專利名稱：一種復合芽孢桿菌粉活菌含量的快速計數方法
技術領域：
本發明涉及微生物含量測定的方法，具體涉及一種復合芽孢桿菌粉活菌含量的快速計數方法。
背景技術：
芽孢桿菌制劑是一種無毒副作用、無藥物殘留的綠色產品，其產品中含有的活菌是以內生孢子的形式存在，是畜禽水產養殖中常用的飼料添加劑和水質改良劑。然而，缺少質量標準是芽孢桿菌制劑在開發研制中存在的主要問題之一，而導致質量標準缺乏的最大的問題之一就是活菌數與標簽不符，有些甚至難以檢測到活菌。因此，穩定可靠的芽孢桿菌制劑的計數方法無疑對芽孢桿菌制劑正常生產及其質量控制具有重要的意義。目前，顯微鏡直接計數法、平板菌落計數法等芽孢桿菌制劑的傳統計數方法由于存在一些缺陷，使計數結果不穩定。例如，顯微鏡直接計數法無法區分死菌體和活菌體，計數結果是死菌體和活菌體的總和；平板菌落計數法操作繁雜，而且計數結果易受多種因素的影響。

發明內容
本發明的目的在于提供一種復合芽孢桿菌粉活菌含量的快速計數方法。本發明提供的一種復合芽孢桿菌粉活菌含量的快速計數方法，包括如下步驟1)樣品的制備無菌操作隨機稱取復合芽孢桿菌粉lg，加入盛有9mL無菌營養肉湯的50mL具塞離心管中，于漩渦振蕩儀上振蕩混勻制成1 10的稀釋母液，設3個平行樣；2)樣品的稀釋取3個平行樣，分別進行如下處理無菌操作用ImL玻璃移液管吸取ImL 1 10的稀釋母液，加入盛有9mL無菌營養肉湯的50mL具塞離心管中，混勻成 1 IO2的稀釋液，這樣依次稀釋，分別得到1 103、1 IO4U IO5U IO6U 107、 1 IO8U IO9U IO10U IO11U IO12U IO13稀釋度的稀釋液，每次稀釋時必須更換ImL玻璃移液管；3)培養將 1 10 的稀釋母液以及 1 102、1 IO3U IO4U IO5U 106、 1 IO7U IO8U IO9U IO10U IO11U IO12U IO13 的稀釋液置于轉速為 200r/ min、溫度為35 37°C的溫控搖床中，培養18_24h ；以盛有9mL無菌營養肉湯的50mL具塞離心管作為對照；4)測定以盛有9mL無菌營養肉湯的50mL具塞離心管作為對照，無菌操作用ImL 玻璃移液管吸取0. ImL培養18-24h變渾濁的各稀釋液采用khaeffer-Fulton氏染色法進行芽孢染色，顯微鏡觀察有無綠色的芽孢；顯微鏡觀察有綠色芽孢、且變渾濁的稀釋液所對應的稀釋度的倒數即為復合芽孢桿菌粉的活菌含量(cfu/g)。本發明可快速、準確，直接觀察測定出復合芽孢桿菌粉的活菌含量。其原理是將待測樣品經過適當稀釋之后，其中的芽孢桿菌充分分散成單個細胞，然后在無菌營養肉湯中通過孵育培養而生長繁殖，從而形成肉眼可見的渾濁液，再進一步通過芽孢染色確定最大稀釋度渾濁液中含有大量的芽孢，最后確定待測樣品的活菌總數。它與顯微鏡直接計數法相比因能夠區分死菌體和活菌體而使活菌總數的測定結果更準確，與平板菌落計數法相比，操作更簡單，更簡易快速，更適合無很強專業技能的廣大芽孢桿菌制劑生產從業者采用。
具體實施例方式實施例11材料與方法1.1實驗材料復合芽孢桿菌粉BCM，通過平板計數法測定的活菌含量為SXlO^cfu/g，購于山西省衛氏魚康實業有限公司；ImL玻璃移液管、無菌玻璃涂布棒、營養瓊脂平板、營養肉湯、 50mL具塞離心管、載玻片、5%孔雀石綠水溶液、0.5%蕃紅水溶液，購于國藥集團化學試劑有限公司；ImL玻璃移液管、盛有9mL無菌營養肉湯的50mL具塞離心管，于121°C條件下滅菌20min;生化培養箱，購于日本三洋公司；漩渦振蕩儀，購于上海淇特分析儀器有限公司； 溫控搖床，購于美國i^orma kientific公司。1.2樣品的制備無菌操作隨機稱取復合芽孢桿菌粉BCM 1 g，加入盛有9mL無菌營養肉湯的50mL具塞離心管中，于漩渦振蕩儀上振蕩混勻制成樣品，即1 10的稀釋母液。實驗共有3個平行樣。1.3樣品的稀釋取3個平行樣，分別進行如下處理無菌操作用ImL玻璃移液管吸取ImL 1 10 的稀釋母液，加入盛有9mL無菌營養肉湯的50mL具塞離心管中，混勻成1 IO2的稀釋液，這樣依次稀釋，分別得到 1 IO3U IO4U IO5U IO6U IO7U IO8U 109、 1 IO10U IO11U IO12U IO13等稀釋度的稀釋液，每次稀釋時必須更換ImL玻璃移液管。1.4 培養將1 10 的稀釋母液以及 1 102、1 IO3U IO4U IO5U IO6U 107、 1 IO8U IO9U IO10U IO11U IO12U IO13 等的稀釋液置于轉速為 200r/min、 溫度為35 37°C的溫控搖床中，培養18 Mh。以盛有9mL無菌營養肉湯的50mL具塞離心管作為對照。1. 5 測定以盛有9mL無菌營養肉湯的50mL具塞離心管作為對照，無菌操作用ImL玻璃移液管吸取0. ImL培養18 24h變渾濁的各稀釋液采用Schaeffer-Fulton氏染色法進行芽孢染色，顯微鏡觀察有無綠色的芽孢。顯微鏡觀察有綠色芽孢、且變渾濁的稀釋液所對應的稀釋度的倒數即為復合芽孢桿菌粉BCM的活菌含量(cfu/g)。2實驗結果實驗結果見表1。實驗結果表明，稀釋度為1 IO11的復合芽孢桿菌粉BCM在培養 18 24h后渾濁，而且芽孢染色后顯微鏡下可觀察到綠色的芽孢；而稀釋度分別為1 IO12 和1 IO13的復合芽孢桿菌粉BCM在培養18 24h后均未渾濁，而且芽孢染色后顯微鏡下也未觀察到綠色的芽孢。因此，復合芽孢桿菌粉BCM的活菌含量為IO11 1012cfu/g，與通過平板計數法測定的活菌含量相比，數量級相同，可作為復合芽孢桿菌粉BCM活菌總數快速定量的方法。表1復合芽孢桿菌粉BCM有效活菌總數的測定結果
權利要求
1. 一種復合芽孢桿菌粉活菌含量的快速計數方法，其特征在于，包括如下步驟1)樣品的制備無菌操作隨機稱取復合芽孢桿菌粉lg，加入盛有9mL無菌營養肉湯的 50mL具塞離心管中，于漩渦振蕩儀上振蕩混勻制成1 10的稀釋母液；2)樣品的稀釋無菌操作用ImL玻璃移液管吸取ImL1 10的稀釋母液，加入盛有 9mL無菌營養肉湯的50mL具塞離心管中，混勻成1 IO2的稀釋液，這樣依次稀釋，分別得到 1 IO3U IO4U IO5U IO6U IO7U IO8U IO9U IO10U IO11U 1012、 1 IO13稀釋度的稀釋液；3)培養將1 10 的稀釋母液以及 1 IO2U IO3U IO4U IO5U IO6U 107、 1 IO8U IO9U IO10U IO11U IO12U IO13 的稀釋液置于轉速為 200r/min、溫度為35 37°C的溫控搖床中，培養18-24h ；以盛有9mL無菌營養肉湯的50mL具塞離心管作為對照；4)測定以盛有9mL無菌營養肉湯的50mL具塞離心管作為對照，用ImL玻璃移液管無菌操作吸取0. ImL培養18-24h變渾濁的各稀釋液采用khaeffer-Fulton氏染色法進行芽孢染色，顯微鏡觀察有無綠色的芽孢；顯微鏡觀察有綠色芽孢、且變渾濁的稀釋液所對應的稀釋度的倒數即為復合芽孢桿菌粉的活菌含量。
全文摘要
本發明提供了一種復合芽孢桿菌粉活菌含量的快速計數方法，是將待測樣品經過適當稀釋之后，其中的芽孢桿菌充分分散成單個細胞，然后在無菌營養肉湯中通過孵育培養而生長繁殖，從而形成肉眼可見的渾濁液，再進一步通過芽孢染色確定最大稀釋度渾濁液中含有大量的芽孢，最后確定待測樣品的活菌總數。本發明與顯微鏡直接計數法相比因能夠區分死菌體和活菌體而使活菌總數的測定結果更準確，與平板菌落計數法相比，操作更簡單，更簡易快速，很適合廣大芽孢桿菌制劑生產從業者采用。
文檔編號C12Q1/06GK102392070SQ201110347608
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月7日 優先權日2011年11月7日
發明者何珊, 衛若鵬, 曹海鵬 申請人:山西衛氏魚康實業有限公司, 山西省生物獸藥飼料工程技術研究中心(有限公司)