本發明涉及發酵培養基和培養基的優化技術領域，尤其涉及一種固氮類芽孢桿菌1-49的發酵培養基及其優化方法。
背景技術：
隨著生態農業在世界范圍內的迅速興起，由于食品安全、環境保護的需要，國家對肥料、農藥提出了一系列的要求和限制，因此，微生物肥料在農業中的應用越來越受到重視。而芽孢桿菌具有耐儲存，抗逆性強和耐鹽堿等諸多優點，因此，固氮類芽孢桿菌又在微生物肥料制備和應用上起著至關重要的作用。固氮類芽孢桿菌(paenibacillussp.)1-49是一種具有高效固氮酶活性，可以固定空氣中的n2，并把它轉化成供農作物直接利用的nh4+，從而達到減少化肥用量的目的，同時又能有效促進作物生長的類芽孢桿菌。然而，固氮類芽孢桿菌在普通培養基中生長緩慢甚至不生長，或者產芽孢數很低，不利于工業化生產。為了在固氮類芽孢桿菌的工業生產中，降低生產成本而又能提高固氮類芽孢桿菌的產量，特此對固氮類芽孢桿菌的發酵培養基進行研究。
技術實現要素：
本發明的目的在于針對現有技術的不足，而提供一種固氮類芽孢桿菌1-49的發酵培養基及其優化方法，該發酵培養基既能降低生產成本而又能提高固氮類芽孢桿菌的產量。
本發明是通過以下技術方案來實現的。
一種固氮類芽孢桿菌1-49的發酵培養基，它由以下質量的原料制成：豆餅粉15-20g，玉米淀粉5-8g，蔗糖6-10g，酵母粉5-8g，mgso4·7h2o0.2-0.5g，caco31-3g，mnso4·h2o0.01-0.03g，kh2po40.25-0.75g，蒸餾水1000ml，ph7.0-7.5。
優選的，一種固氮類芽孢桿菌1-49的發酵培養基，它由以下質量的原料制成：豆餅粉16-18g，玉米淀粉6-7g，蔗糖8-9g，酵母粉6-7g，mgso4·7h2o0.3-0.4g，caco32.0-3.0g，mnso4·h2o0.02-0.03g，kh2po40.4-0.6g，蒸餾水1000ml，ph7.2-7.4。
更為優選的，一種固氮類芽孢桿菌1-49的發酵培養基，它由以下質量的原料制成：豆餅粉17g，玉米淀粉6g，蔗糖8g，酵母粉6g，mgso4·7h2o0.4g，caco32.0g，mnso4·h2o0.02g，kh2po40.5g，蒸餾水1000ml，ph7.3。
上述固氮類芽孢桿菌1-49的發酵培養基的優化方法，它包括以下步驟：
1)、氮源的確定
在相等的氮含量的條件下，分別用蛋白胨，酵母粉，豆餅粉，(nh4)2so4及不同組合作為氮源配制液體培養基和固體培養基，其它組分不變，相同條件下發酵培養，檢測活菌數和芽孢率，以確定最佳氮源；
2)、碳源的確定
確定氮源后，在保持碳含量不變的條件下，分別用葡萄糖，蔗糖，玉米粉，玉米淀粉，大米粉作為碳源配制液體培養基和固體培養基，其它組分不變，相同條件下發酵培養，檢測活菌數和芽孢率，以確定最佳碳源；
3)、碳氮比的確定
確定好碳源和氮源之后，改變碳源和氮源的比例，分別采用0:1，1:3，1:2，1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，7:1，1:0的c/n比(原料質量比)配制液體培養基和固體培養基，其它組分不變，相同條件下發酵培養，檢測活菌數和芽孢率，以確定最佳的c/n比；
4)、ph的確定
分別配制ph值為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5的液體培養基和固體培養基，其它組分不變，相同條件下發酵培養，檢測活菌數和芽孢率，以確定最佳ph。
其中，步驟1)-步驟4)中發酵培養具體為：接種環接種1環固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養基中，轉速為180-220r/min，28-36℃培養22-24h，進行擴大培養和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養基中，28-36℃培養46-48h，制得固體種。
其中，步驟1)-步驟4)中發酵培養具體為：接種環接種1環固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養基中，轉速為200r/min，32℃培養24h，進行擴大培養和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養基中，32℃培養48h，制得固體種。
其中，步驟1)-步驟4)中液體培養基的其他組分包括以下質量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。
其中，步驟1)-步驟4)中固體培養基的其他組分包括以下質量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g瓊脂，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。
其中，步驟1)-步驟4)中活菌的檢測方法為：取3-5ml固體種溶解在45ml無菌水中，搖散得10-1濃度稀釋液，再用5ml無菌吸管吸取5ml10-1濃度稀釋液到45ml無菌水中，搖勻得10-2濃度稀釋液，取0.1ml10-2濃度稀釋液到無菌營養瓊脂培養基中并涂勻，37℃培養48h，然后數培養皿上的菌落數，即可檢測得活菌。
其中，步驟1)-步驟4)中芽孢率的檢測方法為：取3-5ml固體種溶解在45ml無菌水中，轉速為200r/min，20min搖散得10-1濃度稀釋液，再用5ml無菌吸管吸取5ml10-1濃度稀釋液到45ml無菌水中，搖勻得10-2濃度稀釋液，依次這樣稀釋到10-3濃度稀釋液，取0.01ml10-3濃度稀釋液滴到載玻片上，涂勻，用酒精燈烘干，然后用酚酞染色1min，用清水沖洗，再用酒精燈烘干，鏡檢，找幾個清晰的畫面，數畫面中的芽孢數和桿數，取其平均值，即可得到其芽孢率。
本發明的有益效果為：(1)本發明以固氮類芽孢桿菌1-49為出發菌株，通過單因素和正交試驗進行固體發酵的培養基和培養條件的優化，以提高固氮類芽孢桿菌1-49產孢量；優化后的培養基配料，能直接應用于固氮類芽孢桿菌1-49發酵，大大提高生產的優質化；固氮類芽孢桿菌1-49作為一種新的微生物菌劑，在未來的農業生產中，將有良好的應用前景。
(2)本發明針對固氮類芽孢桿菌1-49的發酵配方進行優化，克服了固氮芽孢桿菌芽孢產量低的困難，大大提高了產孢量，增強了固氮類芽孢桿菌1-49的應用效果；
(3)本發明針對固氮類芽孢桿菌1-49的發酵配方進行優化能夠有效地降低生產成本。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
固氮類芽孢桿菌(paenibacillussp.)1-49編號為strainnumbercgmccno.4966，是類芽孢桿菌屬的一種。呈桿狀，周生鞭毛，能運動。革蘭氏陽性菌，芽孢橢圓到梭狀。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，好氧菌。
實施例1
本實施例的固氮類芽孢桿菌1-49的發酵培養基的優化方法，它包括以下步驟：
1)、氮源的確定
在相等的氮含量的條件下，分別用蛋白胨，酵母粉，豆餅粉，(nh4)2so4及不同組合作為氮源配制液體培養基和固體培養基，其它組分不變，相同條件下發酵培養；液體培養基的其他組分包括以下質量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5；固體培養基的其他組分包括以下質量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g瓊脂，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。
發酵培養具體為：用接種環接種1環固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養基中，轉速為180r/min，28℃培養24h，進行擴大培養和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養基中，28℃培養48h，制得固體種。
檢測固體種的活菌數和芽孢率，以確定最佳氮源。實驗結果如表1所示。
表1氮源對固氮類芽孢桿菌生長的影響
通過對比觀察，可以發現(nh4)2so4不利于培養基產芽孢，發酵48h后的培養基的芽孢率都比較低；而蛋白胨和酵母粉同時作為氮源對培養基的活菌數和芽孢率都有提高。
2)、碳源的確定
確定氮源后，在保持碳含量不變的條件下，分別用葡萄糖，蔗糖，玉米粉，玉米淀粉，大米粉作為碳源配制液體培養基和固體培養基，其它組分不變，相同條件下發酵培養；液體培養基的其他組分包括以下質量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5；固體培養基的其他組分包括以下質量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g瓊脂，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。
發酵培養具體為：用接種環接種1環固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養基中，轉速為180r/min，28℃培養24h，進行擴大培養和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養基中，28℃培養48h，制得固體種。
檢測固體種的活菌數和芽孢率，以確定最佳碳源。實驗結果如表2所示。
表2碳源對固氮類芽孢桿菌生長的影響
通過對比觀察，葡萄糖有利于固氮類芽孢桿菌的生長，但產生芽孢少，發酵后培養基的芽孢率低。綜合考慮發酵后培養基中的活菌數和芽孢率，可以明顯地得出玉米淀粉和蔗糖同時作為碳源時對固氮類孢芽桿菌的生長和產芽孢都有利，適合于大規模化的工業化生產。
3)、碳氮比的確定
確定好碳源和氮源之后，改變碳源和氮源的比例，分別采用0:1，1:3，1:2，1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，7:1，1:0的c/n比(原料質量比)配制液體培養基和固體培養基，其它組分不變，相同條件下發酵培養；液體培養基的其他組分包括以下質量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5；固體培養基的其他組分包括以下質量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g瓊脂，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。
發酵培養具體為：用接種環接種1環固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養基中，轉速為180r/min，28℃培養24h，進行擴大培養和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養基中，28℃培養48h，制得固體種。
檢測固體種的活菌數和芽孢率，以確定最佳c/n比。實驗結果如表3所示。
表3碳氮比對固氮類芽孢桿菌生長的影響
通過對比觀察，可以發現當發酵培養基中只有碳源和氮源中的一種時，發酵后檢測出的活菌數和芽孢率都不是很理想，都很低，不利于生產；而如果培養基中碳源和氮源都有時，可以看出發酵后培養基的芽孢率相差不大。而對于大規模化的工業生產，需要的是活菌數和芽孢率都高的生產配方，當碳氮比為2:1可以滿足生產需求。
4)、ph的確定
分別配制ph值為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5的液體培養基和固體培養基，其它組分不變，相同條件下發酵培養；液體培養基的其他組分包括以下質量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5；固體培養基的其他組分包括以下質量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g瓊脂，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。
發酵培養具體為：用接種環接種1環固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養基中，轉速為180r/min，28℃培養24h，進行擴大培養和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養基中，28℃培養48h，制得固體種。
檢測固體種的活菌數和芽孢率，以確定最佳ph。實驗結果如表4所示。
表4ph對固氮類芽孢桿菌生長的影響
通過對比觀察，可以發現ph值對培養基的芽孢率影響不大，基本上都在90％左右，ph值主要是影響培養基的活菌數。綜合表中的活菌數和芽孢率兩項指標，得出ph值為7.5時培養基的活菌數和芽孢率都很高，符合規模化的工業生產。
步驟1)-步驟4)中活菌的檢測方法為：取3-5ml固體種溶解在45ml無菌水中，搖散得10-1濃度稀釋液，再用5ml無菌吸管吸取5ml10-1濃度稀釋液到45ml無菌水中，搖勻得10-2濃度稀釋液，取0.1ml10-2濃度稀釋液到無菌營養瓊脂培養基中并涂勻，37℃培養48h，然后數培養皿上的菌落數，即可檢測得活菌。
步驟1)-步驟4)中芽孢率的檢測方法為：取3-5ml固體種溶解在45ml無菌水中，轉速為200r/min，20min搖散得10-1濃度稀釋液，再用5ml無菌吸管吸取5ml10-1濃度稀釋液到45ml無菌水中，搖勻得10-2濃度稀釋液，依次這樣稀釋到10-3濃度稀釋液，取0.01ml10-3濃度稀釋液滴到載玻片上，涂勻，用酒精燈烘干，然后用酚酞染色1min，用清水沖洗，再用酒精燈烘干，鏡檢，找幾個清晰的畫面，數畫面中的芽孢數和桿數，取其平均值，即可得到其芽孢率。
本發明采用單因素實驗和正交實驗相結合的方法，對固氮類芽孢桿菌的固體發酵培養基進行研究，確定固氮類芽孢桿菌的最佳發酵培養基為：豆餅粉15g，玉米淀粉5g，蔗糖6g，酵母粉5g，mgso4·7h2o0.2g，caco31g，mnso4·h2o0.01g，kh2po40.25g，ph7.5，蒸餾水1000ml。
實施例2
本實施例的固氮類芽孢桿菌1-49的發酵培養基的優化方法，它包括以下步驟：
1)、氮源的確定
在相等的氮含量的條件下，分別用蛋白胨，酵母粉，豆餅粉，(nh4)2so4及不同組合作為氮源配制液體培養基和固體培養基，其它組分不變，相同條件下發酵培養；液體培養基的其他組分包括以下質量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5；固體培養基的其他組分包括以下質量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g瓊脂，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。
發酵培養具體為：用接種環接種1環固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養基中，轉速為200r/min，32℃培養24h，進行擴大培養和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養基中，32℃培養48h，制得固體種。
檢測固體種的活菌數和芽孢率，以確定最佳氮源。實驗結果如表1所示。
表1氮源對固氮類芽孢桿菌生長的影響
通過對比觀察，可以發現(nh4)2so4不利于培養基產芽孢，發酵48h后的培養基的芽孢率都比較低；而蛋白胨和酵母粉同時作為氮源對培養基的活菌數和芽孢率都有提高。
2)、碳源的確定
確定氮源后，在保持碳含量不變的條件下，分別用葡萄糖，蔗糖，玉米粉，玉米淀粉，大米粉作為碳源配制液體培養基和固體培養基，其它組分不變，相同條件下發酵培養；液體培養基的其他組分包括以下質量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5；固體培養基的其他組分包括以下質量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g瓊脂，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。
發酵培養具體為：用接種環接種1環固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養基中，轉速為200r/min，32℃培養24h，進行擴大培養和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養基中，32℃培養48h，制得固體種。
檢測固體種的活菌數和芽孢率，以確定最佳碳源。實驗結果如表2所示。
表2碳源對固氮類芽孢桿菌生長的影響
通過對比觀察，葡萄糖有利于固氮類芽孢桿菌的生長，但產生芽孢少，發酵后培養基的芽孢率低。綜合考慮發酵后培養基中的活菌數和芽孢率，可以明顯地得出玉米淀粉和蔗糖同時作為碳源時對固氮類孢芽桿菌的生長和產芽孢都有利，適合于大規模化的工業化生產。
3)、碳氮比的確定
確定好碳源和氮源之后，改變碳源和氮源的比例，分別采用0:1，1:3，1:2，1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，7:1，1:0的c/n比(原料質量比)配制液體培養基和固體培養基，其它組分不變，相同條件下發酵培養；液體培養基的其他組分包括以下質量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5；固體培養基的其他組分包括以下質量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g瓊脂，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。
發酵培養具體為：用接種環接種1環固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養基中，轉速為200r/min，32℃培養24h，進行擴大培養和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養基中，32℃培養48h，制得固體種。
檢測固體種的活菌數和芽孢率，以確定最佳c/n比。實驗結果如表3所示。
表3碳氮比對固氮類芽孢桿菌生長的影響
通過對比觀察，可以發現當發酵培養基中只有碳源和氮源中的一種時，發酵后檢測出的活菌數和芽孢率都不是很理想，都很低，不利于生產；而如果培養基中碳源和氮源都有時，可以看出發酵后培養基的芽孢率相差不大。而對于大規模化的工業生產，需要的是活菌數和芽孢率都高的生產配方，當碳氮比為2:1可以滿足生產需求。
4)、ph的確定
分別配制ph值為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5的液體培養基和固體培養基，其它組分不變，相同條件下發酵培養；液體培養基的其他組分包括以下質量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5；固體培養基的其他組分包括以下質量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g瓊脂，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。
發酵培養具體為：用接種環接種1環固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養基中，轉速為200r/min，32℃培養24h，進行擴大培養和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養基中，32℃培養48h，制得固體種。
檢測固體種的活菌數和芽孢率，以確定最佳ph。實驗結果如表4所示。
表4ph對固氮類芽孢桿菌生長的影響
通過對比觀察，可以發現ph值對培養基的芽孢率影響不大，基本上都在90％左右，ph值主要是影響培養基的活菌數。綜合表中的活菌數和芽孢率兩項指標，得出ph值為7.5時培養基的活菌數和芽孢率都很高，符合規模化的工業生產。
步驟1)-步驟4)中活菌的檢測方法為：取3-5ml固體種溶解在45ml無菌水中，搖散得10-1濃度稀釋液，再用5ml無菌吸管吸取5ml10-1濃度稀釋液到45ml無菌水中，搖勻得10-2濃度稀釋液，取0.1ml10-2濃度稀釋液到無菌營養瓊脂培養基中并涂勻，37℃培養48h，然后數培養皿上的菌落數，即可檢測得活菌。
步驟1)-步驟4)中芽孢率的檢測方法為：取3-5ml固體種溶解在45ml無菌水中，轉速為200r/min，20min搖散得10-1濃度稀釋液，再用5ml無菌吸管吸取5ml10-1濃度稀釋液到45ml無菌水中，搖勻得10-2濃度稀釋液，依次這樣稀釋到10-3濃度稀釋液，取0.01ml10-3濃度稀釋液滴到載玻片上，涂勻，用酒精燈烘干，然后用酚酞染色1min，用清水沖洗，再用酒精燈烘干，鏡檢，找幾個清晰的畫面，數畫面中的芽孢數和桿數，取其平均值，即可得到其芽孢率。
本發明采用單因素實驗和正交實驗相結合的方法，對固氮類芽孢桿菌的固體發酵培養基進行研究，確定固氮類芽孢桿菌的最佳發酵培養基為：豆餅粉17g，玉米淀粉6g，蔗糖8g，酵母粉6g，mgso4·7h2o0.4g，caco32.0g，mnso4·h2o0.02g，kh2po40.5g，蒸餾水1000ml，ph7.5。
實施例3
本實施例的固氮類芽孢桿菌1-49的發酵培養基的優化方法，它包括以下步驟：
1)、氮源的確定
在相等的氮含量的條件下，分別用蛋白胨，酵母粉，豆餅粉，(nh4)2so4及不同組合作為氮源配制液體培養基和固體培養基，其它組分不變，相同條件下發酵培養；液體培養基的其他組分包括以下質量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5；固體培養基的其他組分包括以下質量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g瓊脂，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。
發酵培養具體為：用接種環接種1環固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養基中，轉速為220r/min，36℃培養22h，進行擴大培養和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養基中，36℃培養46h，制得固體種。
檢測固體種的活菌數和芽孢率，以確定最佳氮源。實驗結果如表1所示。
表1氮源對固氮類芽孢桿菌生長的影響
通過對比觀察，可以發現(nh4)2so4不利于培養基產芽孢，發酵48h后的培養基的芽孢率都比較低；而蛋白胨和酵母粉同時作為氮源對培養基的活菌數和芽孢率都有提高。
2)、碳源的確定
確定氮源后，在保持碳含量不變的條件下，分別用葡萄糖，蔗糖，玉米粉，玉米淀粉，大米粉作為碳源配制液體培養基和固體培養基，其它組分不變，相同條件下發酵培養；液體培養基的其他組分包括以下質量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5；固體培養基的其他組分包括以下質量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g瓊脂，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。
發酵培養具體為：用接種環接種1環固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養基中，轉速為220r/min，36℃培養22h，進行擴大培養和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養基中，36℃培養46h，制得固體種。
檢測固體種的活菌數和芽孢率，以確定最佳碳源。實驗結果如表2所示。
表2碳源對固氮類芽孢桿菌生長的影響
通過對比觀察，葡萄糖有利于固氮類芽孢桿菌的生長，但產生芽孢少，發酵后培養基的芽孢率低。綜合考慮發酵后培養基中的活菌數和芽孢率，可以明顯地得出玉米淀粉和蔗糖同時作為碳源時對固氮類孢芽桿菌的生長和產芽孢都有利，適合于大規模化的工業化生產。
3)、碳氮比的確定
確定好碳源和氮源之后，改變碳源和氮源的比例，分別采用0:1，1:3，1:2，1:1，2:1，3:1，4:1，5:1，7:1，1:0的c/n比(原料質量比)配制液體培養基和固體培養基，其它組分不變，相同條件下發酵培養；液體培養基的其他組分包括以下質量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5；固體培養基的其他組分包括以下質量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g瓊脂，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。
發酵培養具體為：用接種環接種1環固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養基中，轉速為220r/min，36℃培養22h，進行擴大培養和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養基中，36℃培養46h，制得固體種。
檢測固體種的活菌數和芽孢率，以確定最佳c/n比。實驗結果如表3所示。
表3碳氮比對固氮類芽孢桿菌生長的影響
通過對比觀察，可以發現當發酵培養基中只有碳源和氮源中的一種時，發酵后檢測出的活菌數和芽孢率都不是很理想，都很低，不利于生產；而如果培養基中碳源和氮源都有時，可以看出發酵后培養基的芽孢率相差不大。而對于大規模化的工業生產，需要的是活菌數和芽孢率都高的生產配方，當碳氮比為2:1可以滿足生產需求。
4)、ph的確定
分別配制ph值為5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5的液體培養基和固體培養基，其它組分不變，相同條件下發酵培養；液體培養基的其他組分包括以下質量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5；固體培養基的其他組分包括以下質量的原料：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gnacl，18g瓊脂，1000ml蒸餾水，ph7.2-7.5。
發酵培養具體為：用接種環接種1環固氮類芽孢桿菌1-49試管菌種到液體培養基中，轉速為220r/min，36℃培養22h，進行擴大培養和活化，制得液體種，然后再取1ml液體種接種到固體培養基中，36℃培養46h，制得固體種。
檢測固體種的活菌數和芽孢率，以確定最佳ph。實驗結果如表4所示。
表4ph對固氮類芽孢桿菌生長的影響
通過對比觀察，可以發現ph值對培養基的芽孢率影響不大，基本上都在90％左右，ph值主要是影響培養基的活菌數。綜合表中的活菌數和芽孢率兩項指標，得出ph值為7.5時培養基的活菌數和芽孢率都很高，符合規模化的工業生產。
步驟1)-步驟4)中活菌的檢測方法為：取3-5ml固體種溶解在45ml無菌水中，搖散得10-1濃度稀釋液，再用5ml無菌吸管吸取5ml10-1濃度稀釋液到45ml無菌水中，搖勻得10-2濃度稀釋液，取0.1ml10-2濃度稀釋液到無菌營養瓊脂培養基中并涂勻，37℃培養48h，然后數培養皿上的菌落數，即可檢測得活菌。
步驟1)-步驟4)中芽孢率的檢測方法為：取3-5ml固體種溶解在45ml無菌水中，轉速為200r/min，20min搖散得10-1濃度稀釋液，再用5ml無菌吸管吸取5ml10-1濃度稀釋液到45ml無菌水中，搖勻得10-2濃度稀釋液，依次這樣稀釋到10-3濃度稀釋液，取0.01ml10-3濃度稀釋液滴到載玻片上，涂勻，用酒精燈烘干，然后用酚酞染色1min，用清水沖洗，再用酒精燈烘干，鏡檢，找幾個清晰的畫面，數畫面中的芽孢數和桿數，取其平均值，即可得到其芽孢率。
本發明采用單因素實驗和正交實驗相結合的方法，對固氮類芽孢桿菌的固體發酵培養基進行研究，確定固氮類芽孢桿菌的最佳發酵培養基為：豆餅粉20g，玉米淀粉8g，蔗糖10g，酵母粉8g，mgso4·7h2o00.5g，caco33g，mnso4·h2o0.03g，kh2po40.75g，ph7.5，蒸餾水1000ml。
最后應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對本發明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細地說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。