本發明涉及一種改造的木質纖維素酶及其應用，特別涉及包含編碼所述改造纖維素酶的核酸序列的基因構建體，從宿主菌株中生產所述改造纖維素酶的方法和用所述改造的纖維素酶在木質素存在的條件下對纖維素水解的方法，屬于基因工程技術領域。
背景技術：
纖維素是陸地上最主要的光和作用產物，因其具有儲藏量大、生產周期短、綠色無污染等特點，降解纖維素獲得生物燃料替換日益枯竭的化石原料備受人們的青睞。木質纖維素的降解分為酸降解和纖維素酶降解：自二戰至今，酸降解法被證明糖得率低，成本高，設備投資大；而纖維素酶降解法由于潛在成本低，環境友好，糖得率高，被研究者廣泛關注。木質纖維素干重的90％是以纖維素、半纖維素、木質素以及果膠的形式存在的(jensen,etal.,2008；
為了降低木質素的抑制作用，往往通過蒸汽爆破、氨處理、酸處理或者有機溶劑處理木質纖維素等方法降低木質素含量或者使得纖維素表面暴露以提高木質纖維素的水解效率。這些物理或者化學處理方法能夠很好的提高木質素纖維的降解效率，然而由于木質纖維素結構復雜，往往很難將木質素清除干凈，預處理后殘留的木質素仍然對木質纖維素的降解產生一定影響。
纖維素酶屬于糖苷水解酶，糖苷水解酶往往采取不同模塊的組合形式來提高對這些大物質分子的降解能力。一般來說，糖苷水解酶包含一個催化結構域、一個或者幾個串聯的碳水化合物結合區以及將二者相連的連接區。碳水化合物結合區是獨立存在于酶蛋白的區域，他們能夠使其所在的蛋白質接近、結合并富集于作用的底物，對促進碳水化合物降解酶的降解活性具有重要作用。真菌纖維素酶的碳水化合物結合區氨基酸序列相似度非常高，有些位點的氨基酸高度保守，例如形成平滑面的三個芳香族氨基酸、29位的天冬酰胺及34位的谷氨酰胺等(linderetal.,1995)。碳水化合物結合區中的芳香類氨基酸(酪氨酸和色氨酸)形成光滑的疏水面與碳水化合物中的吡喃糖環結構通過疏水作用相互結合(simpsonetal.,2000)。研究表明，除了三個芳香族氨基酸外，極性氨基酸，例如q7、n29和q34等同樣參與了疏水面的形成(fukudaetal.,2006；beckhametal.,2010)。同時，極性氨基酸產生的氫鍵作用同樣在結合中發揮作用(hildenandjohansson,2004)，并且這些極性氨基酸位點的突變可能會影響疏水面的形成，降低纖維素酶與纖維素的結合活性，從而降低了纖維素酶活性。strobel(2015)等利用研究表明，當碳水化合物結合區平滑面中的芳香族氨基酸或者極性氨基酸突變為丙氨酸后，里氏木霉cbhi對纖維素和木質素的親和力同時降低；同時他們指出，除個別氨基酸外，碳水化合物結合區點突變對纖維素及木質素的吸附能力變化高度的一致。
然而，碳水化合物結合區除了能夠識別、吸附纖維素鏈之外，還能夠與木質素非特異性的吸附，并且木質素與碳水化合物結合區的吸附性非常強。因此如何降低纖維素酶與木質素的非特性吸附對提高纖維素酶降解活性、降低燃料乙醇生產成本具有重要意義。通常來說，木質素表面攜帶有大量的負電荷。lan(2013)等的研究表明，ph對纖維素酶水解木質纖維素產生影響，較高的ph(5.2-6.2)條件下木質纖維素的水解效率高于ph在4.8或者5.0時。高ph時的水解效率，木質素表面攜帶的負電荷增加，同時親水性提高，這降低了纖維素酶與木質素的非特異性的吸附作用。提高反應體系的ph值時，由于纖維素酶的pi較低，其表面所攜帶的負電荷增加，因此纖維素酶與木質素之間的電荷相斥作用增強，同樣使得纖維素酶與木質素非特異性吸附降低(louetal.,2013)。同時有報道表明(strobeletal.,2016)，增加碳水化合物結合區區負電荷突變時，碳水化合物結合區對木質素的吸附降低。
技術實現要素：
本發明針對現有技術的不足，提供一種改造的木質纖維素酶及其應用。
本發明的技術方案如下：
一種改造的木質纖維素酶，在碳水化合物結合區進行如下改造：
碳水化合物結合區第14位的絲氨酸替換為天冬氨酸；或者，碳水化合物結合區第21位的絲氨酸替換為天冬氨酸；或者碳水化合物結合區第24位的蘇氨酸替換為天冬氨酸；或者碳水化合物結合區第14位的絲氨酸以及第21位的絲氨酸同時替換為天冬氨酸；或者碳水化合物結合區第14位的絲氨酸、第21位的絲氨酸以及第24位的蘇氨酸同時替換為天冬氨酸；
所述的碳水化合物結合區屬于糖水化合物結合區第一家族，與來自木霉屬(trichodermasp.)、曲霉屬(aspergillussp.)、青霉屬(penicilliumsp.)、肉座菌屬(hypocreasp.)、腐質霉屬(humicolasp.)、支頂孢屬(acremoniumsp.)、裸節菌屬(talaromycessp.)或者脈孢菌屬(neurosporasp.)的cel5a、cel6a、cel7a、cel7b纖維素酶、碳水化合物酯酶或者木聚糖酶的碳水化合物結合區具有高于70％的同源性。
根據本發明優選的，所述碳水化合物結合區的氨基酸序列如seqidno.1所示。所述碳水化合物結合區的表達基因核苷酸序列如seqidno.13所示。
根據本發明優選的，所述碳水化合物結合區第14位的絲氨酸替換為天冬氨酸，氨基酸序列如seqidno.2所示。
進一步優選的，所述改造的木質纖維素酶氨基酸序列如seqidno.8所示。
根據本發明優選的，所述碳水化合物結合區第21位的絲氨酸替換為天冬氨酸，氨基酸序列如seqidno.3所示。
進一步優選的，所述改造的木質纖維素酶氨基酸序列如seqidno.9所示。
根據本發明優選的，所述碳水化合物結合區第24位的蘇氨酸替換為天冬氨酸，氨基酸序列如seqidno.4所示。
進一步優選的，所述改造的木質纖維素酶氨基酸序列如seqidno.10。
根據本發明優選的，所述碳水化合物結合區第14位的絲氨酸以及第21位的絲氨酸同時替換為天冬氨酸，氨基酸序列如seqidno.5所示。
進一步優選的，所述改造的木質纖維素酶氨基酸序列如seqidno.11所示。
根據本發明優選的，所述碳水化合物結合區第14位的絲氨酸、第21位的絲氨酸以及第24位的蘇氨酸同時替換為天冬氨酸，氨基酸序列如seqidno.6所示。
進一步優選的，所述改造的木質纖維素酶氨基酸序列如12所示。
上述改造的木質纖維素酶在木質素存在的條件下水解纖維素的應用。
改造原理
本發明所述改造后的碳水化合物結合區能夠使得木質素對纖維素酶的抑制作用降低，從而增加了在木質素存在條件下的纖維素水解活性。具體地，本發明涉及包含碳水化合物結合區的纖維素酶，所述改造碳水化合物結合區能夠與催化結構域通過連接區進行可操作地連接，所述改造的碳水化合物結合區的長度約為40個氨基酸，包含一個或多個氨基酸的替換。所述氨基酸的替換導致相對于衍生出所述改造碳水化合物結合區的親本碳水化合物，具有使碳水化合物結合區的理論等電點下降，并且/或者使所述碳水化合物結合區的表面負電荷增加，并且/或者使所述碳水化合物中的天冬氨酸含量增加；所述氨基酸的替換是通過用酸性氨基酸天冬氨酸替換衍生出所述改造碳水化合物結合區的親本碳水化合物結合區的絲氨酸和/或蘇氨酸。所述氨基酸替換導致所述碳水化合物結合區的理論等電點下降至少1.3單位并且/或者使所述碳水化合物結合區中的天冬氨酸比例提高了至少27％。
有益效果
1、本發明所述改造的碳水化合物結合區使得與包含親本碳水化合物結合區的親本纖維素酶相比，水解活性提高，親本碳水化合物結合區可操作地通過連接區與所述纖維素酶中存在的相同的纖維素酶催化結構域相連；
2、本發明所所述改造的碳水化合物結合區可使得與親本纖維素酶相比，在木質素存在的條件下纖維素水解活性提高至少約14％，這種在木質素存在條件下的纖維素酶活性升高對從木質纖維素底物生產可發酵糖、醇或糖醇例如從纖維素生產乙醇的工業具有潛在價值。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明的技術方案做進一步闡述，但本發明所保護范圍不限于此。
菌種來源
里氏木霉(trichodermareesei)qm6a或其變異菌種為原始菌，來源于美國模式培養物集存庫(atcc)，菌種保藏號atcc13631。
e.colistraingb05-dir，克隆載體pug6和psilent-1均購自山東大學微生物技術國家重點實驗室。
β-葡萄糖苷酶根據wang等,2015,aweibullstatistics‐basedlignocellulosesaccharificationmodelandabuilt‐inparameteraccuratelypredictlignocellulosehydrolysisperformance.biotechnologyjournal,10(9):1424-1433的方法獲得。
大腸桿菌trans5α和transbl21(de3)以及表達載體pet-22b均購自北京全式金公司；
實施例1描述了在以下實施例中所用到的菌種及載體，實施例2～6詳細的描述了本發明中改造的里氏木霉cel7a突變體及其純化的過程，實施例7、8詳細的描述了在實施過程中使用的β-葡萄糖苷酶的表達與純化，實施例9描述了酸不溶性木質素的制備過程，實施例10描述了經過本發明改造后的cel7a突變體水解活性的提高。
實施例1里氏木霉纖維二糖水解酶i(cel7a)編碼基因在載體pug6中的克隆
cel7a編碼基因及其上下游片段經pcr的方法在里氏木霉qm6a中克隆獲得；引物序列如下：
f1:gcaaatggtacgtacggacagttcaggccgcggatctgccggtctcccta
r1:tgcggttgtgcgaccttcagctctggcgttctatagtgtcacctaaatcg
pcr反應在50μl體系中進行：
2×pcrbuffer25μl，2mmdntps10μl，引物f11.5μl，引物r11.5μl，模板dna1μl，kodfx聚合酶1μl，加純水補足到50μl。
pcr反應程序如下：
94℃預變性2min；98℃變性10s，69℃退火30s，68℃延伸90s，30個循環；68℃延伸10min。
潮霉素抗性基因，引物序列如下：
f2:cgatttaggtgacactatagaacgccagagctgaaggtcgcacaaccgca
r2:atcgatccggtcggcatctactctattacaggcactgagagtagtaaggg
pcr反應在50μl體系中進行：
2×pcrbuffer25μl，2mmdntps10μl，引物f21.5μl，引物r21.5μl，模板dna1μl，kodfx聚合酶1μl，加純水補足到50μl。
pcr反應程序如下：
94℃預變性2min；98℃變性10s，67℃退火30s，68℃延伸90s，30個循環；68℃延伸10min。
pgpd/tter經pcr的方法從載體psilent中克隆獲得，引物序列如下：
f3:cccttactactctcagtgcctgtaatagagtagatgccgaccggatcgat
r3:tagggagaccggcagatccgcggcctgaactgtccgtacgtaccatttgc
pcr反應在50μl體系中進行：2×pcrbuffer25μl，2mmdntps10μl，引物f31.5μl，引物r31.5μl，模板dna1μl，kodfx聚合酶1μl，加純水補足到50μl。
pcr反應程序如下：
94℃預變性2min；98℃變性10s，69℃退火30s，68℃延伸90s，30個循環；68℃延伸10min。
獲得上述片段后，在gb05-dir菌中用linear-linearhomologousrecombinationmediatedbyfulllengthrecet方法(fu等,2012,full-lengthreceenhanceslinear-linearhomologousrecombinationandfacilitatesdirectcloningforbioprospecting.naturebiotechnology30(5):440-446.)構建獲得cel7a克隆質粒ptci，經檢測，cel7a編碼基因的核苷酸序列如seqidno.14所示。
實施例2：碳水化合物結合區的點突變
使用點突變試劑盒kod-plus-mutagensiskit(購自日本東洋紡績株式會社)對構建的質粒ptci中cel7a的碳水化合物結合區進行點突變，突變方法嚴格按照試劑盒說明書操作，突變后的質粒在大腸桿菌trans5α中進行擴增。點突變引物序列如下：
s14d-f:gtattggctacgatggccccacgg
s14d-r:cgccgcactggccgtagtgagact
s21d-f:ggtctgcgccgatggcacaacttg
s21d-r:gtggggccgctgtagccaataccg
t24d-f:ccagcggcacagattgccaggtcct
t24d-r:cgcagaccgtggggccgctgtagc
經過此步驟共獲得五個含有碳水化合物結合區不同位點突變的質粒：s14d、s21d、t24d或者s14d/s21d或者s14d/s21d/t24d。
經測序，s14d質粒的碳水化合物結合區表達后第14位的絲氨酸替換為天冬氨酸，木質纖維素酶的氨基酸序列如seqidno.2所示。
經測序，s21d質粒的碳水化合物結合區表達后第21位的絲氨酸替換為天冬氨酸，木質纖維素酶的氨基酸序列如seqidno.3所示。
經測序，t24d質粒的碳水化合物結合區表達后第24位的蘇氨酸替換為天冬氨酸，木質纖維素酶的氨基酸序列如seqidno.4所示。
經測序，s14d/s21d質粒的碳水化合物結合區表達后第14位的絲氨酸以及第21位的絲氨酸同時替換為天冬氨酸，木質纖維素酶的氨基酸序列如seqidno.5所示。
經測序，s14d/s21d/t24d質粒的碳水化合物結合區表達后第14位的絲氨酸、第21位的絲氨酸以及第24位的蘇氨酸同時替換為天冬氨酸，木質纖維素酶的氨基酸序列如seqidno.6所示。
實施例3：里氏木霉cel7a中碳水化合物結合區的改造
在實施例2中構建獲得的碳水化合物結合區突變后的質粒經測序驗證正確后，在大腸桿菌trans5α中進行大量克隆擴增，獲得的質粒通過同源重組的方法轉化里氏木霉qm6a的原生質體，構建獲得含有碳水化合物結合區目的位點突變的cel7a表達菌株。原生質體制備及轉化方法參照絲狀真菌轉化方法(liu等,2016,regulationofcellulaseexpression,sporulation,andmorphogenesisbyvelvetfamilyproteinsintrichodermareesei.appliedmicrobiologyandbiotechnology100(2):769-779.)。構建獲得的轉化子用引物對f4/r4進行驗證，野生型基因組中擴增獲得的片段大小為2121bp，轉化子基因組中擴增獲得的片段大小為3660bp。獲得的轉化子cel7a中碳水化合物結合區送交基因公司進行測序驗證。f4/r4引物序列如下：
f4:cctcatgctctccccatctactca
r4:gtggtactgggatacacgaagagc
經過此步驟共獲得五個含有碳水化合物結合區不同位點突變cel7a突變體的qm6a株，碳水化合物結合區突變位點包括s14d、s21d、t24d或者s14d/s21d或者s14d/s21d/t24d。
實施例4：cel7a及其突變體在里氏木霉中的表達
上述構建獲得含有碳水化合物結合區突變位點的cel7a及野生型cel7a在里氏木霉qm6a中進行培養表達。首先將各菌株在麩皮培養基中培養5～7天，待其生孢后，接種至種子培養基中進行培養；3天后，按照1:10(v/v)的比例將經過種子培養階段的菌液接種至產酶培養基中進行誘導培養；產酶培養7天后即可收集酶液。
麩皮培養基的配制(100ml)：稱取麩皮1g、玉米芯1g、葡萄糖1g、蛋白胨1g、硫酸銨0.2g、磷酸二氫鉀0.3g、七水硫酸鎂0.09g和碳酸鈣0.5g于300ml三角瓶中，并添加適量微量元素，加入100ml純凈水后滅菌備用。
產酶培養基的配制(200ml)：稱取麩皮6g、玉米芯6g、微晶纖維素1.2g、蛋白胨1g、尿素0.2g、硫酸銨0.8g、磷酸二氫鉀0.6g、七水硫酸鎂0.18g、硝酸鈉0.4g和碳酸鈣1g于1l三角瓶中，并添加適量微量元素，加入200ml純凈水后，吸取0.6ml吐溫-80并沿培養基液面緩緩加入，滅菌備用。
實施例5：cel7a及其突變體的純化
實施例4中培養的酶液經離心后去除雜質，收集上清液(酶液)。
(1)收集后的酶液用濃縮管濃縮，于4℃條件下5000g離心，直至將酶液濃縮至約3ml；
(2)吸取濃縮后的酶液于1.5ml離心管中，12000rpm離心10min去除不溶物，吸取上清酶液于1.5ml離心管中，至于冰上備用；
(3)提前用50mm的tris-hcl緩沖液沖洗分子篩s-400，系統流速設為0.5ml/min，柱前壓設為0.5mpa，delta壓設置為0.3mpa，沖洗大于2倍柱體積(240ml)的緩沖液；
(4)用2.5ml注射器取2ml濃縮酶液上樣；
(5)收集洗脫峰蛋白，sds-page電泳檢測蛋白；
(6)取電泳檢測條帶大小合適，純度高的蛋白使用除鹽柱更換蛋白buffer，使用檸檬酸緩沖液(ph4.8)進行洗脫；
(7)收集獲得的蛋白質濃度使用bradfordkit蛋白濃度試劑盒(購自生工生物工程(上海)股份有限公司)進行測定，標準曲線及測定方法參照試劑盒說明書。
實施例6：酸不溶性玉米秸稈木質素的制備
取50g玉米秸稈經球磨后加入丙酮(玉米秸稈：丙酮的質量比為1:10)浸泡24h，用水沖洗10次，烘干后加入37％以上的濃鹽酸(料：鹽酸的質量比為1:10)，冰浴處理24h，用水沖洗10次。烘干后加入足量的纖維素酶酶液(蔚藍生物科技有限公司提供)于45℃處理7天。處理結束之后加入1％(w/v)sds，37℃處理1h使纖維素酶變性，121℃處理1h，用熱水反復沖洗10次，烘干后即獲得酸不溶性玉米秸稈木質素(acidinsolublecornstoverlignin，aics-lignin)。獲得的木質素用兩步酸法分析木質素中纖維素和半纖維素的含量，結果表明制備的木質素纖維素含量非常低(0.7％)、半纖維素沒有檢測到，滿足木質素使用要求。
實施例7：cel7a及其突變體的水解活性檢測
將實施例5中純化獲得的cel7a及其突變體、微晶纖維素(購自國藥集團化學試劑有限公司)以及實施例6中制備的木質素在檸檬酸緩沖液(ph4.8，45℃)并添加少量的葡萄糖苷酶中進行旋轉孵育48小時。每一個反應體系中含有60μgcel7a或者其突變體、15μg的β-葡萄糖苷酶、30mg微晶纖維素以及15mgaics-lignin(見實施例6)，使用檸檬酸緩沖液補足至1ml；每個反應體系重復兩次。反應體系經48小時反應后，離心收集上清液，經hplc分析上清液中葡萄糖的含量。
結果表明，cel7a野生型反應體系中葡萄糖的濃度為6.2mg/ml，碳水化合物結合區s14d突變后的cel7a反應體系中葡萄糖的濃度為6.4mg/ml，碳水化合物結合區s21d突變后的cel7a反應體系中葡萄糖的濃度為7.3mg/ml，碳水化合物結合區t24d突變后的cel7a反應體系中葡萄糖的濃度為7.8mg/ml，碳水化合物結合區s14d/s21d突變后的cel7a反應體系中葡萄糖的濃度為8.3mg/ml，碳水化合物結合區s14d/s21d/t24d突變后的cel7a反應體系中葡萄糖的濃度為8.8mg/ml。以野生型cel7a獲得的葡萄濃度為100％進行比較，其他突變體水解活性提高效率見表1。由表1可以看出，碳水化合物結合區中s21d突變后，cel7a水解活性提高了18％，t24d突變后提高了26％，雙位點突變s14d/s21d突變后cel7a水解活性提高了34％，而三位點突變s14d/s21d/t24d突變后cel7a水解活性提高了42％，結果如表1所示。
表1改造前后cel7a水解纖維素活性的比較
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