術并不適合單細胞基因組中5fc的測定；因此，尋找一種適用于單細胞基因組中5fc的測序方法是本領域亟待解決的問題。技術實現要素：本發明實施例的目的在于提供一種5-醛基胞嘧啶的標記方法及其在單堿基分辨率測序中的應用，以實現單細胞水平、單堿基分辨率地對dna或rna中的5-醛基胞嘧啶的檢測；具體技術方案如下：本發明提供了一種5-醛基胞嘧啶的標記方法，其包括以下步驟：(1)準備dna或rna樣品；(2)將dna或rna樣品與緩沖溶液、化合物r1-ch2-cn混合，得到標記反應體系；并使其中的化合物r1-ch2-cn與dna或rna分子中的5-醛基胞嘧啶反應，從而實現5-醛基胞嘧啶的標記；反應過程如下：其中，r1為緊鄰著ch2基團的吸電子基團，優選為-cn、更優選為-cn；r為與5-醛基胞嘧啶連接的dna或rna分子：所述標記反應體系的ph值為7.5-9。一種優選實施方式中，其中所述標記反應體系的ph值為8-9，優選為8。一種優選實施方式中，其中化合物r1-ch2-cn在所述標記反應體系中的濃度為75-1500mm,優選為75-1000mm，更優選為75-500mm，最優選為150mm。一種優選實施方式中，其中在步驟(2)中，反應條件為：20℃-60℃，優選為30℃-40℃，更優選為37℃下反應12-48小時，優選18-30小時，更優選為20小時。本發明還提供了一種5-醛基胞嘧啶的單堿基分辨率的測序方法，其中，該方法包括以下步驟：(ⅰ)按前述的方法標記dna或rna樣品；(ⅱ)將反應完成后的標記反應體系擴增及測序，得到標記后測序結果；(ⅲ)將標記后的測序結果與dna或rna參照序列圖譜進行對比，若序列中同一位置的堿基在參照序列圖譜中讀取為胞嘧啶，在標記后讀取為胸腺嘧啶，則確定該位置的堿基為5-醛基胞嘧啶。一種優選實施方式中，其中所述dna或rna樣品是痕量樣品或從單細胞獲得的樣品，所述單細胞來源于胚胎干細胞、配子、早期胚胎、癌細胞、神經細胞或血細胞等。一種優選實施方式中，其中步驟(ii)中反應完成后的標記反應體系不經過純化直接進行擴增。一種優選實施方式中，其中擴增的方法采用malbac或scrrbs擴增方法。本發明還提供了一種dna或rna的擴增體系，其包含前述步驟(ii)中反應完成后的標記反應體系。本發明還提供了一種5-醛基胞嘧啶的單堿基分辨率測序用試劑盒，其包括ph值為7.5-9的緩沖溶液、丙二腈和擴增相關試劑。本發明還提供了一種5-醛基胞嘧啶的定量檢測方法，其包括以下步驟：(a)將n個已知的5-醛基胞嘧啶含量不同的模式序列按照前述的測序方法測序并確定c-t轉換比例，其中n≥2；所述c-t轉換比例為序列中同一位置的堿基標記前讀取為胞嘧啶c，標記后讀取為胸腺嘧啶t的比例；(b)以5-醛基胞嘧啶含量為橫/縱坐標，以c-t轉換比例為縱/橫坐標繪制標準曲線；(c)按照前述的測序方法對5-醛基胞嘧啶含量未知的dna或rna測序，并確定c-t轉換比例；(d)根據步驟(c)中確定的c-t轉換比例及步驟(b)中的標準曲線確定5-醛基胞嘧啶含量未知的dna或rna中的5-醛基胞嘧啶含量。本發明利用化合物r1-ch2-cn與5-醛基胞嘧啶的特異性化學反應，實現單細胞、單堿基分辨率的5-醛基胞嘧啶標記。進一步地，利用本發明提供的標記方法，可以對dna或rna樣品中的5-醛基胞嘧啶進行測序分析，確定5-醛基胞嘧啶的序列分布信息。由于標記過程中不進行亞硫酸氫鈉處理，不會造成dna或rna的損傷；而且丙二腈的處理也不會使得dna或rna降解；進一步地，發明人意外地發現，在對dna或rna中的5-醛基胞嘧啶進行測序分析過程中，反應完成后的標記反應體系可以不經過純化直接進行擴增，減少了dna的損失；因此本發明提供的5-醛基胞嘧啶測序分析方法可以在單細胞水平上進行，并實現單堿基分辨率水平的測序；使其更適用于多種痕量樣品及珍貴生物學樣品，例如胚胎干細胞、配子或早期胚胎、癌細胞、神經細胞等。附圖說明為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。圖1為實施例1中用丙二腈與6種含不同胞嘧啶的9堿基dna序列反應前后的質譜結果圖，其中，經丙二腈(malononitrile，m)標記的5fc簡稱為5fc-m。圖2a為實施例2中利用丙二腈標記5-醛基胞嘧啶的結果；圖2b為實施例3-12中利用丙二腈標記5-醛基胞嘧啶的結果；圖2c為對比例1-4中利用丙二腈標記5-醛基胞嘧啶的結果，圖2d為實施例13中利用3-氧代丁腈標記5-醛基胞嘧啶的結果。圖3為實施例16中未經純化與經純化的丙二腈標記后的反應體系的擴增產物比較結果。圖4a及圖4b為實施例17中丙二腈標記反應不會降解dna的驗證結果。圖5為實施例18、19的部分測序對比結果。圖6為實施例20繪制的標準曲線。具體實施方式本發明首先提供了一種5-醛基胞嘧啶的標記方法，其包括以下步驟：(1)準備dna或rna樣品；(2)將dna或rna樣品與緩沖溶液、化合物r1-ch2-cn混合，得到標記反應體系；并使其中的化合物r1-ch2-cn與dna或rna分子中的5-醛基胞嘧啶反應，從而實現5-醛基胞嘧啶的標記；從而實現反應過程如下：其中，r1為緊鄰著ch2基團的吸電子基團，優選為-cn、等，更優選為-cn；r為與5-醛基胞嘧啶連接的dna或rna分子：所述標記反應體系的ph值為7.5-9。對于步驟(1)準備dna或rna樣品，其可以采用本領域的常規技術來實現，例如可以將一個細胞采用常規方法裂解，得到的dna或rna樣品；本發明在此對步驟(1)不進行限定。發明人通過研究意外地發現，當標記反應體系的ph值為7.5-9，優選為ph值為8-9，優選為8時，步驟(2)反應的產率很高，可以達到98％以上。本文中所說的產率指的是在標記反應體系中，5-醛基胞嘧啶與化合物r1-ch2-cn成環反應后的產物的量與反應前5-醛基胞嘧啶的量的比值，再乘以100％。發明人進一步發現，當化合物r1-ch2-cn具體為丙二腈時，標記反應體系中存在同樣濃度的丙二腈的情況下，步驟(2)的產率明顯高于ph值為7以下的標記反應體系。例如，當丙二腈在標記反應體系中的濃度為150mm，標記反應體系的ph值為7.5-9，優選為ph值為8-9，優選為8時，產率可以達到99％以上，一些具體實施方案中，可以達到99.1％，一些具體實施方案中，可以達到99.2％；一些具體實施方案中，可以達到99.3％；一些具體實施方案中，可以達到99.4％。而當標記反應體系在弱酸性條件下時，產率最多略高于98％。本領域技術人員知道，將產率從98％提升至99％以上是極難實現的。而且在現有技術中，沒有報道過將標記反應體系調至弱堿性，可以提高產率，可見本申請取得了意料不到的技術效果。一種具體實施方案中，可以通過將dna樣品或rna樣品在與化合物r1-ch2-cn反應后進行擴增并測序；并根據測序結果峰圖中對應位點的c(胞嘧啶)信號峰高度(hc)及t(胸腺嘧啶)信號峰高度(ht)，通過公式：hc/[hc+ht]×100％計算產率。在本發明的一個具體實施方案中，得到標記反應體系的過程可以是將緩沖溶液、含有化合物r1-ch2-cn的水溶液及dna或rna樣品混合在一起，從而使標記反應體系的ph值為7.5-9的過程。發明人通過實驗發現，當標記反應體系中所加入的化合物r1-ch2-cn及dna或rna樣品相對緩沖溶液的體積較小時，所得到的標記反應體系的ph值與所加的緩沖溶液的ph值是基本一致的。也就是說，可以將緩沖溶液的ph值作為標記反應體系的ph值，顯然這是合理的。例如，分別配制如表1所示的2ml的50mmnh4ac及10mmtris-hcl緩沖溶液，用醋酸或稀鹽酸調整ph至表1(0mm丙二腈一欄)所示。分別加入20μl15m丙二腈水溶液到各緩沖溶液中使丙二腈終濃度達到150mm，渦旋混勻并使用ph計再次測量含有丙二腈的緩沖溶液ph值，如表1(150mm丙二腈一欄)所示。從表1中可以看出，即使向緩沖溶液中加入少量其它物質，也基本不會改變緩沖溶液的ph值。表1.緩沖溶液50mmnh4ac50mmnh4ac50mmnh4ac10mmtris-hcl10mmtris-hcl0mm丙二腈5.06.07.08.09.0150mm丙二腈5.06.06.98.08.9本發明下述各實施例中其它物質的加入量相比緩沖溶液的量較小，發明人經過驗證確認，均滿足將緩沖溶液的ph值作為標記反應體系的ph值的條件；因此在下述各實施例中將緩沖溶液的ph值作為標記反應體系的ph值。一個具體實施方案中，得到標記反應體系的緩沖溶液可以為tris-hcl緩沖溶液(ph值為7.5-9)。在本發明技術方案的具體實施過程中，發明人意外地發現，標記反應體系中化合物r1-ch2-cn，例如丙二腈的濃度也對產率有影響；并不限于任何理論地得到以下結論：當化合物r1-ch2-cn，例如丙二腈在所述標記反應體系中的濃度為75-1500mm，優選為75-1000mm，更優選為75-500mm，最優選為150mm時，其標記效果，即產率要好于75mm以下或1500mm以上的濃度。需要說明的是，當采用濃度為75-1500mm化合物r1-ch2-cn時，其相對標記反應體系中的5-醛基胞嘧啶是過量的。在得到標記反應體系后，可以使標記反應體系在適宜的溫度下進行反應，以使化合物r1-ch2-cn與dna或rna分子中的5-醛基胞嘧啶反應。一個具體實施方案中，使標記反應體系在20℃-60℃，反應12-48小時，優選18-30小時，更優選為20小時。一個具體實施方案中，使標記反應體系在30℃-40℃，反應12-48小時，優選18-30小時，更優選為20小時。一個具體實施方案中，使標記反應體系在37℃下反應12-48小時，優選18-30小時，更優選為20小時。在反應過程中，可以采用一定的混勻方式將化合物r1-ch2-cn及dna或rna樣品混勻。例如當dna或rna樣品是將一個細胞采用常規方法裂解后所得到的dna或rna樣品時，可以采用恒溫混勻儀進行混勻孵育。本發明利用化合物r1-ch2-cn與5-醛基胞嘧啶的特異性化學反應，實現了對5-醛基胞嘧啶的標記。不僅如此，由于化合物r1-ch2-cn不會與c，5mc，5hmc，5cac及5fu(5-醛基尿嘧啶)發生反應，因此，本發明提供的標記方法能夠特異性的標記5-醛基胞嘧啶。在實現利用化合物r1-ch2-cn特異性地標記5-醛基胞嘧啶的基礎上，本發明還提供了一種5-醛基胞嘧啶的單堿基分辨率的測序方法，其包括以下步驟：(ⅰ)按本發明前述的方法標記dna或rna樣品；(ⅱ)將反應完成后的標記反應體系進行擴增及測序，得到標記后測序結果；(ⅲ)將標記后的測序結果與dna或rna參照序列圖譜進行對比，若序列中同一位置的堿基在參照序列圖譜中讀取為胞嘧啶，在標記后讀取為胸腺嘧啶，則確定該位置的堿基為5-醛基胞嘧啶。所述“dna或rna參照序列圖譜”是已經公開的基于現有技術中的測序方法獲得的dna或rna樣品或基因組的序列信息，本領域技術人員可以通過例如從加州大學圣克魯茲分校基因組瀏覽器(ucsc基因組瀏覽器，ucscgenomebrowser)或genbank獲得這些dna或rna參照序列圖譜。在所述參照序列圖譜中，5-醛基胞嘧啶仍然讀取為胞嘧啶。本發明則利用5-醛基胞嘧啶與化合物r1-ch2-cn的反應產物在擴增過程中突變為胸腺嘧啶t，因而測序結果也顯示為t。通過與參照序列圖譜對比，尋找c-t的突變位點，可鑒定出5-醛基胞嘧啶的單堿基分辨率序列信息。需要說明的是，在本發明中，所采用的擴增及測序方法，均為本領域的現有技術，例如擴增可以常用的pcr方法，也可以采用適于單細胞的malbac(multipleannealingandloopingbasedamplificationcycles，多次退火環狀循環擴增技術)或scrrbs(single-cellreducedrepresentativebisulfitesequencing，單細胞簡化代表亞硫酸氫鹽測序)擴增技術來實現。而測序則可以采用本領域的常規技術來進行。例如可以采用：1)第一代雙脫氧堿基法測序，可利用商業化測序平臺包括abi公司一代測序平臺系列儀器；2)第二代高通量測序技術，可利用的商業化測序平臺包括：illumina公司系列測序平臺，包括但不限于miseq，hiseq2000，hiseq2500，nextseq500，hiseqx等；roche公司焦磷酸測序法測序平臺，如但不限于gsflx；abi公司的solid測序平臺，如但不限于solid5500；3)第三代單分子測序技術，可利用商業化測序平臺包括：pacificbioscience公司的smrt測序平臺，如但不限于smrtrsii；oxfordnanoporetechnologies公司的納米孔單分子測序平臺，如mniion平臺；helicosbiosciences公司的heliscope平臺。需要說明的是，從細胞中獲得dna或rna樣品的方法為本領域的常規技術，本發明在此不進行詳述。一種具體實施方案中，所述dna或rna樣品是痕量樣品或從單細胞獲得的樣品，所述單細胞來源可以是但不限于胚胎干細胞、配子、早期胚胎、癌細胞、神經細胞或血細胞等。基于本發明提供的5-醛基胞嘧啶的單堿基分辨率的測序方法，本發明還提供了一種5-醛基胞嘧啶的單堿基分辨率測序用試劑盒，其包括ph值為7.5-9、優選8-9、更優選為8的緩沖溶液、丙二腈和擴增相關試劑，所述擴增相關試劑可以理解為：實現擴增所需要的各種物質的和，例如可以包括聚合酶、引物、dntp、緩沖液、水等與dna或rna擴增相關的物質，但是不包括擴增對象，例如dna或rna分子；具體物質的選擇可以由本領域技術人員根據需要確定，本發明在此不進行詳述。發明人在實驗過程中意外地發現，在按本發明提供的方法標記5-醛基胞嘧啶后，其標記反應體系可以直接進行擴增，標記反應體系中所剩余的化合物r1-ch2-cn及其它成分不會影響擴增，甚至有利于擴增；因此，一個具體實施方案中，上述步驟(ii)中標記反應體系不經過純化可直接進行擴增。由于省去了純化步驟，因此可以有效避免純化步驟中造成的dna或rna損失。因此本發明的方法適用于dna或rna量很少的樣品，例如來源于單細胞的dna或rna樣品的檢測。基于此，本發明還提供了一種dna或rna的擴增體系，其包含前述5-醛基胞嘧啶的單堿基分辨率的測序方法中步驟(ii)中反應完成后的標記反應體系。基于本發明提供的單堿基分辨率的測序方法，本發明還提供了一種5-醛基胞嘧啶的定量檢測方法，其包括以下步驟：(a)將n個已知的5-醛基胞嘧啶含量不同的模式序列按照前述的測序方法測序并確定c-t轉換比例，其中n≥2，優選n≥3，更優選n≥5；所述c-t轉換比例為序列中同一位置的堿基標記前讀取為胞嘧啶c，標記后讀取為胸腺嘧啶t的比例；(b)以5-醛基胞嘧啶含量為橫/縱坐標，以c-t轉換比例為縱/橫坐標繪制標準曲線；(c)按照前述的測序方法對5-醛基胞嘧啶含量未知的dna或rna測序，并確定c-t轉換比例；(d)根據步驟(c)中確定的c-t轉換比例及步驟(b)中的標準曲線確定5-醛基胞嘧啶含量未知的dna或rna中的5-醛基胞嘧啶含量。本文中，所述模式序列是一段天然的或人工合成的dna或rna序列，序列中各位點的堿基及其修飾堿基是已知的或預先設計的。一個具體實施方案中，5-醛基胞嘧啶含量可以為5-醛基胞嘧啶占所有胞嘧啶的比例，具體可以是百分含量，可以用5fc/c表示；下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。以下實施例所涉及的模式dna序列如表2所示。表2實施例1以丙二腈為例，測定化合物r1-ch2-cn標記5-醛基胞嘧啶的特異性使用從glenresearch公司購買的亞磷酸酰胺單體以及expetidedna/rna固相合成儀化學合成含有單個位點修飾為5fc，5mc，5hmc，5cac，c以及5-醛基尿嘧啶(5fu)的9堿基模式dna序列(oligoidno.1-6)，按照說明進行脫保護并純化，純化后的模式序列使用乙醇沉淀進行進一步純化。向1.5mleppendorf管中加入4μg純化后的模式序列，再加入100mmtris-hcl(ph8.0)10μl,1.5m丙二腈水溶液10μl，加水補齊使標記反應體系體積為100μl，標記反應體系中的丙二腈含量為150mm。反應在eppendorfthermomixer中以37℃，850rpm混勻孵育20小時。反應完成后用乙醇沉淀純化經標記的模式dna序列，并使用bio-radspin-6柱進行進一步脫鹽純化。使用maldi-tof(abi，7500)對純化后的dna進行質譜檢測。質譜結果如圖1所示：化合物丙二腈與含有5fc的模式dna序列反應后，模式dna的相對分子質量增加了49.0，與計算值吻合，說明丙二腈能夠與模式dna序列上的5fc發生反應。同時，化合物丙二腈與含有c，5mc，5hmc，5cac及5fu的模式序列反應后，模式dna的相對分子質量沒有發生變化，說明丙二腈不能與c，5mc，5hmc，5cac及5fu反應。以上結果說明化合物丙二腈能夠特異性的標記5fc。對于其它的化合物r1-ch2-cn，也可以得到同樣的結論，本發明在此不進行贅述。實施例2-12丙二腈標記含5-醛基胞嘧啶的模式序列并測序實施例2使用從glenresearch公司購買的亞磷酸酰胺單體以及expetidedna/rna固相合成儀化學合成含有單個位點修飾為5fc的76堿基模式dna序列(oligoidno.7)，按照說明進行脫保護并純化，純化后的模式序列使用乙醇沉淀進行進一步純化。向1.5mleppendorf管中加入1μg純化后的模式序列，再加入100mmtris-hcl(ph8.0)2μl,1.5m丙二腈水溶液2μl，加水補齊使標記反應體系體積為20μl，標記反應體系中的丙二腈含量為150mm。反應體系在避光的條件下，在eppendorfthermomixer(恒溫混勻儀)中以37℃，850rpm混勻孵育20小時。標記完成后，向20μl反應混合液中直接加入25μl2xmightyampbuffer(takara)并混勻，加入2μl正向及反向引物(引物序列如表3所示)，1μlmightyampdnapolymerase(takara)使體系終體積為50μl并進行pcr擴增。使用測序引物(引物序列如表3所示)用sanger測序檢測擴增出的單一條帶產物。使用snapgene軟件測量測序結果峰圖中對應位點的c(胞嘧啶)信號峰高度(hc)及t(胸腺嘧啶)信號峰高度(ht)，根據公式hc/[hc+ht]×100％計算產率；如圖2a所示，從圖2a中可知，hc＝0.16，ht＝25.28，產率＝hc/[hc+ht]×100％＝99.4％。表3實施例3-12改變tris-hcl緩沖溶液的ph值及標記反應體系中丙二腈的濃度后，按照實施例2的方法利用丙二腈標記5-醛基胞嘧啶，所改變的具體值及所得到的產率見表4及圖2b。對比例1-4將緩沖溶液的ph值調至弱酸性后，按照實施例2的方法利用丙二腈標記5-醛基胞嘧啶，所改變的具體值及所得到的產率見表4及圖2c。表4注：對比例3中的緩沖溶液為nh4ac緩沖溶液；對比例4中的緩沖溶液為tris-hcl緩沖溶液。實施例133-氧代丁腈標記含5-醛基胞嘧啶的模式序列并測序使用從glenresearch公司購買的亞磷酸酰胺單體以及expetidedna/rna固相合成儀化學合成含有單個位點修飾為5fc的76堿基模式dna序列(oligoidno.7)，按照說明進行脫保護并純化，純化后的模式序列使用乙醇沉淀進行進一步純化。向1.5mleppendorf管中加入1μg純化后的模式序列，再加入100mmtris-hcl(ph7.5)2μl,1.0m3-氧代丁腈水溶液2μl，加水補齊使標記反應體系體積為20μl，標記反應體系中的3-氧代丁腈含量為100mm。反應體系在避光的條件下，在eppendorfthermomixer(恒溫混勻儀)中以60℃，850rpm混勻孵育48小時。標記完成后，向20μl反應混合液中直接加入25μl2xmightyampbuffer(takara)并混勻，加入2μl正向及反向引物(引物序列如表3所示)，1μlmightyampdnapolymerase(takara)使體系終體積為50μl并進行pcr擴增。使用測序引物(引物序列如表3所示)用sanger測序檢測擴增出的單一條帶產物。使用snapgene軟件測量測序結果峰圖中對應位點的c(胞嘧啶)信號峰高度(hc)及t(胸腺嘧啶)信號峰高度(ht)，根據公式hc/[hc+ht]×100％計算產率；如圖2d所示，從圖2d中可知，hc＝0.41，ht＝25.12，產率＝hc/[hc+ht]＝98.4％。實施例14將實施例2中的反應溫度調整為20℃，反應時間調整為48小時后，按照實施例2的方法利用丙二腈標記5-醛基胞嘧啶，所得到的產率為：98.7％實施例15將實施例2中的反應溫度調整為60℃，反應時間調整為12小時后，按照實施例2的方法利用丙二腈標記5-醛基胞嘧啶，所得到的產率為：99.0％。實施例16以丙二腈為例，測定化合物r1-ch2-cn標記后的反應體系不純化有利于dna擴增使用從glenresearch公司購買的亞磷酸酰胺單體以及expetidedna/rna固相合成儀化學合成含有單個位點修飾為5fc的76mer模式dna序列(oligoidno.7)，按照說明進行脫保護并純化，純化后的模式序列使用乙醇沉淀進行進一步純化。向1.5mleppendorf管中加入20ng純化后的模式序列，再加入100mmtris-hcl(ph8.0)4μl,1.5m丙二腈水溶液4μl，加水補齊使標記反應體系體積為40μl，標記反應體系中的丙二腈含量為150mm。反應體系在避光的條件下，在eppendorfthermomixer中以37℃，850rpm混勻孵育20小時。標記完成后，取出一半反應液(20μl)使用vistechdna純化回收試劑盒進行純化，作為純化后樣品組。剩余的另一半反應液作為純化前組。向純化前及純化后組里加入25μl2xmightyampbuffer(takara)并混勻，加入2μl正向及反向引物(引物序列如表3所示)，1μlmightyampdnapolymerase(takara)使體系終體積為50μl并進行擴增。每當完成1、3、5、7、9、11及13各擴增循環后暫停擴增，混勻后取出2.5μl擴增樣品保留，并繼續擴增直至15個擴增循環。凝膠電泳分析經過不同循環數擴增后的樣品的相對含量；結果如圖3所示。從圖3中可以看出，隨著擴增循環數的增加，純化前及純化后組的擴增產物相對含量均增高。純化前組進行5循環擴增后已經可以明顯看到擴增產物條帶，而純化后組進行5循環擴增后無可見擴增產物條帶；在進行到15循環擴增后，純化前組的擴增產物量明顯高于純化后組。以上結果說明丙二腈標記體系無需進行純化即可進行擴增，相比較純化后的對照組可以使用更少的循環數擴增出所需產物，也可以使用相同擴增循環數擴增出更多的所需產物。因此不需要純化的丙二腈標記反應更有利于dna的擴增。對于其它的化合物r1-ch2-cn，也可以得到同樣的結論，本發明在此不進行贅述。實施例17以丙二腈為例，測定化合物r1-ch2-cn標記反應不會降解dna向1.5mleppendorf管中加入1μg經乙醇沉淀純化后的模式序列(oligoidno.7)，再加入100mmtris-hcl(ph8.0)5μl,1.5m丙二腈水溶液5μl，用水補齊使標記反應體系體積為50μl，標記反應體系中的丙二腈含量為150mm；作為丙二腈處理組。向1.5mleppendorf管中加入1μg乙醇沉淀純化后的模式序列(oligoidno.7)，10mmtris-hcl(ph8.0)，終體積50μl，作為未處理組。反應體系在避光的條件下在eppendorfthermomixer中以37℃，850rpm混勻孵育0、12，20及36小時。取出5μl反應后的樣品通過凝膠電泳進行相對含量的測定，結果如圖4a所示。未進行孵育的dna作為對照組，從圖4a中可以看出，處理組與未處理組在0、12、20及36小時后均具有與對照組同樣的條帶大小及濃度，同時沒有觀察到小片段的產生(圖4a)。向1.5mleppendorf管中加入1μg小鼠胚胎干細胞基因組dna，10mmtris-hcl(ph8.0)以及150mm丙二腈，反應體系終體積為50μl，作為丙二腈處理組。向1.5mleppendorf管中加入1μg小鼠胚胎干細胞基因組dna，10mmtris-hcl(ph8.0)，終體積50μl，作為對照組。反應體系在避光的條件下在eppendorfthermomixer中以37℃，850rpm混勻孵育0、12，20及36小時。孵育完成后，加入1μg糖原(invitrogen)，5μl醋酸鈉(ph5.4)及168μl冰上預冷的無水乙醇進行乙醇沉淀純化。純化后使用nanodrop測量并計算基因組dna的回收率，結果如圖4b所示。從圖4b中可以看出，處理組與對照組在進行0、12、20及36小時孵育后均具有基本一致的基因組dna回收率，說明丙二腈處理不會造成基因組dna的損失。對于其它的化合物r1-ch2-cn，也可以得到同樣的結論，本發明在此不進行贅述。實施例18丙二腈標記5-醛基胞嘧啶對接malbac單細胞擴增技術實現單細胞單堿基分辨率全基因組5fc的檢測在顯微鏡下，挑起一個小鼠胚胎干細胞并移至4μl裂解液(20mmtris,ph8.0,2mmedta,20mmkcl,0.3％triton-x100)中，向裂解液中加入20單位蛋白酶，并在50℃孵育3小時以裂解細胞。向5μl的單細胞裂解液中加入0.5μl1.5m化合物丙二腈，再加入15μl礦物油液封。反應體系在避光的條件下37℃，850rpm搖晃(eppendorf，thermomixer)孵育20小時以標記單細胞基因組中的5-醛基胞嘧啶。標記后的dna可以使用malbac單細胞基因組擴增技術進行擴增(引物序列如表5所示)：對于標記后的單細胞裂解液，需要進行11輪預擴增以及15輪指數擴增，可以獲得500ng到1μg的擴增產物。在擴增過程中，被標記的5-醛基胞嘧啶會被讀取為胸腺嘧啶t，因此可以用于單堿基分辨率的5-醛基胞嘧啶檢測。擴增產物使用nebnextultradnalibraryprepkit試劑盒進行建庫并使用illuminahiseq平臺進行測序。將測序結果與參考基因組(從ucsc基因組瀏覽器(ucscgenomebrowser)或genbank獲得)進行比較，部分比較結果如圖5所示，從圖5中可以看出，不含5fc的位點與參考基因組完全匹配；含有5fc的位點相比參考基因組發生轉換，即在參考基因組中顯示為c，在測序所得數據中顯示為t。該結果表明這一位點為5fc。此外，由于參考基因組中也標明了基因的位置，因此5fc在基因組上的具體位置也同時獲得。圖5中，5fc信號圖中每一條黑色豎線代表一個檢測到的5fc位點；對于magi2基因(起始位點以倒三角標注)，在其左側的啟動子區域(圖中magi2基因的左側方框)內，含有一個5fc位點。表5實施例19丙二腈標記5-醛基胞嘧啶與scrrbs技術結合實現單細胞單堿基分辨率的簡化表達5fc檢測在顯微鏡下，挑起一個小鼠胚胎干細胞并移至4μl裂解液中(20mmtris,ph8.0,2mmedta,20mmkcl,0.3％triton-x100)，向裂解液中加入20單位蛋白酶，并在50℃孵育3小時以裂解細胞。向單細胞裂解液中加入9udpnii(neb)，并37℃孵育3小時。加入5uklenowpolymerase(3’-5’exo-,fermentas)，37℃孵育30分鐘，65℃孵育20分鐘失活。加入接頭序列及接頭序列互補鏈(序列如表6所示)及30u高濃度t4dna連接酶(fermentas)，10℃連接過夜(至少8小時)并60℃孵育30分鐘失活。此時單細胞裂解液體系為9μl，加入1μl1.5m化合物丙二腈，再加入15μl礦物油液封。反應體系在避光的條件下37℃，850rpm搖晃(eppendorf，thermomixer)孵育20小時以標記單細胞基因組中的5-醛基胞嘧啶。標記后的單細胞裂解液使用mightyampdna聚合酶(takara)進行擴增(擴增引物如表6所示)：經過35輪指數擴增后約可獲得500ng到1μg擴增產物。凝膠電泳分離純化合適的片段(～200-700bp)，純化除掉多余的接頭后使用illuminahiseq4000進行測序。將測序結果與參考基因組(從ucsc基因組瀏覽器(ucscgenomebrowser)或genbank獲得)進行比較，結果與實施例18相同(如圖5所示)。表6實施例20在50μl反應體系中加入100ng模式序列(模式序列由序列相同含有或不含5fc的序列組成，6組平行的反應體系中分別含有0％、20％、40％、60％、80％、100％的含有5-醛基胞嘧啶的序列，序列如表7所示)、1.5m化合物丙二腈水溶液5μl、100mmtris-hcl(ph8.0)5μl，用水補齊至50μl。反應體系在避光的條件下，37℃，850rpm搖晃(eppendorf，thermomixer)孵育20小時以標記5-醛基胞嘧啶。標記后的單細胞裂解液使用mightyampdna聚合酶(takara)進行擴增。擴增產物使用nebnextultradnalibraryprepkit試劑盒進行建庫并使用illuminahiseq4000平臺進行測序。通過統計含有不同修飾比例的模式序列中觀察到的c-t轉變比例確定標準曲線，如圖6所示。在50μl反應體系中加入100ng5fc含量為50％的測試序列(序列為含5fc模式序列與不含5fc模式序列1：1混合，序列如表7所示)、1.5m化合物丙二腈5μl、100mmtris-hcl(ph8.0)5μl，用水補齊至50μl。反應體系在避光的條件下37℃，850rpm搖晃(eppendorf，thermomixer)孵育20小時以標記5-醛基胞嘧啶。標記后的單細胞裂解液使用mightyampdna聚合酶(takara)進行擴增。擴增產物使用nebnextultradnalibraryprepkit試劑盒進行建庫并使用illuminahiseq4000平臺進行測序。將測序結果與模式序列進行比較，統計結果顯示5fc對應位點t讀數(nt)與c、t兩種堿基總讀數(nc+nt)的為：nt/(nc+nt)*100％＝38％，代入圖6中標準曲線中擬合方程：y＝69.5*x+2.468中，其中x為5fc的含量，y為所測到nt/(nc+nt)值。計算5fc含量:5fc％＝[nt/(nc+nt)–2.468]/69.5*100％＝(38-2.468)/69.5*100％＝51.1％。表7以上對本發明所提供的5-醛基胞嘧啶的標記方法及其在單堿基分辨率測序中的應用進行了詳細介紹。本文中應用了具體實施例對本發明的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發明的方法及其中心思想。應當指出，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發明權利要求的保護范圍內。序列表<110>北京大學<120>5-醛基胞嘧啶的標記方法及其在單堿基分辨率測序中的應用<130>pp179876<160>11<170>patentinversion3.5<210>1<211>76<212>dna<213>人工序列<220><221>5-醛基胞嘧啶<222>(38)..(38)<400>1cctcaccatctcaaccaatattatattacgcgtatatcgcgtatttcgcgttataatatt60gagggagaagtggtga76<210>2<211>27<212>dna<213>人工序列<400>2cctcaccatctcaaccaatattatatt27<210>3<211>80<212>dna<213>人工序列<400>3ctccgacattatcactaccatcaaccacccatcctacctggactacattcttattcagta60ttcaccacttctccctcaat80<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4ctccgacattatcactacca20<210>5<211>35<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(28)..(35)<223>nisa,c,g,ort<400>5gtgagtgatggttgaggtagtgtggagnnnnnnnn35<210>6<211>58<212>dna<213>人工序列<400>6aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct58<210>7<211>63<212>dna<213>人工序列<400>7gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacatcacgatctcgtatgccgtcttctgc60ttg63<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8aatgatacggcgaccaccga20<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列<400>9caagcagaagacggcatacga21<210>10<211>137<212>dna<213>人工序列<220><221>5-醛基胞嘧啶<222>(38)..(38)<400>10cctcaccatctcaaccaatattatattacgcgtatatcgcgtatttcgcgttataatatt60gagggagaagtggtgaatactgaataagaatgtagtccaggtaggatgggtggttgatgg120tagtgataatgtcggag137<210>11<211>137<212>dna<213>人工序列<400>11cctcaccatctcaaccaatattatattacgcgtatatcgcgtatttcgcgttataatatt60gagggagaagtggtgaatactgaataagaatgtagtccaggtaggatgggtggttgatgg120tagtgataatgtcggag137當前第1頁12