本發明涉及抗腫瘤藥物
技術領域：
，尤其涉及環磷酸腺苷硼酸絡合物及其制備方法，以及抗腫瘤藥物和中子俘獲治療的硼劑。
背景技術：
：隨著醫療技術的不斷發展，輻射殺滅腫瘤的技術也從無選擇性的x，γ輻射(普通的醫用加速器)到具有一定縱向能量選擇(博拉格峰)的質子、重離子輻射治療。尤其利用10b分子俘獲超熱低能中子(1ev～10kev)在腫瘤細胞中產生核反應(～3mev)具有更高量級選擇性殺滅腫瘤的硼中子俘獲療法(bnct)，更是近來世界上研究的熱點。bnct是把與腫瘤有特異性親和力的硼(10b)化合物攜帶劑注入人體,選擇性富集于腫瘤細胞,然后用超熱低能中子局部照射,使具有超大中子俘獲截面的10b俘獲中子形成局部核反應殺死腫瘤細胞。如果10b化合物能特異性完全富集于腫瘤細胞中，則bnct殺滅腫瘤的選擇性將是其他輻射治療的百倍以上。然而目前經美國食品及藥物管理局(fda)認證的第2代硼劑低分子硼化合物十一氫巰基十二硼化二鈉(bsh)和對二羥苯基丙氨酸硼(bpa)盡管與第1代硼劑相比性能有了較大改進，其能在腫瘤細胞中滯留較長的時間，對腫瘤細胞有一定的選擇性親和力，腫瘤與正常組織中的硼濃度比值(t/n)，以及腫瘤與血液中硼濃度比值(t/b)均能達到＞1。但仍不能滿足bnct的基本要求，即t/n或t/b≥3，因此目前bnct治療腦腫瘤的效果并不十分理想。篩選和合成能特異性富集于腫瘤細胞的10b化合物已經成為這一技術推廣的重要瓶頸。近年來，第3代硼攜帶劑的研究也在快速發展，主要特點是能通過和腫瘤特異性表達的抗原或受體結合，使硼劑被腫瘤細胞靶向攝取，從而達到較高的t/n或t/b值。其中研究較為廣泛的有表皮生長因子受體(egfr)介導的能和表皮生長因子(egf)結合的bpa,葉酸受體(fr)介導的和葉酸能結合包含硼劑的脂質體和碳納米顆粒,以及具有較高的親水性,能被膠質瘤細胞t98g選擇性攝取，并具有更高親和力的結合了卟啉的硼酸鹽。目前，利用這些腫瘤選擇性吸收的硼劑，bnct在腦膠質瘤中取得了一定的療效,通過fr介導的細胞內吞,能把含硼藥物運送到細胞內，以及fr靶向的含硼碳納米顆粒能夠被高表達fr的hela細胞靶向攝取等相關研究也有報道。總之，現有的利用硼劑(10b)運用bnct進行輻射殺滅腫瘤，雖然能一定程度上提高10b在腫瘤細胞的濃度，但僅僅是提高其bnct中能選擇性吸收中子能量來殺滅腫瘤單方面效應，腫瘤細胞殺滅效率低，選擇性差。上述內容僅用于輔助理解本發明的技術方案，并不代表承認上述內容是現有技術。技術實現要素：本發明的主要目的在于提供一種環磷酸腺苷硼酸絡合物和制備方法，以及抗腫瘤藥物和bnct的硼劑，旨在解決現有的針對目前bnct中的硼劑大部分僅僅具有單一的功能，僅僅是提高其bnct中能選擇性吸收中子能量來殺滅腫瘤單方面效應，腫瘤細胞殺滅效率低，選擇性差問題。為解決上述問題，本發明提供一種環磷酸腺苷硼酸絡合物，其特征在于，包括：優選地，所述環磷酸腺苷硼酸絡合物的絡合形式如下：此外，為解決上述問題，本發明還提供一種環磷酸腺苷硼酸絡合物的制備方法，包括：將的溶液和包含h3bo3的溶液按照預設比例混合得到環磷酸腺苷-硼酸絡合物。優選地，所述和所述h3bo3的預設比例為1：32。優選地，所述和所述h3bo3的混合時間為24小時。優選地，所述將和h3bo3混合，即得之后，還包括：利用液相色譜質譜分析儀，在260nm的檢測波長下，流動相為a相0.1％甲酸水溶液和b相100％甲醇，運用c18色譜柱在預設梯度洗脫比例下進行梯度洗脫。優選地，所述預設梯度洗脫比例為：0min-2minb相0％，2min-16minb相0％-30％，16min-20minb相30％-90％，20min-25minb相90％，25min-25.1minb相90％-0％，25.1min-30minb相0％。進一步的，為解決上述問題，本發明還提供一種抗腫瘤藥物，包括表皮生長因子受體抑制劑；所述表皮生長因子受體抑制劑包括權利要求1或2所述的環磷酸腺苷-硼酸絡合物。進一步的，為解決上述問題，本發明還提供一種中子俘獲治療的硼劑，所述硼劑包括含硼皮生長因子受體抑制劑；所述含硼皮生長因子受體抑制劑包括權利要求1或2所述的環磷酸腺苷-硼酸絡合物。優選地，所述硼劑還包括含硼核苷類表皮生長因子受體抑制劑；所述含硼核苷類表皮生長因子受體抑制劑包括權利要求1或2所述的環磷酸腺苷-硼酸絡合物。本發明提供一種環磷酸腺苷硼酸絡合物和制備方法，以及抗腫瘤藥物和中子俘獲治療的硼劑，所述環磷酸腺苷硼酸絡合物，作為含硼化合物、含硼的表皮生長因子受體抑制劑，以及含硼核苷表皮生長因子受體抑制劑，綜合利用腫瘤細胞吸收硼劑，以及腫瘤細胞繁殖需要大量核苷的特性，使藥物富集于腫瘤細胞并通過輻射殺死腫瘤細胞，提高了藥物的選擇性，進而極大提高了腫瘤細胞的殺滅效率，避免了現有的針對目前中子俘獲治療中的硼劑大部分僅僅具有單一的功能，僅僅是提高其中子俘獲治療中能選擇性吸收中子能量來殺滅腫瘤單方面效應，腫瘤細胞殺滅效率低，選擇性差問題。本發明目的的實現、功能特點及優點將結合實施例，參照附圖做進一步說明。附圖說明應當理解的是，以下附圖僅示出了本發明的某些實施例，因此不應被看作是對范圍的限定，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他相關的附圖。圖1為本發明環磷酸腺苷硼酸絡合物和制備方法，以及一種抗腫瘤藥物和bnct的硼劑的0.06mmcamp及含不同濃度h3bo3在0.06mmcamp中的lc-ms色譜圖；圖2為本發明環磷酸腺苷硼酸絡合物和制備方法，以及一種抗腫瘤藥物和bnct的硼劑的環磷酸腺苷-硼酸絡合物抑制egfr的自磷酸化32p-atp放射自顯影圖；圖3為本發明環磷酸腺苷硼酸絡合物和制備方法，以及一種抗腫瘤藥物和bnct的硼劑的裸鼠腫瘤組織切片的tunel檢測圖。具體實施方式下面根據具體實施例就本發明的技術方案做進一步的說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。本發明提供一種環磷酸腺苷硼酸絡合物，其特征在于，包括：本發明提供的環磷酸腺苷硼酸絡合物中，包含有h3bo3和等化合物。其中，是一種camp(cyclicadenosinemonophosphate)“腺苷-3',5'-環化一磷酸”的簡稱。亦稱“環磷酸腺苷”“環化腺核苷一磷酸”，“環腺一磷”。以微量存在于動植物細胞和微生物中。體內多種激素作用于細胞時，可促使細胞生成此物，轉而調節細胞的生理活動與物質代謝。作為一種環狀的核苷酸類化合物，camp的細胞毒性和抗藥性較小。上述，h3bo3為硼酸，亦稱為pt，白色粉末狀結晶或三斜軸面的鱗片狀帶光澤結晶。水中呈弱酸性。有滑膩手感，無臭味。溶于水、酒精、甘油、醚類及香精油中。無氣味。味微酸苦后帶甜。與皮膚接觸有滑膩感。露置空氣中無變化。能隨水蒸氣揮發。0.1mol/l水溶液ph為5.1。1g能溶于18ml冷水、4ml沸水、18ml冷乙醇、6ml沸乙醇和4ml甘油。在水中溶解度能隨鹽酸、檸檬酸和酒石酸的加入而增加。相對密度1.4347。熔點184℃(分解)。沸點300℃。上述，是camp與h3bo3的合成產物，在水中以絡合鹽的形式存在，為一種含硼的egfr抑制劑，也是一種含硼核苷類egfr抑制劑。本發明中，所使用的camp為南京澳多福尼生物科技有限公司、純度>98％的camp，所使用的h3bo3為生工生物科技有限公司、純度>98％的h3bo3。本發明提供一種環磷酸腺苷硼酸絡合物和制備方法，以及抗腫瘤藥物和bnct的硼劑，所述環磷酸腺苷硼酸絡合物，作為含硼化合物、含硼的egfr抑制劑，以及含硼核苷類egfr抑制劑，綜合利用腫瘤細胞吸收硼劑，以及腫瘤細胞繁殖需要大量核苷的特性，使藥物富集于腫瘤細胞并通過輻射殺死腫瘤細胞，提高了藥物的選擇性，進而極大提高了腫瘤細胞的殺滅效率，避免了現有的針對目前bnct中的硼劑大部分僅僅具有單一的功能，僅僅是提高其bnct中能選擇性吸收中子能量來殺滅腫瘤單方面效應，腫瘤細胞殺滅效率低，選擇性差問題。優選地，所述環磷酸腺苷硼酸絡合物的絡合形式如下：camp，即為腺苷-3',5'-環化一磷酸，其結構式為camp與h3bo3在水溶液中形成環磷酸腺苷-硼酸絡合物。需要理解的是，絡合物是由一定數量的配體(陰離子或分子)通過配位鍵結合于中心離子(或中性原子)周圍而形成的跟原來組分性質不同的分子或離子。需要理解的是，分子或者離子與金屬離子結合，形成很穩定的新的離子的過程就叫絡合反應，生成的物質叫絡合物。絡合物通常指含有絡離子的化合物，例如絡鹽ag(nh3)2cl、絡酸h2ptcl6、絡堿cu(nh3)4(oh)2等；也指不帶電荷的絡合分子，例如fe(scn)3、co(nh3)3cl3等。配合物又稱絡合物。本發明中，在水溶液中的camp和h3bo3發生絡合反應最終達到平衡狀態，形成絡合鹽，進而成為溶液中包含有camp、h3bo3和的絡合物。上述，進行絡合反應的溶劑為水溶液，水作為載體使水溶性的camp和h3bo3進行反應。此外，也可使用其他溶劑進行本發明中的絡合反應，例如甲醇、甲酸水溶液等。本發明中采用的藥物反應載體為水。本發明還提供一種環磷酸腺苷硼酸絡合物的制備方法，包括：將包含的溶液和包含h3bo3的溶液按照預設比例混合得到環磷酸腺苷-硼酸絡合物。在本發明中，將camp與h3bo3進行混合后，經過絡合反應，形成絡合物。具體的，當h3bo3可以與具有多羥基的化合物進行反應并形成具有高絡合常數的絡合形式。camp上的環戊糖只有一個同側羥基，不能在此處進行絡合，但camp的堿基中的氨基具有堿性性質，對硼酸中氫離子進行吸附從而形成絡合反應并成為絡合鹽的形式。優選地，所述和所述h3bo3的預設比例為1:32。上述，camp與h3bo3預設比例可以為1:1～1:300，在本發明中，優選比例為1:32，摩爾濃度的優選比例為0.06mm：1.92mm。優選地，所述和所述h3bo3的混合時間為24小時。優選地，所述將包含的溶液和包含h3bo3的溶液按照預設比例混合得到環磷酸腺苷-硼酸絡合物之后，還包括：利用液相色譜質譜分析儀，在260nm的檢測波長下，流動相為a相0.1％甲酸水溶液和b相100％甲醇，運用c18色譜柱在預設梯度洗脫比例下進行梯度洗脫。優選地，所述預設梯度洗脫比例為：0min-2minb相0％，2min-16minb相0％-30％，16min-20minb相30％-90％，20min-25minb相90％，25min-25.1minb相90％-0％，25.1min-30minb相0％。將一定比例的camp與h3bo3進行混合后，進行絡合反應，在經過預設的反應時間后，通過lc-ms(液相色譜質譜分析儀)對絡合物的絡合情況進行檢測。實驗儀器和材料：lc-ms：安捷倫6120lc/ms系統(三重四極桿質譜儀)(安捷倫、ca、美國)；數據采集系統：安捷倫masshunter軟件walkuplc/ms和lc系統進行數據采集；色譜柱：c18色譜柱，250mm×4.6mm(廣州綠百草生物科技有限公司，中國)；有機溶劑：甲酸(lc/ms級)、甲醇(lc/ms級)；水：超純水，通過milli-q自制；實驗條件：室溫，檢測波長：260nm；流動相：a相為0.1％甲酸水溶液；b相為100％甲醇；實驗方法：制備不同濃度的樣品，分別為：0.06mmcamp、0.06mmcamp+0.48mmh3bo3、0.06mmcamp+0.96mmh3bo3、0.06mmcamp+1.92mmh3bo3；將以上樣品利用lc-ms按表1中梯度洗脫時間和比例進行洗脫。表1利用lc-ms對磷酸腺苷-硼酸絡合物絡合物進行梯度洗脫的時間及比例檢測結果見圖1，圖1為0.06mmcamp及含不同濃度h3bo3在0.06mmcamp中的lc-ms色譜圖。由圖1中可見，隨著硼酸濃度的逐漸增加，主峰(保留時間9.9-10.1min)峰面積相應地發生逐漸減小的變化。此外環磷酸腺苷-硼酸絡合物包含有更多的羥基且更容易通過甲醇洗脫出來，則導致環磷酸腺苷-硼酸絡合物在lc-ms中具有較小的保留時間。另外，環磷酸腺苷-硼酸絡合物在由camp和h3bo3進行絡合后，極性變大，從而導致樣品在260nm下的吸收變小的情況，由于camp堿基中的氨基具有堿性，能對硼酸中氫離子進行吸附從而形成絡合鹽的形式。導致硼酸的濃度對具有紫外吸收部分的堿基有影響。綜合以上信息，判斷經過絡合反應的絡合物的已經形成。此外，也可通過毛細管電泳分離法進行對環磷酸腺苷-硼酸絡合物的絡合情況進行驗證，camp在h3bo3中，毛細管電泳的遷移率也隨硼酸濃度而變化,可以判斷camp和h3bo3經過絡合反應后形成了絡合物的形式。本發明還提供一種抗腫瘤藥物，包括表皮生長因子受體抑制劑；所述表皮生長因子受體抑制劑包括權利要求1或2所述的環磷酸腺苷-硼酸絡合物。表皮生長因子是一種小肽，由53個氨基酸殘基組成，是類egf大家族的一個成員，是一種多功能的生長因子，在體內體外都對多種組織細胞有強烈的促分裂作用。表皮生長因子受體，也稱為egfr(epithelialgrowthfactorreceptor)，本身具有酪氨酸激酶活性，一旦與表皮生長因子(egf)組合可啟動細胞核內的有關基因，從而促進細胞分裂增殖。胃癌、乳腺癌、膀胱癌和頭頸部鱗癌的egfr表達增高。本發明中所提供的環磷酸腺苷硼酸絡合物，包括以絡合鹽的形式存在。而環磷酸腺苷硼酸絡合物物中的camp和屬于表皮生長因子受體抑制劑(egfr抑制劑)，在中子獲取療法中，可具有對腫瘤細胞的抑制作用，可以抑制egfr修復輻射誘導的dna損傷。本發明還提供一種中子俘獲治療的硼劑，所述硼劑包括含硼表皮生長因子受體抑制劑；所述含硼表皮生長因子受體抑制劑包括權利要求1或2所述的環磷酸腺苷-硼酸絡合物。bnct為中子治療即硼中子俘獲治療(boronneutroncapturetherapy，簡稱bnct)。硼中子俘獲治療通過在腫瘤細胞內的原子核反應來摧毀癌細胞。它的原理是這樣的：先給病人注射一種含硼的特殊化合物，這種化合物與癌細胞有很強的親和力，進入人體后，迅速聚集于癌細胞內，而其他組織內分布很少。一般地，這種含硼化合物對人體無毒無害，本身韓鵬化合物對癌癥也無治療作用。這時，用一種中子射線進行照射，這種射線對人體的損傷不大，但中子與進入癌細胞里的硼能發生很強的核反應，釋放出一種殺傷力極強的射線，這種射線的射程很短，只有一個癌細胞的長度。所以只殺死癌細胞，不損傷周圍組織。這種有選擇的只殺死形狀復雜的癌細胞而不損傷正常組織的技術，稱為硼中子俘獲治療技術。如果10b化合物能特異性完全富集于腫瘤細胞中，則bnct殺滅腫瘤的選擇性將是其他輻射治療的百倍以上。本發明所提供的環磷酸腺苷硼酸絡合物，包括在水中以絡合鹽的形式存在。作為為一種含硼egfr抑制劑，可實現直接與跨膜蛋白egfr結合，在bnct中硼俘獲中子產生的能量將直接破壞重要的細胞膜通道位點，導致細胞膜破裂，繼而導致細胞凋亡。優選地，所述硼劑還包括含硼核苷類表皮生長因子受體抑制劑；所述含硼核苷類表皮生長因子受體抑制劑包括權利要求1或2所述的環磷酸腺苷-硼酸絡合物。本發明所提供的環磷酸腺苷-硼酸絡合物，為camp與h3bo3發生絡合的產物，其中camp為腺苷-3',5'-環化一磷酸，亦稱為環磷酸腺苷，是一種核苷類核苷類表皮生長因子受體抑制劑，通過絡合反應得到環磷酸腺苷-硼酸絡合物，屬于一種含硼核苷類表皮生長因子受體抑制劑。需要理解的是，目前，提高硼劑對腫瘤細胞的特異性選擇的方法包括一種通過核苷進入腫瘤細胞與腫瘤細胞同步繁殖，從而提高對腫瘤細胞的殺傷力的方法。該方法利用腫瘤細胞繁殖時需要大量核苷的原理，將10b連接到核苷上，就能使10b更多進入腫瘤細胞的dna中，由于腫瘤細胞的繁殖速率遠大于正常細胞，這樣硼化合物聚積將在腫瘤細胞的濃度不僅高于正常細胞，而且能聚積在腫瘤細胞核之一關鍵靶點，這將極大提高對腫瘤細胞的殺傷力。本發明提供的環磷酸腺苷硼酸絡合物，在溶劑中以絡合鹽的形式存在。將10b連接至核苷類egfr抑制劑camp上，從而形成了含硼核苷類egfr抑制劑，可使腫瘤細胞對含硼核苷類egfr抑制劑具有選擇性，當腫瘤細胞將含硼核苷類egfr抑制劑吸收后，形成多基因靶點破壞，從而達到選擇性輻射誘導腫瘤細胞凋亡的作用。綜上，本發明所提供的環磷酸腺苷硼酸絡合物，作為一種egfr抑制劑，本身可以特異性直接降低腫瘤細胞增殖，增強腫瘤細胞的輻射敏感性，從而極大加強輻射產生的自由基誘導的凋亡作用；作為一種含硼egfr抑制劑，直接與egfr結合，在bnct中硼俘獲中子產生的能量直接破壞重要的細胞膜通道位點，導致細胞凋亡；作為一種含硼核苷類egfr抑制劑，使腫瘤細胞對含硼核苷類egfr抑制劑具有選擇性，將含硼核苷類egfr抑制劑吸收進入腫瘤細胞的細胞核中，繼而形成多基因靶點破壞，達到選擇性輻射誘導腫瘤細胞凋亡。綜合以上三點的效應，極大的提高硼中子俘獲選擇性殺滅腫瘤的效率，繼而極大的降低輻射劑量。由于大部分腫瘤細胞膜的egfr遠遠高于正常細胞，因此特異性含硼egfr抑制劑將選擇性的富集在腫瘤細胞膜上，達到t/n或t/b≥3。并由于其多重誘導細胞凋亡的作用，因此富集在腫瘤細胞上的含硼egfr抑制劑可以在較低的濃度達到理想的效果。通過32p-atp同位素示蹤技術確定環磷酸腺苷-硼酸絡合物抑制egfr自身磷酸化能力為了確定環磷酸腺苷-硼酸絡合物抑制egfr自身磷酸化能力，本發明中對通過32p-atp同位素示蹤技術篩選egfr自磷酸化抑制效果好的核苷類含硼絡合劑，通過比較，了解和驗證抑制劑的抑制效力情況。實驗儀器和材料：egfr/her1/erbb1(aa668-1210)(重組人表皮生長因子受體/gst嵌合體，由780個氨基酸組成，分子質量89.1kda，sino生物公司(pa，美國)；[γ32p]-atp(3000ci/毫摩爾，10mci/ml，perkinelmer公司，ca，美國)；反應緩沖液(10倍t4pnk反應緩沖液)；camp(生工生物科技有限公司，純度>98％)；環磷酸腺苷-硼酸絡合物，自制；fla7000激光掃描儀(ge，英國)。實驗方法：1、將含2μl0.52mg/ml人類egfr/her1/erbb1反應(aa668-1210)重組人表皮生長因子受體/gst嵌合體，由780個氨基酸組成，分子質量89.1kda，sino生物公司(pa，美國)(>85％純度))，1μl[γ32p]-atp(3000ci/毫摩爾，10mci/ml，perkinelmer公司，ca，美國)和1.2μl反應緩沖液(10倍t4pnk反應緩沖液)加或不加不同濃度的camp(2μl，4μl和8μl5μmcamp(生工生物科技有>98％、純度)以及不同濃度環磷酸腺苷-硼酸絡合物(1μl，2μl和3μl5mmh3bo3+2μl5μmcamp)。每個反應溶液保持12μl體積(去離子水調節)。2、在37℃孵育24h后，各反應液5μl加入7m尿素變性凝膠電泳(15cm×15cm)使用1xtbe緩沖液與10w功率常溫1-2h。3、分離后的凝膠覆蓋著熒光屏的成像板收集32pγ輻射激發光，暴露3h后，熒光屏是利用fla7000激光掃描儀讀取(ge，英國)。實驗結果：如圖2所示；1道顯示egfr+γ-32p-atp；2-4道顯示egfr+32p-atp+camp(不同濃度)反應后；5-7道，顯示egfr+32p-atp+環磷酸腺苷-硼酸絡合物(不同濃度)反應后放射自顯影圖；8道顯示酶活性示蹤對照圖(poly(5tyr)標記；9道顯示放射自顯影強度對照圖(20b的32p-rna，是由rna(20b)和t4pnk在γ-32p-atp存在下反應得到的)。放射自顯影結果如圖2所示，camp和環磷酸腺苷-硼酸絡合物均能抑制egfr自身磷酸化，環磷酸腺苷-硼酸絡合物具有更強的抑制效果。這是由于egfr與atp結合口袋也能與camp結合，導致camp類似化合物能競爭性抑制egfr自磷酸化過程。而由于硼酸是多元弱酸能與堿性的氨基絡合，因此能對camp有一定的絡合作用，同時也能和egfr與atp結合口袋位點的氨基結合，導致環磷酸腺苷-硼酸絡合物更牢固的吸附在egfr與atp結合口袋位點上，從而環磷酸腺苷-硼酸絡合物能更強地競爭性抑制egfr自磷酸化過程。抗腫瘤動物實驗免疫組化分析：實驗材料：裸小鼠移植瘤模型使用非小細胞肺癌a549細胞具有野生型egfr表達的模型(已由廣東實驗動物中心造模)。腫瘤移植后達到5至6mm的直徑，該載瘤裸鼠被用于抗腫瘤實驗。所有裸鼠為雌性，體重19-20g；甲狀腺素鈉(生工生物科技有限公司，純度>98％)；動物分組：上述小鼠隨機分為3個不同給藥劑量的組別：a組：去離子水，即為陰性對照組；b組：去離子水+(環磷酸腺苷-硼酸絡合物溶液)；c組：去離子水+(甲狀腺素鈉+環磷酸腺苷-硼酸絡合物溶液)。所有治療持續四周。口服劑量:b組：camp濃度為1.6mg/ml和h3bo3濃度為16mg/ml(環磷酸腺苷-硼酸絡合物飲用溶液，ph＝7，用naoh溶液，調節ph)；c組：甲狀腺素鈉濃度0.010mg/ml(甲狀腺素鈉+環磷酸腺苷-硼酸絡合物溶液，ph＝7，用naoh溶液調節ph。a組自由飲用水和食物。b組c組為給藥組，飲用藥液保持0.20-0.30ml/天，每只裸鼠控制給藥時間和給藥量。通過環磷酸腺苷-硼酸絡合物抑制非小細胞肺癌細胞a549對裸鼠移植瘤生長的影響：口服4周后，小鼠體重、體溫、腫瘤組織重量等指標見表2。由表1可知，在實驗期間的3組小鼠的體重沒有統計學顯著的變化。其中，c組、b組腫瘤組織質量顯著低于a組，且c組明顯低于b組。c組腫瘤ca含量顯著高于b組和a組。結果表明，環磷酸腺苷-硼酸絡合物可顯著抑制腫瘤生長。c組ca含量較高，在一定程度上，可能由于細胞凋亡的引起鈣流失，導致抑制腫瘤生長。表2腫瘤生長抑制裸鼠移植模型(n＝5)使用t檢驗進行統計分析。所有p值均為雙側p≤0.05被認為有統計學意義。從表2腫瘤生長抑制率可以得出，c組與a組進行對比，腫瘤生長抑制率為2.8(1.50/0.53)，實驗結果優于其他egfrtkis報道(solitdb2005，boehrers2008)的腫瘤抑制劑的腫瘤生長抑制率(2.1，921/438)。從表2中可以得出，ca在c組甲狀腺素鈉+環磷酸腺苷-硼酸絡合物處理的腫瘤組織中的含量顯著提高。細胞內鈣離子與細胞凋亡關系密切。由甲狀腺素鈉-解偶聯劑誘導較高的體溫將導致腫瘤細胞更容易凋亡。因此用甲狀腺素鈉+環磷酸腺苷-硼酸絡合物協同抑制腫瘤生長的機制更有利于腫瘤細胞凋亡。免疫組化凋亡化分析：通過給藥對實驗小鼠進行治療4周后，小鼠體重在同一時間進行稱重記錄于表2中。所有的腫瘤細胞移植瘤在切除后，稱重，并進行比較。部分腫瘤組織通過免疫組化分析的末端脫氧核苷酸轉移酶(tdt)的dutp缺口末端標記(tunel)法檢測腫瘤細胞凋亡。部分腫瘤組織進行檢測ca含量，測定結果記錄在表2中。圖3為裸鼠腫瘤組織切片的免疫組化圖。從圖3中可以得出，tunel陽性細胞在c組腫瘤細胞顯著增加，說明細胞凋亡的過程可以通過egfr抑制劑與解偶聯劑協同增強，從而進一步抑制腫瘤生長。腫瘤組織中鈣含量的icp-ms分析：磨碎的腫瘤組織樣本0.2g加入聚四氟乙烯(ptfe)消化容器。一個體積8ml硝酸加入到每一個樣本，然后，他們被放置在室溫下30分鐘。標本采用微波消解系統消解(ethosone；里程碑，意大利)。消化后的溶液，用去離子水稀釋至50毫升的總量。進一步的分析進行了使用電感耦合等離子體質譜法(nexion300x；珀金埃爾默，美國)。詳細的過程可以參考我們以前的工作(25)。bnct實驗比較：上述a組和c組各3只腫瘤直徑約8mm，停藥12小時后，分別固定腫瘤部位于鈹镅中子源(105個中子/cm2s)1厘米處輻照24小時，吸收劑量根據美國國家標準(ansi/ans-6.1.1-1977)轉化劑量率為1.25×10-6gy/n/cm2shr；因此24小時1cm處裸鼠吸收劑量為1.25×10-6×105×24/(4×3.14×12)＝2.4x10-1gy,由于屏蔽窗作用裸鼠其余部位收到輻射較小。輻照后3天后均不給藥自由食物，比較其輻照前后腫瘤體積變化。表3.輻照前后腫瘤體積變化(n＝3)組別腫瘤組織體積cm3a組0.25±0.08b組0.03±0.10pac<0.05使用t檢驗進行統計分析。所有p值均為雙側p≤0.05被認為有統計學意義。輻照后a組裸鼠(去離子水，即為陰性對照組)3天后腫瘤直徑接近增長1mm，而b組合c組作為給藥組，腫瘤直徑未見明顯變化。說明前期給藥加輻照更能誘導腫瘤凋亡。綜上，環磷酸腺苷-硼酸絡合物作為含硼抑制劑，對腫瘤細胞的生長具有一定的抑制作用。統計分析：統計分析采用t-test；p值進行雙邊比較，p≤0.05被認為有統計學意義。以上僅為本發明的優選實施方式，并非因此限制本發明的專利范圍，凡是利用本發明說明書及附圖內容所作的等效結構或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關的
技術領域：
。當前第1頁12