本發明涉及天然色素分離技術領域，具體地，涉及辣椒堿及其制備方法。

背景技術：

從天然辣椒中提取辣椒堿的方法較多，主要是根據辣椒堿性質和溶解性特點進行萃取和分離。目前，常用的提取方法有溶劑法、酶提取法、超臨界二氧化碳法、超聲強化提取法等。

辣椒堿的純化方法，包括層析法，例如，劉可春等人將辣椒油脂初品按1/2比例加入無水乙醇至60℃下溶解，再按1/3的比例加入中性氧化鋁，攪拌均勻以后在40℃下真空干燥。然后將干燥后的氧化鋁裝入層析柱，用復合溶劑洗脫，洗脫液減壓蒸餾回收溶劑，剩余物加乙醚溶解，-5℃下結晶，再用乙醚重結晶，即可得白色針狀辣椒堿晶體，純度可達98％以上。

裘立群等人利用剛活化的活性炭進行辣椒堿粗提物純化，以90％乙醇作為洗脫液，每1mL提取液加入2g活性炭，在55℃水浴中加熱并攪拌5min，再用10mL洗脫液分兩次進行洗脫。

曾仕廉用丙酮、石油醚、95％乙醉提取出辣椒油樹脂，再以乙醚作為結晶溶劑，得到粗辣椒堿類化合物的晶體，再經硅膠柱層析純化后結晶，得到辣椒堿類化合物純品，純度為91.3％。李緒文等人以干辣椒為原料，用丙酮浸提后，再用硅膠柱層析分離純化辣椒堿類化合物，證明柱層析可以有效地進行辣椒堿類化合物的分離與純化。高藍等人也用硅膠柱層析的方法從含辣味物質2.4％的黑紅色辣椒精中分離得到含辣味物質22.2％的淡褐色辣椒精，從淡褐色辣椒精中分離得到辣味物質的白色晶體。

上述幾種辣椒堿的制取方法各有利弊，或對設備的要求高，在生產實際中難以推廣，或對辣椒堿品質有較大的影響，或對辣椒堿分離純化過程帶來較大困難等。

技術實現要素：

解決上述問題所采用的技術方案是辣椒堿及其制備方法。

本發明提供的一種辣椒堿的制備方法，包括以下步驟：

提取辣椒油脂的步驟：將干紅辣椒粉經丙酮在80℃水浴加熱條件下提取，提取時間為5h，得到辣椒油脂；

第一次硅膠柱層析的步驟：采用丙酮和石油醚為洗脫劑進行洗脫，按顏色的不同分別收集洗脫液，獲得前期洗脫液、中期洗脫液、后期洗脫液；

第二次硅膠柱層析的步驟；將前期洗脫液、中期洗脫液、后期洗脫液分別采用洗脫劑進行二次洗脫，獲得不同顏色的洗脫液。

優選的，所述的洗脫劑為丙酮和石油醚的混合物，其中，兩者的體積比V丙酮:V石油醚＝1:5。

優選的，所述前期洗脫液在第二次層析洗脫時按顏色的不同分別收集洗脫液，獲得2段收集洗脫液。

優選的，所述中期洗脫液在第二次層析洗脫時按顏色的不同分別收集洗脫液，獲得7段收集洗脫液。

優選的，所述后期洗脫液在第二次層析洗脫時按顏色的不同分別收集洗脫液，獲得5段收集洗脫液。

優選的，收集洗脫液采用薄層層析法進行分析，其中，展開劑為丙酮和石油醚的混合物，其中，兩者的體積比V丙酮:V石油醚＝1:5。

本發明的另一個目的在于提供一種辣椒堿，所述的辣椒堿是采用上所述辣椒堿的制備方法制備的。

本發明提供的一種辣椒堿及其制備方法，通過丙酮提取獲得了辣椒油脂，并選擇合適洗脫劑和展開劑對辣椒油脂進行分離和分析；通過兩次柱層析獲得了純品辣椒堿。初步實現了辣椒堿的規模化分離。

附圖說明

圖1是實施例1辣椒油油脂的薄層層析圖；

圖2是實施例1辣椒油油脂經不同配比的洗脫劑洗脫的色譜柱顏色分布；

圖3是實施例1V_丙酮:V_石油醚＝1:5洗脫后對應的薄層板顯色圖樣和辣椒油油脂的薄層樣板；

圖4是實施例1V_丙酮:V_石油醚＝1:1洗脫后對應的薄層板顯色圖樣和辣椒油油脂的薄層樣板

圖5是實施例1前期洗脫液的二級分離圖樣；

圖6是實施例1前期洗脫液經二級分離后的收集液；

圖7是實施例1前期洗脫液經二級分離后(1)(2)號洗脫液對應的薄層板顯色圖樣和一級分離的前期洗脫液的薄層層析樣板；

圖8是實施例1中期洗脫液的二級分離圖樣；

圖9是實施例1中期洗脫液經二級分離的收集液；

圖10是實施例1中期洗脫液二級分離后收集液的(1)-(7)號洗脫液對應的薄層板顯色圖樣；

圖11是實施例1后期洗脫液的柱層析圖樣；

圖12是實施例1后期洗脫液經二級分離后的收集液；

圖13是實施例1后期洗脫液二級分離后收集液的(1)-(5)號洗脫液對應的薄層板顯色圖樣和一級分離的后期洗脫液的薄層層析樣板。

具體實施方式

為使本領域技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細描述。

實驗準備

1展開劑的配制

由于之前我們在做薄層層析探究過辣椒紅素和辣椒堿類物質分離最適展開劑為V_丙酮:V_石油醚＝1:5，所以我們現在配制展開劑時也按照此種比例配制。

2洗脫劑的配制

由展開劑V_丙酮:V_石油醚＝1:5來配制洗脫劑得到相同比例的展開劑，檢測該比例是否適合柱層析，而且在此基礎上加一組對照組：實驗組V_丙酮:V_石油醚＝1:5、對照組V_丙酮:V_石油醚＝1:1。

3顯色劑的配制

層析完而未處理的硅膠板上，只顯示辣椒紅素類物質的顏色，辣椒堿類物質是不顯顏色的，顯色劑的作用是使辣椒堿類物質遇顯色劑變為其它顏色，為便于區分辣椒紅素和辣椒堿。顯色劑選用改良碘化鉍鉀試劑。，辣椒堿類物質遇改良碘化鉍鉀試劑顯示不同程度的綠色。改良碘化鉍鉀試劑的配制方法如下：

溶液1：0.85g堿式硝酸鉍溶于10mL冰醋酸和40mL水。

溶液2：8.00g碘化鉀溶于20mL水。

儲存液溶液1和溶液2等量混合(置棕色瓶中可長期保存)。

顯色時將1ml儲存液與2ml冰醋酸和10ml水混合，用前配制。

4.薄層層析方法

制硅膠板：取硅膠G(薄層層析用)9.00g于研缽中，加20mL水攪勻并調成稀糊狀，用潔凈的長吸管將稀糊吸至已烘干的潔凈載玻片(25.40mm×76.20mm)上，手晃搖勻，使薄層均勻且無氣泡，厚度約0.25-1mm，晾干，再置于烘箱中110℃活化0.5h，冷卻后于干凈密封袋中密封備用。

點樣：將樣品用毛細管分別點在玻璃板一端距邊沿1cm處位置，點樣間隔1-1.5cm，斑點擴散成1-2mm為宜。點樣時使毛細管液體輕輕接觸薄層即可，切勿點樣過重致使薄層破壞。

展開：在層析缸內加入展開劑V_丙酮:V_石油醚＝1:5，將薄層板點有樣點的一端放入，距展開劑液面上方約0.5cm，使樣點展開。

記錄色素分離情況：待展開劑前沿距薄層板上端約1cm時，取出用鉛筆畫出前沿位置，晾干，拍照并記錄辣椒色素斑點離底線的距離及其顏色差異情況。計算各色素斑點的Rf值。

顯色：向薄層板輕噴顯色劑，防止薄層被吹起脫落玻璃板。放置幾分鐘后即可顯出綠色斑點，拍照并記錄綠色斑點離底線的距離及其顏色差別。計算各色素斑點的Rf值。

5.柱層析方法

制硅膠柱：本實驗采用濕法裝柱。一級分離和二級分離的柱層析制柱方法除了選用的硅膠目數有差異外，其余步驟和方法相同。一級分離柱層析選用的硅膠為100-200目，二級分離選用的硅膠為200-300目。具體步驟如下：取硅膠20.00g于燒杯中，加約25ml洗脫劑(洗脫劑用量為完全浸沒硅膠以上)攪拌約2min，待硅膠與洗脫劑混合完全后；關閉玻璃層析柱下端活塞，將濾斗放置在玻璃層析柱上端，將混合溶液沿著濾斗慢慢傾倒入柱內，邊倒邊用玻璃棒攪拌，使得硅膠更多的進入柱內，并用少量洗脫劑潤洗；打開活塞，讓洗脫液留下，用干凈錐形瓶收集洗脫液；在此過程中，可用橡膠管輕輕敲打柱壁，使硅膠沉降加快，并可趕走柱內少量氣泡；最后用玻璃棒檢測沉降是否完全。

上樣：確定硅膠柱很結實后，取樣品，由于樣品呈稠裝液體，需用少量洗脫劑溶解均勻；在加樣前保證洗脫劑液面略高于硅膠柱面，用膠頭滴管取2ml辣椒油油脂溶液，沿著柱的內壁旋轉加入樣品，保證樣品在柱內分布均勻；這樣使得樣品在同一水平面上向下洗脫，并用少量洗脫劑清洗柱壁。

洗脫：待柱內的樣品基本進入硅膠柱內后，可開始大量加入洗脫劑，保持洗脫劑液面始終高于硅膠柱面約5cm，保證層析柱下端流速一定，便于后面收集。加入洗脫劑的原則是用膠頭滴管沿柱內壁慢慢加入，勿過快而破壞硅膠柱表面。

收集：待層析柱下端有有色液體出來開始用玻璃刻度離心管收集，按照色譜柱的顏色順序先后分別收集洗脫液，并測量各種洗脫液體積，待洗脫液基本呈無色停止收集，并將收集液分別編號。

檢測：由于所收集的洗脫液濃度太低，在做薄層層析檢測時會帶來困難，所以在檢測之前需要對樣品進行濃縮。將收集好的洗脫液置于90℃水浴鍋上水浴加熱濃縮，并在已經做好了的薄層硅膠板上點樣，同樣用V_丙酮:V_石油醚＝1:5作為展開劑進行薄層層析，通過比較Rf值大小及差值檢測樣品的分離效果。

實施例1

1.辣椒油脂的提取

將辣椒粉、組裝脂肪測定儀提取瓶、提取筒、稱量用品等放進80℃烘箱中烘干。冷卻后分別稱重。重復以上過程，直至恒重。

稱取辣椒粉約20.00g用脫脂紗布包成圓柱狀，直徑略小于提取筒的直徑，并用一小段脫脂棉線扎緊，貯于密封袋中備用，向提取瓶中加入丙酮20ml。連接好裝置并打開冷凝水開關，潤洗裝置。

潤洗完后，將提取瓶中的液體倒掉，并把準備好的辣椒粉樣品包裝入提取筒，向提取瓶中加丙酮240ml，連接好裝置。水浴溫度設為80℃，提取5h。然后裝置回流0.5h，回收有機溶劑。提取瓶，樣品渣稱重后放入烘箱烘干。冷卻后稱重，重復操作，直至恒重，計算辣椒油脂得率。提取瓶烘至恒重后所剩物質為辣椒油油脂，用石油醚將其溶解，然后倒入廣口瓶中。廣口瓶放進通風櫥中將溶劑石油醚揮發，剩余為辣椒油油脂，儲存備用。

2.薄層層析

將提取出來的辣椒油油脂進行薄層層析，薄層板上出現3個有色斑點，從上到下依次為深紅色、紅色和橙紅色，這些斑點為辣椒紅素斑點；經顯色后薄層板的顏色結果顯示(見圖1)

圖1可見，薄層板經辣椒堿顯色劑顯色后，又出現了3個綠色斑點，并與辣椒紅素斑點呈現交替分布，通過本實驗的薄層層析方法可以分析出辣椒油油脂的6種成分，其中辣椒紅素有3種成分，辣椒堿類物質有3種成分；分別計算各斑點的Rf值，其結果顯示(見表1)。

表1 辣椒油油脂各斑點的Rf值

由表1數據分析可知，辣椒紅素斑點與辣椒堿類物質的Rf值之差在0.05-0.56范圍內，分離效果較好，而且不同辣椒紅素之間的Rf值之差在0.13-0.31范圍內，分離效果很好；通過Rf值得比較可知用V_丙酮:V_石油醚＝1:5作展開劑做薄層層析分離效果好，但由于辣椒紅素和辣椒堿在分離時呈交替分布，而且成分較為復雜，這樣給分離純化帶來困難。

3.第一次柱層析

將相同量的辣椒油油脂在洗脫劑為V_丙酮:V_石油醚＝1:5和V_丙酮:V_石油醚＝1:1的分別洗脫，硅膠柱的顏色結果顯示(見圖2)

圖2可見，洗脫劑V_丙酮:V_石油醚1:5在洗脫時能夠在硅膠柱內呈現顏色分明的條帶，自下而上顏色依次為黃色、深紅色、紅色、淺紅色、橙色、黃色，條帶清晰。具體見圖2左側色譜柱。

洗脫劑V_丙酮:V_石油醚＝1:1在洗脫時在硅膠柱內則呈現出黃色、深紅色、橙色、黃色的色譜條帶。具體見圖2右側色譜柱。

單從顏色上右側色譜柱的辣椒紅素都集中在一起，辣椒紅素與辣黃素分離開，但我們從上面的薄層層析圖樣可以看出幾種辣椒紅素的Rf值差別很大，因此不應該是同時被洗脫下來；另外分析V_丙酮:V_石油醚＝1:5洗脫中的辣椒紅素的分布情況更加接近于薄層層析的圖樣。通過類似的比較和篩選實驗，可以認為洗脫劑配比為V_丙酮:V_石油醚＝1:5的效果較好，更加適合于柱層析中辣椒紅素的分離。

3.1.柱層析一級分離效果檢測

先將洗脫劑為V_丙酮:V_石油醚＝1:5洗脫的洗脫液按先后順序分別收集三次，依次為前期洗脫液(6ml)、中期洗脫液(10ml)和后期洗脫液(8ml)，并將洗脫液進行濃縮點樣進行薄層層析檢測，對應的薄層板依次為1、2、3，經顯色后薄層層析結果顯示(見圖3)。

圖3可見，1號薄層板自上而下依次呈現綠色條帶和深紅色斑點，其中深紅色斑點有擴散現象；2號薄層板自上而下依次呈現綠色條帶、深紅色斑點、紅色斑點和淺綠色斑點，其中深紅色斑點有擴散現象，顏色也明顯加深；3號薄層板自上而下依次呈現深紅色斑點、紅色斑點、淺綠色斑點、橙紅色斑點和淡綠色斑點。分別與未被分離的辣椒油油脂薄層板4號對比發現：1號薄層板上只含有一種辣椒紅素和一種辣椒堿，2號薄層板上含有兩種辣椒紅素和兩種辣椒堿，3號薄層板上含有三種辣椒紅素和兩種辣椒堿；從所含成分推知，前期、中期、后期洗脫液中辣椒紅素與辣椒堿類物質得到了一定的分離。分別計算各斑點的Rf值，其結果顯示(見表2)。

表2 1-4號薄層板上各斑點的Rf值(4作對照)

由表中數據分析可知，深紅色、紅色和橙紅色斑點為辣椒紅素斑點，深綠色、淺綠色和淡綠色斑點為辣椒堿斑點；1號薄層板上辣椒紅素與辣椒堿類物質的Rf值之差為0.22，2號薄層板上辣椒紅素與辣椒堿類物質的Rf值之差在0.04-0.27范圍內，3號薄層板上辣椒紅素與辣椒堿類物質的Rf值之差在0.06-0.34范圍內；由此看出辣椒紅素與辣椒堿類物質有一定的分離效果。

再將洗脫劑為V_丙酮:V_石油醚＝1:1洗脫的洗脫液按先后順序分別收集三次，依次為前期洗脫液、中期洗脫液和后期洗脫液，并將洗脫液進行濃縮點樣做薄層層析，對應的薄層板依次為(1)、(2)、(3)，經顯色后薄層層析結果顯示(圖4)

圖4可見：(1)薄層板自上而下依次呈現綠色條帶、深紅色斑點和紅色斑點，其中深紅色斑點有擴散現象；(2)和(3)薄層板自上而下依次呈現綠色條帶、深紅色斑點、紅色斑點、淺綠色斑點、橙紅色斑點和綠色斑點。分別與未被分離的辣椒油油脂薄層板4號對比發現：(1)薄層板上含有兩種辣椒紅素和一種辣椒堿，(2)和(3)薄層板上含有三種辣椒紅素和三種辣椒堿。除(1)薄層板中成分有分離外，(2)和(3)薄層板中所含成分與未分離前一樣，基本未達到分離效果。

綜合兩次實驗分離效果發現：洗脫劑為V_丙酮:V_石油醚＝1:5的洗脫效果明顯優于洗脫劑為V_丙酮:V_石油醚＝1:1的效果。通過多種組成的洗脫劑組合及配比的比較實驗，可以證實V_丙酮:V_石油醚＝1:5為最佳配比洗脫劑。此結果與薄層層析展開劑配比一致。但是由于洗脫劑為V_丙酮:V_石油＝1:5的洗脫液并沒有得到純度較高的辣椒紅素，所以需要對其洗脫液進行柱層析二級分離。

4.第二次柱層析

第二次柱層析采用的硅膠為250目，應當理解的是200-300目的硅膠都是可行的。

4.1前期洗脫液的柱層析二級分離效果分析

將前期洗脫液進行二級分離，洗脫劑為V_丙酮:V_石油醚＝1:5，硅膠柱的顏色結果顯示(見圖5)。

圖5可見，由于前期洗脫液顏色較淺，且收集液的量少，所以柱層析的色譜柱整體顏色較淺，但有分層現象，自上而下依次為淺黃色和黃色兩種色譜；經洗脫液洗脫后，按色譜柱顏色分別收集了兩次洗脫液，記為(1)、(2)號，顏色都為淡黃色，結果顯示(見圖6)

讀取(1)號和(2)號洗脫液收集量，分別為6mL和12mL；再將(1)、(2)號洗脫液經濃縮后點樣做薄層層析，經顯色后，結果顯示(見圖7)。

圖7可見，1-1薄層板只有上端有一淡綠色斑點，1-2薄層板上斑點自上而下的順序依次為淡綠色斑點和淡紅色斑點，與1薄層板對比發現，斑點的位置略有區別，但成分相同。分別計算各斑點的Rf值，其結果顯示(見表3)：

表3 1-1、1-2薄層板上各斑點的Rf值(1作對比)

由表中數據可知：綠斑點為辣椒堿；淡紅色斑點為辣椒紅素；將各Rf值與1薄層板上斑點的Rf值對比發現，其結果基本一致，說明是由于實驗誤差引起斑點位置差異，1-2薄板中淺紅色斑點與1薄板中深紅色斑點是對應的。由薄層層析檢測分析推知：前期洗脫液經二級分離后，(1)號洗脫液中全部為辣椒堿溶液，(2)號洗脫液為辣椒紅素與辣椒堿的混合溶液。該二級分離達到了良好的分離效果。

4.2中期洗脫液的柱層析二級分離效果分析

將中期洗脫液進行二級分離，洗脫劑為V_丙酮:V_石油醚＝1:5，硅膠柱的顏色結果顯示(見圖8)

由于中期洗脫液的顏色較深，且收集液量較多，所以柱層析后整個柱子的顏色較深，并且色譜柱的顏色層次分明，自下而上依次為黃色、深紅色、橙紅色、橙色、紅色、深黃色和淺黃色，按色素帶順序收集洗脫液，依次編號為(1)-(7)號，其結果顯示(見圖9)。

分別讀取(1)-(7)號洗脫液的收集量，其結果顯示(見表4)：

表4 (1)-(7)號洗脫液的收集量

將(1)-(7)號洗脫液濃縮后點樣做薄層層析，經顯色后，結果顯示(見圖10)；

圖10可見，2-1薄層板上只有最上端的綠色斑點；2-2薄層板自上而下依次顯示綠色斑點和深紅色斑點，其中深紅色斑點有向上擴散現象，綠色斑點較1-1中顏色加深；2-3薄層板的斑點與2-2中一樣，但綠色斑點有較嚴重的拖尾現象，且顏色較2-2中要淡；2-4薄層板自上而下依次顯示綠色斑點、深紅色斑點和紅色斑點，其中綠色斑點有拖尾現象，顏色較2-3中要淡；2-5薄層板自上而下依次顯示深紅色斑點、紅色斑點和淺綠色斑點，對比2-4中少了綠色斑點，但多出淺綠色斑點；2-6薄層板自上而下依次顯示紅色斑點和淺綠色斑點，較2-5中少了深紅色斑點；2-7薄層板上只有淺綠色斑點；并且與2薄層板對比發現各斑點的顏色和位置基本相同。分別計算各薄層板上斑點的Rf值，其結果顯示(見表5)：

表5 2-1至2-7薄層板上各斑點的Rf值(2作對比)

由表中數據分析知：深紅色斑點和紅色斑為辣椒紅素斑點，綠色斑點和淺綠色斑點為辣椒堿斑點；其中辣椒紅素類物質的Rf值約為0.70和0.60，辣椒堿的Rf值約為0.95和0.56，辣椒紅素與辣椒堿的Rf值之差為0.04-0.35范圍內，分離效果明顯。另外，由薄層層析推測(1)-(7)號洗脫液中所含成分知，(1)號洗脫液中為較純的辣椒堿；(2)號洗脫液中有少許辣椒紅素，但大部分都是辣椒堿；(3)號洗脫液中辣椒紅素和辣椒堿都含有；(4)號洗脫液在中辣椒堿含量明顯減少，辣椒紅素含量增多；(5)號洗脫液中含有另一種辣椒堿，辣椒紅素含量也相對較多；(6)號洗脫液中辣椒紅素含量明顯減少，辣椒堿含量增多；(7)號洗脫液中基本無辣椒紅素，只含有辣椒堿。那么從洗脫順序來看，黃色譜帶中基本只含有辣椒堿；深紅色譜帶和橙紅色譜帶中辣椒紅素的含量最多，也含有很少量的辣椒堿類物質，可以進一步探討辣椒紅素的含量比例；橙色譜帶中多含有一種辣椒紅素成分；紅色譜帶中也是辣椒紅素與辣椒堿的混合物，但是所含辣椒堿的成分不同；深黃色譜帶中則少一種辣椒紅素成分。整體上從二級分離中期洗脫液的效果可以得出：辣椒紅素與辣椒堿類物質得到了較好的分離，可以得到較純的辣椒紅素；雖然沒有得到辣椒紅素純品，但對比一級分離的效果更加明顯。

4.3后期洗脫液的柱層析二級分離效果分析

將后期洗脫液進行二級分離，洗脫劑為V_丙酮:V_石油醚＝1:5，硅膠柱的顏色結果顯示(見圖11)。后期洗脫液的顏色相對中期洗脫液較淺，柱層析后色譜柱的顏色也相對較淺，但層次分明，從下向上依次為淡黃色、深黃色、橙紅色、黃色和淺黃色，按色譜帶順序分別收集，得到(1)-(5)號洗脫液，其結果顯示(見圖12)；

由于后期洗脫液在一級分離時最后被洗脫，洗脫時間較長，所以其二級分離時色素帶洗脫液量較多，測量各洗脫液的量，其結果顯示(見表6)；

表6(1)-(5)號洗脫液的收集量

將(1)-(5)號洗脫液分別濃縮做薄層層析，顯色后的結果顯示(見圖13)

圖13可見：3-1薄層板自上而下依次為淺綠色斑點和深紅色斑點；3-2薄層板只有深紅色斑點；3-3薄層板自上而下依次顯示深紅色斑點和紅色斑點；3-4薄層板自上而下依次顯示紅色斑點、淡綠色斑點和橙紅色斑點；3-5薄層板自上而下依次顯示淡綠色斑點、橙紅色斑點和綠色斑點，3-5薄層板斑點顏色明顯較3-4薄層板要淡。與3薄層板對比發現各斑點的顏色和位置基本相同。分別計算薄層板各斑點的Rf值，其結果顯示(見表8)。

表8 3-1至3-5薄層板上各斑點的Rf值(3作對比)

由表8數據可知：深紅色斑點、紅色斑點和橙紅色斑點為辣椒紅素斑點；深綠色斑點、淡綠色斑點和綠色斑點為辣椒堿斑點；辣椒紅素類物質的Rf值約為0.72、0.59和0.40，辣椒堿的Rf值約為0.95、0.52和0.35，辣椒紅素與辣椒堿的Rf值之差在0.05-0.55范圍內，分離效果明顯。從薄層層析板上的斑點分布情況，可推斷并得出如下結論：(1)號洗脫液中含有辣椒紅素和辣椒堿的量都很少；(2)號洗脫液中只含有辣椒紅素，并且成分單一；(3)號洗脫液中也只含有辣椒紅素，但是其成分為兩種辣椒紅素；(4)號洗脫液中含有兩種辣椒紅素和另一種辣椒堿；(5)號洗脫液中含有兩種辣椒堿和一種辣椒紅素，且含量相對更少。

從洗脫順序和效果來看，一級柱層析分離收集的前期洗脫液和中期洗脫液再經過二級柱層析分離可以得到辣椒堿的單一成分(1-1和2-1洗脫液)。雖然一級柱層析分離收集的前期洗脫液和中期洗脫液再經過二級柱層析分離收集的其余部分洗脫液沒有得到不含辣椒紅素的辣椒堿，但已經取得了良好的分離效果，因為每種收集的洗脫液均只含有一種類型的辣椒堿，經薄層層析驗證，且與辣椒紅素不存在交叉分布現象，為三級柱層析分離獲得單一辣椒堿成分提供了條件。需要說明的是，本方法的一級柱層析分離收集的后期洗脫液沒有分離辣椒堿的價值，因為后期洗脫液中辣椒堿類物質含量少，且存在與辣椒紅酥交叉分布現象。總之，通過本發明進行的二級柱層析能夠得到辣椒堿純品。

可以理解的是，以上實施方式僅僅是為了說明本發明的原理而采用的示例性實施方式，然而本發明并不局限于此。對于本領域內的普通技術人員而言，在不脫離本發明的精神和實質的情況下，可以做出各種變型和改進，如三級柱層析分離等，這些變型和改進也視為本發明的保護范圍。