本發(fā)明屬于微生物工程領(lǐng)域，特別涉及到一株用于高溫發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的非谷氨酸依賴型產(chǎn)生菌及其發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
：γ-聚谷氨酸（poly-γ-glutamicacid）是一種由l-谷氨酸和d-谷氨酸通過α-氨基和γ-羧基以酰胺鍵結(jié)合而成的微生物源陰離子型胞外高分子化合物。γ-聚谷氨酸分子量可達(dá)1,000kda以上，其分子主鏈上大量游離親水性羧基使其具有水溶性聚羧酸性質(zhì)，并可作為活性位點(diǎn)進(jìn)行廣泛的化學(xué)修飾，因此賦予其強(qiáng)吸水保濕、絮凝性和優(yōu)良的可塑性；另一方面，γ-聚谷氨酸分子主鏈中的酰胺鍵易被酶解，降解產(chǎn)物可被生物體吸收，因此賦予其優(yōu)良的生物降解性和生物相容性，對(duì)人體和環(huán)境無毒害。這些優(yōu)良生化特性使得γ-聚谷氨酸及其衍生物可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)業(yè)和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域。γ-聚谷氨酸最早于1937年在炭疽芽孢桿菌（bacillusanthracis）莢膜成分中發(fā)現(xiàn)，該物質(zhì)能伴隨著菌體細(xì)胞的裂解而釋放到培養(yǎng)液中。1942年，γ-聚谷氨酸被發(fā)現(xiàn)可作為枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）發(fā)酵產(chǎn)物自由分泌到培養(yǎng)液中，隨后多株芽孢桿菌屬菌株被報(bào)道可合成胞外γ-聚谷氨酸。γ-聚谷氨酸生產(chǎn)菌株依據(jù)發(fā)酵培養(yǎng)基中是否需要添加谷氨酸，分為谷氨酸依賴型菌株和谷氨酸非依賴型菌株兩類。其中，研究比較深入地谷氨酸依賴型菌株有：b.subtilisf-2-01、b.subtilisifo3335、b.subtilisnx-2、b.licheniformisatcc9945a、b.licheniformiswx-02，在此類菌株中谷氨酸既是γ-聚谷氨酸合成誘導(dǎo)劑，又是γ-聚谷氨酸合成底物。谷氨酸非依賴型菌株有：b.subtilistam-4、b.licheniformisa35、b.amyloliquefaciensll3，在此類菌株中底物谷氨酸主要是利用葡萄糖或蔗糖等糖質(zhì)原料經(jīng)糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)轉(zhuǎn)化而來。目前，γ-聚谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)研究主要使用谷氨酸依賴型菌株，并采用合成培養(yǎng)基，其中碳氮源和l-谷氨酸是必需組分，ph值一般維持在6.5~7.5，溫度30℃~40℃，產(chǎn)物產(chǎn)量與適宜的碳氮比、谷氨酸添加量以及生物量密切相關(guān)，各種無機(jī)鹽比例對(duì)γ-聚谷氨酸高效生產(chǎn)也至關(guān)重要。相對(duì)于谷氨酸依賴型菌株而言，谷氨酸非依賴型菌株的報(bào)道和研究相對(duì)較少，主要是由于其γ-聚谷氨酸產(chǎn)量相對(duì)較低。但是，從發(fā)酵原料成本的角度考慮，谷氨酸非依賴型菌株可以利用廉價(jià)的糖質(zhì)原料作為底物生產(chǎn)γ-聚谷氨酸，而不需要使用價(jià)格相對(duì)較高的谷氨酸或谷氨酸鹽作為底物。因此，如果能夠選育獲得一株γ-聚谷氨酸產(chǎn)量較高的谷氨酸非依賴型菌株，將從節(jié)約原料成本角度為γ-聚谷氨酸工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供另外一種選擇。此外，γ-聚谷氨酸產(chǎn)生菌的發(fā)酵溫度一般在30℃~40℃，然而在發(fā)酵過程中，由于微生物生長和代謝會(huì)產(chǎn)生大量的熱量，尤其是在夏天或者南方地區(qū)，需要提供大量的冷卻水對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行熱交換從而保持發(fā)酵過程所需要的特定溫度。因此，如果能夠從菌種角度出發(fā)，選育獲得一株能夠在較高溫度下發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的菌株，將從節(jié)約發(fā)酵工藝成本的層面為γ-聚谷氨酸工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供另外一種選擇。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于高溫發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的非谷氨酸依賴型產(chǎn)生菌及其發(fā)酵方法。該枯草芽孢桿菌可在較高溫度下利用糖質(zhì)原料作為底物發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸，最高發(fā)酵溫度可為55℃，發(fā)酵時(shí)間48~72h，產(chǎn)量最高可達(dá)15g/l以上。本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌可不依賴于外源性谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸，與以往的谷氨酸依賴型菌株相比，能夠有效降低發(fā)酵生產(chǎn)成本，且具有發(fā)酵溫度高、營養(yǎng)要求簡單和培養(yǎng)方法簡便易行等優(yōu)點(diǎn)，這些優(yōu)良特性為工業(yè)化生產(chǎn)提供了有利條件。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：本發(fā)明谷氨酸非依賴型產(chǎn)生菌，分類命名枯草芽孢桿菌gxg-5bacillussubtilisgxg-5，保藏編號(hào)為cctccno：m2017083，保藏日期為2017年3月6日，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國武漢武漢大學(xué)。該培養(yǎng)物的存活性保藏中心于2017年3月16日檢測(cè)結(jié)果為存活。所述枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）gxg-5，具有如下性狀特征：菌體形態(tài)特征：在固體斜面培養(yǎng)基上50℃培養(yǎng)16h后掃描電子顯微鏡觀察，菌體呈桿狀，大小0.7-0.9×2.0-3.0μm，可運(yùn)動(dòng)，革蘭氏染色陽性。在固體斜面培養(yǎng)基上50℃培養(yǎng)30h后芽孢染色觀察，可見明顯芽孢。菌落形態(tài)特征：在固體平板培養(yǎng)基上50℃培養(yǎng)16h后，菌落圓形、隆起、表面濕潤、菌落直徑0.5-1.0cm、平板倒置時(shí)菌落呈懸滴狀；培養(yǎng)30h后，菌落中心開始變干、扁平，邊緣分泌粘稠物。固體平板培養(yǎng)基的濃度組成為：葡萄糖22.5g/l，大豆蛋白胨3g/l，nh4cl17g/l，kno35g/l，nacl5g/l，k2hpo42.5g/l，瓊脂15g/l，ph值7.0，蒸餾水配制。生理生化如下表所示檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果生長情況糖利用28℃+葡萄糖+37℃+果糖+50℃+蔗糖+55℃+麥芽糖+ph5.0+乳糖+ph9.0+甘露醇+nacl5%+檸檬酸-nacl10%+吲哚試驗(yàn)-nacl15%-vp試驗(yàn)+厭氧生長-淀粉水解+過氧化氫酶+干酪素水解+卵磷脂酶+明膠液化+酪氨酸水解酶+葡萄糖產(chǎn)氣-苯丙氨酸脫氫酶-尿素酶水解+注：所列表中的“+”為生長良好或呈陽性；“-”為不生長或呈陰性。16srdna序列分析：利用通用擴(kuò)增引物1540r（5'-aggaggtgatccagccgca-3’）和7f（5'-cagagtttgatcctggct-3’）對(duì)該菌株16srdna進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，測(cè)得序列長度1447bp。將所得序列提交至genbank數(shù)據(jù)庫，獲得序列編號(hào)genbankid:ky711183，與genbank所提供的基因序列進(jìn)行blast比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明該菌株與枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）同源性為99%。結(jié)合菌體、菌落形態(tài)特征、生理生化特征和16srdna序列分析，可以將該菌株分類鑒定為枯草芽孢桿菌，具體為枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）gxg-5。本發(fā)明另外還提供了所述枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）gxg-5在高溫發(fā)酵條件下，利用糖質(zhì)原料作為底物發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法，該方法包括如下步驟：（1）菌種活化、保藏將枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）gxg-5接于固體斜面培養(yǎng)基上，45~50℃培養(yǎng)12-24h；所述固體斜面培養(yǎng)基的濃度組成為：葡萄糖10~15g/l，酵母膏2~5g/l，胰蛋白胨3~6g/l，nacl3~6g/l，瓊脂15~20g/l，ph值6.5~7.5，蒸餾水配制。（2）種子液制備將上述斜面上1~3cm2的菌苔接入裝有30ml液體種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速160~200rpm，45~50℃培養(yǎng)12~24h至菌株對(duì)數(shù)生長中期；所述液體種子培養(yǎng)基濃度組成為：葡萄糖10~20g/l，酵母膏2~5g/l，胰蛋白胨5~10g/l，nacl5~10g/l，ph值6.5~7.5，蒸餾水配制。（3）液體搖瓶發(fā)酵將種子液接入滅菌后的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量1~10%，搖瓶裝液量20~80ml/250ml，搖床轉(zhuǎn)速160~250rpm，40~55℃培養(yǎng)48~72h；所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基濃度組成為：糖質(zhì)原料10~50g/l，氮源5~30g/l，kno32~10g/l，nacl2~10g/l，k2hpo40.5~5g/l，ph值6.5~7.5，蒸餾水配制。所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中糖質(zhì)原料為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖和糖蜜中的任意一種或幾種混合物。所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源為大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、nh4cl、(nh4)2so4和nh4no3中的任意一種或幾種混合物。（4）γ-聚谷氨酸提取純化收集成熟的發(fā)酵液，加入2~5倍體積蒸餾水稀釋，利用孔徑為0.45μm微濾膜去除菌體，上清液采用截留分子量為10~50kda超濾膜濃縮至原發(fā)酵液體積的30~50%，加入2~4倍體積的工業(yè)級(jí)乙醇進(jìn)行沉淀，收集沉淀，冷凍干燥得到γ-聚谷氨酸成品。本發(fā)明所獲得的γ-聚谷氨酸產(chǎn)品具有如下理化性質(zhì)：（1）本發(fā)明產(chǎn)品易溶于水，不溶于甲醇、乙醇或丙酮等有機(jī)溶劑。（2）本發(fā)明產(chǎn)品茚三酮顯色反應(yīng)呈陰性，鹽酸水解產(chǎn)物茚三酮反應(yīng)呈陽性；鹽酸完全水解產(chǎn)物經(jīng)薄層層析分析，氨基酸組分只有谷氨酸；上述說明本產(chǎn)品為谷氨酸的均聚物。（3）本發(fā)明產(chǎn)品在216nm下具有特征吸收峰，在280nm下無吸收峰；雙縮脲顯色反應(yīng)呈陰性；上述說明本產(chǎn)品沒有典型的肽鏈結(jié)構(gòu)。（4）本發(fā)明產(chǎn)品經(jīng)核磁共振（1h-nmr）和紅外光譜檢測(cè)，圖譜結(jié)果顯示與γ-聚谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)構(gòu)相符。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：1.本發(fā)明分離獲得一株谷氨酸非依賴型的γ-聚谷氨酸產(chǎn)生菌，可以利用廉價(jià)的糖質(zhì)原料作為底物生產(chǎn)γ-聚谷氨酸，而不需要外源添加價(jià)格相對(duì)較高的谷氨酸或谷氨酸鹽作為底物，從節(jié)約原料成本角度為γ-聚谷氨酸工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供了另外一種選擇。2.該枯草芽孢桿菌可在較高溫度下利用糖質(zhì)原料作為底物發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸，最高發(fā)酵溫度可為55℃，發(fā)酵時(shí)間48~72h，產(chǎn)量最高可達(dá)15g/l以上，營養(yǎng)要求簡單、培養(yǎng)方法簡便易行，在大規(guī)模生產(chǎn)中能夠大大節(jié)約冷卻水的消耗，對(duì)降低發(fā)酵工藝成本具有明顯的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。附圖說明圖1為γ-聚谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的核磁共振（1h-nmr）圖。圖2為本發(fā)明的產(chǎn)品γ-聚谷氨酸的核磁共振（1h-nmr）圖。圖3為γ-聚谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的紅外譜圖。圖4為本發(fā)明的產(chǎn)品γ-聚谷氨酸的紅外譜圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不局限于實(shí)施例表示的范圍。實(shí)施例1：枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）gxg-5的分離（1）制備菌懸液：稱取1g土壤樣品接入裝有50ml無菌生理鹽水的250ml三角瓶中，室溫下磁力攪拌25分鐘，制成菌懸液，于100℃處理15min。（2）菌懸液稀釋、菌落挑?。簩⑸鲜鏊镁鷳乙翰捎?0倍稀釋法梯度稀釋成不同濃度的菌懸液，選擇105、106、107倍的菌懸液100μl涂布于固體平板培養(yǎng)基上；50℃恒溫培養(yǎng)20h后，挑取菌落表面粘稠、用牙簽?zāi)芴羝鹄z的單菌落。（3）劃線純化：用平整、圓滑的接種環(huán)，在無菌操作條件下，將獲得的單菌落在固體平板培養(yǎng)基上連續(xù)劃線純化，50℃恒溫培養(yǎng)15h后，挑取平板上的純種單菌落至試管斜面，經(jīng)培養(yǎng)后保存。（4）搖瓶發(fā)酵：用平整、圓滑的接種環(huán)挑取斜面上1cm2的菌苔接入裝有30ml液體種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速160rpm，50℃培養(yǎng)10h至菌株對(duì)數(shù)生長中期，將種子液按2%接種量接入裝有50ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速160rpm，50℃培養(yǎng)48h。（5）γ-聚谷氨酸產(chǎn)量測(cè)定：收集上述搖瓶發(fā)酵液，加入3倍體積蒸餾水稀釋，利用孔徑為0.45μm微濾膜去除菌體，上清液采用截留分子量為20kda超濾膜濃縮至原發(fā)酵液體積的50%，加入4倍體積的工業(yè)級(jí)乙醇進(jìn)行沉淀，收集沉淀，冷凍干燥得到γ-聚谷氨酸成品。取適量成品準(zhǔn)確稱取其重量，換算成發(fā)酵液中γ-聚谷氨酸產(chǎn)量。其中，固體平板培養(yǎng)基的濃度組成為：葡萄糖22.5g/l，大豆蛋白胨3g/l，nh4cl17g/l，kno35g/l，nacl5g/l，k2hpo42.5g/l，瓊脂15g/l，ph值7.0，蒸餾水配制。液體種子培養(yǎng)基濃度組成為：葡萄糖10g/l，酵母膏5g/l，胰蛋白胨10g/l，nacl10g/l，ph值7.0，蒸餾水配制。液體發(fā)酵培養(yǎng)基濃度組成為：葡萄糖22.5g/l，大豆蛋白胨3g/l，nh4cl17g/l，kno35g/l，nacl5g/l，k2hpo42.5g/l，ph值7.0，蒸餾水配制。本發(fā)明依此方法篩選獲得一株用于高溫發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的谷氨酸非依賴型菌株——枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）gxg-5。實(shí)施例2：枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）gxg-5的鑒定（1）菌體形態(tài)特征在固體斜面培養(yǎng)基上50℃培養(yǎng)16h后電鏡觀察，菌體呈桿狀，大小0.7-0.9×2.0-3.0μm，可運(yùn)動(dòng)，革蘭氏染色陽性。在固體斜面培養(yǎng)基上50℃培養(yǎng)30h后芽孢染色觀察，可見明顯芽孢。（2）菌落形態(tài)特征在固體平板培養(yǎng)基上50℃培養(yǎng)16h后，菌落圓形、隆起、表面濕潤、菌落直徑0.5-1.0cm、平板倒置時(shí)菌落呈懸滴狀；培養(yǎng)30h后，菌落中心開始變干、扁平，邊緣分泌粘稠物。固體平板培養(yǎng)基的濃度組成為：葡萄糖22.5g/l，大豆蛋白胨3g/l，nh4cl17g/l，kno35g/l，nacl5g/l，k2hpo42.5g/l，瓊脂15g/l，ph值7.0，蒸餾水配制。（3）生理生化如下表所示（4）16srdna序列分析利用通用擴(kuò)增引物1540r（5'-aggaggtgatccagccgca-3’）和7f（5'-cagagtttgatcctggct-3’）對(duì)該菌株16srdna進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，測(cè)得序列長度1447bp。將所得序列提交至genbank數(shù)據(jù)庫，獲得序列編號(hào)genbankid:ky711183，與genbank所提供的基因序列進(jìn)行blast比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明該菌株與枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）同源性為99%。結(jié)合菌體、菌落形態(tài)特征、生理生化特征和16srdna序列分析，可以將該菌株分類鑒定為枯草芽孢桿菌，具體為枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）gxg-5。以下為本發(fā)明所述枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）gxg-5的16srdna核苷酸序列信息：實(shí)施例3：枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）gxg-5發(fā)酵產(chǎn)物γ-聚谷氨酸的鑒定與表征（1）化學(xué)組成分析：取本發(fā)明產(chǎn)品500mg于水解管中，加入10ml6m鹽酸，抽真空，105℃水解8h，冷卻后，用6m氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph至7.0，得到水解液，定容至100ml并經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后備用。將上述水解液進(jìn)行薄層層析分析，展開劑：正丁醇：乙酸：嘧啶：水=4：1：1：2（v/v），顯色劑：0.2%茚三酮溶于丙酮溶液。結(jié)果顯示，水解液在硅膠板上只有一個(gè)斑點(diǎn)，且與谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液一致，說明本產(chǎn)品為谷氨酸的聚合物。（2）紅外光譜分析：將少量本發(fā)明產(chǎn)品與干燥kbr粉末混合后，研磨壓片，利用傅里葉紅外光譜儀在4000~400cm-1范圍內(nèi)掃描分析其紅外吸收波譜。結(jié)果顯示，與γ-聚谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品紅外圖譜基本一致。（3）核磁共振波譜分析：用d2o溶解本發(fā)明產(chǎn)品制備成0.2mg/ml溶液，利用傅里葉核磁共振波譜儀在600mhz條件下進(jìn)行氫譜掃描分析。結(jié)果顯示，與γ-聚谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品核磁圖譜基本一致。（4）肽鏈結(jié)構(gòu)分析：用去離子水將本發(fā)明產(chǎn)品制備成1mg/ml水溶液，利用紫外可見分光光譜儀在190~390nm波長范圍下掃描分析產(chǎn)物紫外吸收波譜，結(jié)果顯示，本發(fā)明產(chǎn)品在216nm下具有特征吸收峰，在280nm下無吸收峰。此外，將本發(fā)明樣品5mg溶于1ml去離子水中，緩慢滴加雙縮脲試劑（naoh溶液（0.1g/ml）：cuso4溶液（0.01g/ml）=5：1，v/v），結(jié)果顯示雙縮脲顯色反應(yīng)呈陰性。上述結(jié)果說明本發(fā)明產(chǎn)品沒有典型的肽鏈結(jié)構(gòu)。（5）溶解性分析：取本發(fā)明樣品5mg，結(jié)果顯示其易溶于水，不溶于甲醇、乙醇或丙酮等有機(jī)溶劑。實(shí)施例4：枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）gxg-5高溫發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸（1）菌種活化、保藏：將枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）gxg-5接于固體斜面培養(yǎng)基上，50℃培養(yǎng)16h；所述固體斜面培養(yǎng)基的濃度組成為：葡萄糖10g/l，酵母膏5g/l，胰蛋白胨5g/l，nacl5g/l，瓊脂15g/l，ph值7.0，蒸餾水配制。（2）種子液制備：將上述斜面上1cm2的菌苔接入裝有30ml液體種子培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，50℃培養(yǎng)16h至菌株對(duì)數(shù)生長中期；所述液體種子培養(yǎng)基濃度組成為：葡萄糖10g/l，酵母膏5g/l，胰蛋白胨10g/l，nacl10g/l，ph值7.0，蒸餾水配制。（3）液體搖瓶發(fā)酵：將種子液接入滅菌后的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量5%，搖瓶裝液量50ml/250ml，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，55℃培養(yǎng)48h；所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基濃度組成為：葡萄糖30g/l，大豆蛋白胨5g/l，nh4no325g/l，kno35g/l，nacl5g/l，k2hpo42.5g/l，ph值7.0，蒸餾水配制。（4）γ-聚谷氨酸產(chǎn)量測(cè)定：收集上述搖瓶發(fā)酵液，加入3倍體積蒸餾水稀釋，利用孔徑為0.45μm微濾膜去除菌體，上清液采用截留分子量為20kda超濾膜濃縮至原發(fā)酵液體積的50%，加入4倍體積的工業(yè)級(jí)乙醇進(jìn)行沉淀，收集沉淀，冷凍干燥得到γ-聚谷氨酸成品。取適量成品準(zhǔn)確稱取其重量，換算成發(fā)酵液中γ-聚谷氨酸產(chǎn)量為15.6±0.5g/l。核苷酸序列表<110>廣西大學(xué)<120>一種用于高溫發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的非谷氨酸依賴型產(chǎn)生菌及其發(fā)酵方法<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>1447<212>dna<213>枯草芽孢桿菌（bacillussubtilis）<400>1acttcccccaatcatctgtcccaccttcggcggctggctcctaaaaggttacctcaccga60cttcgggtgttacaaactctcgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgta120ttcaccgcggcatgctgatccgcgattactagcgattccagcttcacgcagtcgagttgc180agactgcgatccgaactgagaacagatttgtgggattggcttaacctcgcggtttcgctg240ccctttgttctgtccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgattt300gacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaactga360atgctggcaactaagatcaagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacga420cacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtcactctgcccccgaaggggacgtcctatc480tctaggattgtcagaggatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaa540ccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagtcttgcgac600cgtactccccaggcggagtgcttaatgcgttagctgcagcactaaggggcggaaaccccc660taacacttagcactcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgttcgctc720cccacgctttcgctcctcagcgtcagttacagaccagagagtcgccttcgccactggtgt780tcctccacatctctacgcatttcaccgctacacgtggaattccactctcctcttctgcac840tcaagttccccagtttccaatgaccctccccggttgagccgggggctttcacatcagact900taagaaaccgcctgcgagccctttacgcccaataattccggacaacgcttgccacctacg960tattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggt1020accgccctattcgaacggtacttgttcttccctaacaacagagctttacgatccgaaaac1080cttcatcactcacgcggcgttgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctac1140tgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctc1200aggtcggctacgcatcgttgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcgccg1260cgggtccatctgtaagtggtagccgaagccaccttttatgtttgaaccatgcggttcaaa1320caaccatccggtattagccccggtttcccggagttatcccagtcttacaggcaggttacc1380cacgtgttactcacccgtccgccgctaacatcagggagcaagctcccatctgtccgctcg1440acttgca1447當(dāng)前第1頁12