本發明涉及細胞工程領域，尤其是涉及一種適用于貼壁型cho細胞的無血清培養基及培養方法。

背景技術：

細胞培養基既是培養細胞中供給細胞營養和促使細胞生殖增殖的基礎物質，也是培養細胞生長和繁殖的生存環境，是生物醫藥工程中最重要的組成部分。細胞培養基從使用方式分為基礎培養基和無血清培養基。基礎培養基主要成分有：無機鹽、氨基酸、碳源、維生素、緩沖體系以及其他類微量營養物質，成分明確清晰。基礎培養基不能促進細胞的生長、增殖，需要配合血清使用。血清的主要作用在于給細胞提供生長增殖所需物質，但由于血清中所含的成分復雜，不同產地、批次之間存在質量差異，給動物細胞大規模培養工藝造成了諸多不利影響。同時，通過細胞培養獲得產物的過程，血清的存在是純化的主要障礙，甚至使產物難以成為醫藥產品。

工業大規模化生產中，常用的細胞系包括cho細胞(chinesehamsterovary，中國倉鼠卵巢細胞)、vero細胞、sp2/0細胞、ns0細胞、小鼠雜交瘤細胞等，其中最常見的是cho細胞。截止目前，美國fda批準的63個已上市的抗體藥物表達體系中，使用cho細胞的有33個，占據52％。目前針對cho細胞的無血清培養基開發主要集中在懸浮培養上，鮮有適用于貼壁的無血清培養基。因此，本領域迫切需要開發新的能支持cho細胞貼壁生長的無血清培養基。

技術實現要素：

基于此，有必要提供一種適用于貼壁型cho細胞的無血清培養基及培養方法。

一種適用于貼壁型cho細胞的無血清培養基，包括基礎培養基及添加在所述基礎培養基中的脂類物質、激素類物質、生長因子及貼壁因子；其中，所述脂類物質包含濃度之和大于零的如下各組分：

所述激素類物質包括濃度之和大于零的如下各組分：

所述生長因子包括濃度之和大于零的如下各組分：

所述貼壁因子包括濃度之和大于零的如下各組分：

玻連蛋白0-10mg/l

層粘連蛋白0-10mg/l

纖維連接蛋白0-10mg/l。

在其中一個實施例中，所述脂類物質包括濃度之和大于零的如下各組分：

所述激素類物質包括濃度之和大于零的如下各組分：

所述生長因子包括濃度之和大于零的如下各組分：

所述貼壁因子包括濃度之和大于零的如下各組分：

玻連蛋白0-2mg/l

層粘連蛋白0-2mg/l

纖維連接蛋白0-2mg/l。

本文所述的濃度之和大于零指可以選自多個相應組分中的至少一種，當某種組分被選擇使用時，其濃度不為零，如貼壁因子可以是玻連蛋白、層粘連蛋白與纖維連接蛋白中一種或多種的混合物，當為混合物時，其中相應組分的濃度比如不為零。

在其中一個實施例中，所述基礎培養基中具有如下濃度的各微量元素組分：

在其中一個實施例中，所述基礎培養基中還具有如下濃度的各維生素組分：

在其中一個實施例中，所述基礎培養基中還具有如下濃度的各氨基酸組分：

在其中一個實施例中，所述基礎培養基中還具有如下濃度的各基礎組分：

在其中一個實施例中，所述無血清培養基用nacl調節滲透壓至270-310mosm/kgh2o，用hcl或naoh調節酸堿度至ph為7.2-7.5。

一種適用于貼壁型cho細胞的培養方法，使用上述任一實施例所述的適用于貼壁型cho細胞的無血清培養基對cho細胞進行培養。

在其中一個實施例中，是將cho細胞直接使用所述適用于貼壁型cho細胞的無血清培養基進行培養。

在其中一個實施例中，是使用連續適應方法對所述cho細胞進行培養，具體是：先使用含胎牛血清的培養基與所述適用于貼壁型cho細胞的無血清培養基的混合培養基對所述cho細胞進行傳代培養，且每次傳代后的混合培養基中所述適用于貼壁型cho細胞的無血清培養基的比例均較前一次增加，直至最后只使用所述適用于貼壁型cho細胞的無血清培養基進行培養。

上述適用于貼壁型cho細胞的無血清培養基通過在基礎培養基中添加特定濃度范圍的脂類物質、激素類物質、生長因子及貼壁因子，可以取代傳統的含血清培養基直接用于cho細胞的貼壁生長，并可連續傳代，培養時cho細胞狀態穩定。

另外，進一步通過對基礎培養基中的各組分的含量進行調整，并添加了一些微量元素組分等，使得該適用于貼壁型cho細胞的無血清培養基更加適用于cho細胞的貼壁生長，進一步保證cho細胞貼壁生長的穩定性和生長速率。

附圖說明

圖1為貼壁因子實驗中培養24小時各實驗組細胞生長形態照片，其中a為單獨添加纖維連接蛋白組，b為單獨添加玻連蛋白組培養，c為玻連蛋白和纖維連接蛋白聯用，d為不添加貼壁因子。

圖2為貼壁因子實驗中培養培養60小時各實驗組細胞生長形態照片，其中a為單獨添加纖維連接蛋白，b為單獨添加玻連蛋白組組，c為玻連蛋白和纖維連接蛋白聯用。

圖3為貼壁因子實驗中各實驗組不同培養時期細胞活力變化。

圖4為生長因子實驗各實驗組細胞活力。

圖5為使用本發明無血清培養基傳代至第4代的cho細胞形態圖，此圖中細胞培養60h，其中a為無血清培養基培養細胞，b為5％fbsdmem/f12培養細胞。

圖6為使用無血清培養基進行連續傳代的cho細胞密度，每一代的細胞數目為培養至60h測量的數據。

具體實施方式

為了便于理解本發明，下面將參照相關附圖對本發明進行更全面的描述。附圖中給出了本發明的較佳實施例。但是，本發明可以以許多不同的形式來實現，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發明的公開內容的理解更加透徹全面。

實施例1適用于貼壁型cho細胞的無血清培養基配制

適用于cho細胞貼壁生長的基礎培養基更改了dmem/f12培養基的微量元素、維生素和氨基酸等，其余組分基本與dmem/f12培養基一致，配制所得培養基稱為“基礎培養基”。

基礎培養基在配制時首先將各微量元素組分配制成1000倍濃縮液，組成及含量如下：

將各維生素組分配制成1000倍濃縮液，其中肌醇在使用時為單獨添加，濃度為13.8mg/l，其他具體組成及含量如下：

將各氨基酸組分配成100倍濃縮液，具體組成及含量如下：

將各基礎組分的無機鹽溶液配制成50倍母液，具體組成及含量如下：

葡萄糖和gsh配制培養基時直接添加，含量如下：

葡萄糖3151mg/l

gsh1mg/l。

將上述濃縮液、母液等加入到1l燒杯中，配制成1倍的液體培養基，使用1mol/lnacl調節滲透壓至270-310mosm/kgh2o(若調節之前滲透壓在此范圍內，則無需調節)，并使用1mol/lhcl或者naoh調節ph至7.2-7.5(若調節之前ph在此范圍內，則無需調節)，然后用0.22μm濾膜過濾除菌，即得基礎培養基。

脂類物質配制成濃縮液，稱取10mg硬脂酸、10mg十四酸、10mg亞麻酸、10mg亞油酸、5mg花生四烯酸、1g膽固醇溶解于1mldmso中，待完全溶解后加入至1l0.2％吐溫溶液，并加入0.2％bsa，37℃水浴加熱30分鐘。使用時每升基礎培養基加入5ml該濃縮液。

激素類物質組成成分及含量為：每升基礎培養基中添加10μg地塞米松，3mg乙醇胺，0.5mg腐胺，10mg胰島素。

生長因子組成及含量具體為每升基礎培養基添加0.5mgegf、0.5mgigf。

為保證細胞貼壁，加入貼壁因子，具體是每升基礎培養基添加1mg玻連蛋白、0.33mg纖維連接蛋白。

實施例2

適用于cho細胞貼壁生長的基礎培養基，其“基礎培養基”如實施例1所述。

脂類物質配制成濃縮液，10mg硬脂酸、10mg十四酸、10mg棕櫚酸、10mg亞麻酸、10mg亞油酸、10mg油酸、10mg軟脂酸、5mg花生四烯酸，待完全溶解后加入至1l0.2％吐溫溶液，并加入0.2％bsa，37℃水浴加熱30分鐘。使用時每升基礎培養基加入0.5ml該濃縮液。

激素類物質組成成分及含量為：每升基礎培養基中添加5μg地塞米松，15μg氫化可的松，3mg乙醇胺，0.5mg腐胺，10mg胰島素，0.5mg孕酮，1mg甲狀腺素。

生長因子組成及含量具體為：每升基礎培養基添加0.5mgegf、1mg/lfgf、1mg/lcsf。

貼壁因子組成及含量具體為：每升基礎培養基添加1mg玻連蛋白、0.5mg層粘連蛋白，0.5mg/l纖維連接蛋白。

實施例3

適用于cho細胞貼壁生長的基礎培養基，其“基礎培養基”配制如實施例1所述。

脂類物質配制成濃縮液，10mg硬脂酸、10mg十四酸、10mg棕櫚酸、10mg亞麻酸、10mg亞油酸、10mg油酸、10mg軟脂酸、5mg花生四烯酸，待完全溶解后加入至1l0.2％吐溫溶液，并加入0.2％bsa，37℃水浴加熱30分鐘。使用時每升基礎培養基加入1ml該濃縮液。

激素類物質組成成分及含量為：每升基礎培養基中添加20μg氫化可的松，6mg乙醇胺，1.5mg腐胺，10mg胰島素，1mg孕酮，0.2mg甲狀腺素，0.2mg腎上腺素。

生長因子組成及含量具體為每升基礎培養基添加1mgegf、1mgigf，0.2mg/lfgf、0.2mg/lcsf。

實施例4

細胞適應無血清培養基的方法可分為直接適應和連續適應兩種。直接適應法將細胞直接從含血清培養基中轉入無血清培養基中培養。連續適應法指的是逐步將細胞從有血清培養轉換到無血清培養狀態。與直接適應法相比，連續適應法相對溫和，轉入無血清培養基后細胞生長要優于直接適應法。本實施例采用連續適應法進行細胞培養，操作過程如下：

1.以2倍正常接種密度接種生長活躍的cho細胞培養物到含10％fbs的dmem/f12培養基:無血清培養基體積比為75:25的混合培養基中，傳代培養。

2.當細胞生長穩定后，細胞密度達到2×10⁵-3×10⁵個細胞/ml時，在含10％fbs的dmem/f12培養基:無血清培養基體積比為50:50的混合培養基中傳代培養。

3.以2×10⁵-3×10⁵cell/ml個細胞密度，在含10％fbs的dmem/f12培養基:無血清培養基體積比為25:75的混合培養基中傳代培養。

4.當細胞密度達到1×10⁵-3×10⁵個細胞/ml時，在100％無血清培養基中傳代培養。

5.每隔3到5天，當細胞密度達到1×10⁵-3×10⁵個細胞/ml時，細胞活率在90％時，貯備的適應了無血清培養基的cho細胞培養物應該次傳代培養。

實施例5

為了使細胞更好的貼壁生長，需加入貼壁因子。常用的貼壁因子有玻連蛋白、層粘連蛋白、纖維連接蛋白。本實施例通過玻連蛋白、纖維連接蛋白對其作用及添加量做一闡述。

實驗設為四組，分別為在基礎培養基中單獨添加1mg/l玻連蛋白，單獨添加1mg/l纖維連接蛋白，同時添加1mg/l玻連蛋白和1mg/l纖維連接蛋白，不添加貼壁因子作為對照。由圖1a、1b、1c和1d可看出，在培養至24小時觀察，細胞在單獨添加1mg/l玻連蛋白或者纖維連接蛋白的無血清培養基中均能很好的貼壁生長，而不添加貼壁因子的對照組細胞則開始漂浮凋亡(圖1d)。

培養至48小時觀察，單獨添加纖維連接蛋白細胞開始飄起，培養至60小時，單獨添加粘連蛋白細胞則不能維持貼壁(圖2a)。而單獨添加玻連蛋白及玻連蛋白和粘連蛋白聯用的細胞則繼續保持良好的貼壁狀態(圖2b，2c)。

使用mtt法檢測檢測細胞活力，結果見圖3。在初期(48小時數據)單獨添加粘連蛋白的細胞維持較高的細胞活力，生長速率明顯高于單獨添加玻連蛋白，到后期由于大量細胞失去貼壁能力而凋亡造成細胞活力下降。單獨添加玻連蛋白及兩種蛋白聯用則一直保持較快的生長速率，其中兩種蛋白聯合使用培養至60h時細胞活力最高。

該實驗表明，纖維連接蛋白可維持細胞較好的增殖，玻連蛋白則能維持細胞保持持久的貼壁能力。在使用時應同時玻連蛋白和纖維連接蛋白則可保持較高的細胞增殖和持久的貼壁能力。

實施例6

生長因子添加試驗：在基礎培養基中添加0.5mg/ligf、0.5mg/legf，培養至60h，從顯微鏡中觀察不到差異。mtt實驗檢測細胞活力結果見圖4，單獨添加igf、egf或者同時加入igf、egf均可提高細胞活力。

實施例7

傳代穩定性測試：將馴化至1％血清培養的cho-k1細胞經過胰蛋白酶消化制成細胞懸液。取5ml實施例1配制的無血清培養基置于培養瓶中，將細胞按照1.5×10⁵個細胞/ml的細胞密度進行接種，5％co2，37℃培養。細胞長滿培養瓶，使用無血清培養基進行傳代。以檢測其傳代穩定性，共進行5次傳代。同步使用添加5％fbsdmem/f12培養基進行傳代的cho-k1細胞進行對照。

通過顯微鏡觀察，連續傳代過程中，細胞貼壁良好，培養至60小時可以鋪滿細胞瓶(圖5a、5b)，因此每次均在60小時進行傳代。從圖5可看出無血清培養的細胞形態和5％血清培養的細胞略有差別，培養至60小時，從顯微鏡中觀察細胞量稍低于5％血清培養的細胞。使用mtt檢測細胞活力，結果見圖6，連續傳代過程中，細胞狀態穩定，未發現細胞生長速率下降或者上升。

該實驗結果表明，本發明所提供的無血清培養基可支持cho細胞貼壁生長以及連續傳代。

以上所述實施例的各技術特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特征的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。

以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。