本發明屬于微生物領域，具體涉及一種谷氨酸棒桿菌及其構建方法與應用，尤其是涉及一種產l-脯氨酸的谷氨酸棒桿菌及其構建方法與應用
背景技術：
：l-脯氨酸(l-proline)，化學名稱為l-吡咯烷酮羧酸，分子式為c5h9no2，相對分子質量為115。脯氨酸是構成蛋白質的基本單位，是組成人體蛋白質的21種氨基酸之一。脯氨酸廣泛應用于醫藥、食品及調味劑、農業和有機化學。作為氨基酸類藥物，脯氨酸是復方氨基酸大輸液原料之一，用于營養不良、蛋白質缺乏癥、嚴重胃腸道疾病，燙傷及外科手術后的蛋白質補充。脯氨酸可以調節細胞的滲透壓，穩定蛋白的結構。隨著研究不斷深入，脯氨酸的應用范圍也進一步擴大。因此，脯氨酸的生產具有非常廣泛的應用前景。目前，l-脯氨酸的生產方法有三種：化學合成法、酶解法、微生物發酵法。化學合成法和酶解法由于原料來源受限制、生產成本高、污染環境，難以實現大規模工業化生產。微生物發酵法具有原料成本低、反應條件溫和、容易實現大規模生產等優點，成為目前生產l-脯氨酸主流方法。棒桿菌是用于生產l-氨基酸的代表性微生物，特別是谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)、嗜乙酰乙酸棒桿菌(corynebacteriumacetoacidophlum)和黃色短桿菌(breviabacteriumflavum)。為了改善這些微生物的l-脯氨酸生產能力，可以通過傳統誘變進行菌株選育，以解除代謝調節中的反饋抑制和阻遏，達到過量積累l-脯氨酸的目的。以黃色短桿菌(brevibacteriumflavum)2247為出發菌，吉永獲得了一株l-異亮氨酸缺陷型變異株no.14-5，經72小時培養可生成1.2％-1.5％的脯氨酸。張偉國以嗜乙酰乙酸棒桿菌(corynebacteriumacetoacidophlum)atcc13870為出發菌株，經亞硝基胍(ntg)誘變處理及結構類似物定向選育，獲得了一株l-脯氨酸高產菌zq-3，在含16％葡萄糖的培養基中，搖瓶發酵72h，產酸率為5.4％。但目前l-脯氨酸的菌種的發酵性能仍較差、l-脯氨酸的轉化率仍較低，仍不能滿足大規模工業化生產的需求。技術實現要素：有鑒于此，本發明的目的在于針對現有技術存在的缺陷，提供一種l-脯氨酸產量高的谷氨酸棒桿菌及其構建方法與應用。為實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案：本發明提供了一種谷氨酸棒桿菌，其細胞內編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的gnd基因的第361位絲氨酸突變為苯丙氨酸。6-磷酸葡糖酸脫氫酶是戊糖磷酸途徑中產nadph的關鍵酶之一。本發明對戊糖磷酸途徑中的gnd基因進行點突變，使得6-磷酸葡糖酸脫氫酶的第361位的絲氨酸被苯丙氨酸替代，而減弱6-磷酸葡糖酸脫氫酶的變構調節，從而增強nadph再生能力，為脯氨酸合成提供充足的nadph，進而提高脯氨酸的產量。所述谷氨酸棒桿菌通過使用gnd基因而被修飾使得所述菌株的產生l-脯氨酸的能力與所述谷氨酸棒桿菌的未修飾的菌株相比增強。在一個實施方案中，本發明提供了一種谷氨酸棒桿菌mhz-0701，其細胞內gnd基因的第361位絲氨酸突變為苯丙氨酸，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.13757。本發明提供了所述谷氨酸棒桿菌的構建方法，包括：步驟a、構建編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的gnd基因的第361位絲氨酸突變為苯丙氨酸的重組質粒；步驟b、將重組質粒轉化谷酸棒桿菌mhz-0700，用含卡那霉素的選擇培養基篩選轉化子，將篩得的轉化子用液體腦心浸液培養基培養；步驟c、培養物稀釋后涂布在含有10％蔗糖的固體腦心浸液培養基上，培養獲得重組菌株。優選的，所述載體為pk18mobsacb。即步驟a所述重組質粒為pk18mobsacb-gnd361。在一些具體實施方案中，步驟a所述構建編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的gnd基因的第361位絲氨酸突變為苯丙氨酸的重組質粒的方法具體包括以下步驟：1)以atcc13870基因組為模板，以gnd-1f/gnd-1r引物對進行pcr擴增得到上游片段gnd361-up；以atcc13870基因組為模板，以gnd-2f/gnd-2r引物對進行pcr擴增得到下游片段gnd361-dn；2)以gnd361-up、gnd361-dn兩片段混合物為模板，以gnd-1f/gnd-2r引物對進行pcr擴增，得到突變的gnd361片段；3)將gnd361片段和pk18mobsacb載體分別用ecori、bamhi進行雙酶切，酶切產物以t4dnaligase進行連接，轉化trans1t1感受態細胞，獲得重組質粒pk18mobsacb-gnd361。mhz-0700是一株性能優異的脯氨酸生產菌，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.13756。本發明步驟b以脯氨酸生產菌mhz-0700為出發菌株，重組質粒pk18mobsacb-gnd361以電穿孔方法轉化mhz-0700感受態細胞，其中突變的基因由于同源性被插入到mhz-0700染色體中。在含有卡那霉素的選擇培養基上篩選轉化子，將篩得的轉化子培養，轉化子發生第二次重組，通過基因交換將載體序列從基因組中除去。其中優選的，步驟b所述含卡那霉素的選擇培養基中卡那霉素的濃度為15mg/l；所述選擇培養基為固體腦心浸液培養基。進一步優選的，步驟b所述培養為33℃、220rpm振蕩培養過夜。本領域技術人員可以理解所述培養過夜可以為培養8-14h。本發明所述構建方法步驟c將培養物稀釋后涂布在含有10％蔗糖的固體腦心浸液培養基上，培養獲得重組菌株。其中，所述稀釋為將培養物做連續梯度稀釋。在一些實施例中所述稀釋具體為將培養物從10-2連續稀釋至10-4。步驟c所述固體腦心浸液培養基為腦心浸液培養基添加1.5％的瓊脂。優選的，步驟c所述培養為33℃靜置培養48h。利用本發明獲得的谷氨酸棒桿菌進行發酵生產，可獲得l-脯氨酸的有效積累，為l-脯氨酸的工業化生產奠定基礎。因此本發明還提供了所述谷氨酸棒桿菌在發酵生產l-脯氨酸中的應用。優選的，所述谷氨酸棒桿菌為保藏編號為cgmccno.13757的谷氨酸棒桿菌mhz-0701。進一步的，本發明還提供了一種l-谷氨酰胺的生產方法，將細胞內編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的gnd基因的第361位絲氨酸突變為苯丙氨酸的谷氨酸棒桿菌接種于種子培養基進行擴繁，然后將擴繁后的培養物轉入發酵培養基發酵。其中，優選的，所述谷氨酸棒桿菌為保藏編號為cgmccno.13757的谷氨酸棒桿菌mhz-0701。優選的，所述種子培養基中玉米漿2.5％，葡萄糖1.0％，硫酸銨0.4％，硫酸鎂0.05％，磷酸二氫鉀0.1％，尿素0.1％，caco30.5％，余量為水，ph7.2。優選的，所述發酵培養基中玉米漿0.6％，葡萄糖12.0％，硫酸銨3.7％，硫酸鎂0.05％，磷酸二氫鉀0.1％，caco34％，vh70μg/l，vb1·hcl80μg/l，余量為水，ph7.2。優選的，所述發酵條件為33℃，發酵72h。由上述技術方案可知，本發明提供了一種谷氨酸棒桿菌及其構建方法與應用。本發明所述谷氨酸棒桿菌其細胞內編碼6-磷酸葡糖酸脫氫酶的gnd基因的第361位絲氨酸突變為苯丙氨酸。本發明所述谷氨酸棒桿菌對戊糖磷酸途徑中的gnd基因進行點突變，使得6-磷酸葡糖酸脫氫酶的第361位的絲氨酸被苯丙氨酸替代，而減弱6-磷酸葡糖酸脫氫酶的變構調節，從而增強nadph再生能力，為脯氨酸合成提供充足的nadph，進而提高脯氨酸的產量。實驗表明本發明所述谷氨酸棒桿菌為l-脯氨酸高產菌株，能有效積累l-脯氨酸，提高l-脯氨酸的產量，為l-脯氨酸的工業化生產奠定了基礎。生物保藏說明mhz-0701，分類命名：谷氨酸棒桿菌，corynebacteriumglutamicum，于2017年3月15日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號為cgmccno.13757。mhz-0700，分類命名：谷氨酸棒桿菌，corynebacteriumglutamicum，于2017年3月15日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號為cgmccno.13756。具體實施方式本發明公開了一種谷氨酸棒桿菌及其構建方法與應用。本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發明內容、精神和范圍內對本文所述的方法進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。為了進一步理解本發明，下面結合具體實施例對本發明進行詳細闡述，如無特殊說明，本發明實施例中所涉及的試劑均為市售產品，均可以通過商業渠道購買獲得。其中，本實驗涉及的l-脯氨酸生產菌種的親代菌株為atcc13870，菌種的拉丁學名是corynebacteriumacetoacidophlumatcc13870。所述液體腦浸心培養基購自thermofisheroxoid。實施例1：重組質粒pk18mobsacb-gnd361的構建及在mhz-0700中引入點突變(1)pk18mobsacb-gnd361質粒的構建以atcc13870基因組為模板，以gnd-1f/gnd-1r引物對進行pcr擴增得到上游片段gnd361-up；以atcc13870基因組為模板，以gnd-2f/gnd-2r引物對(如表1所示)進行pcr擴增得到下游片段gnd361-dn。以gnd361-up、gnd361-dn兩片段混合物為模板，以gnd-1f/gnd-2r引物對進行pcr擴增，得到突變的gnd361片段。gnd361片段用ecori、bamhi進行雙酶切，pk18mobsacb用同樣的酶雙酶切。兩酶切產物以t4dnaligase進行連接，轉化trans1t1感受態細胞，獲得重組質粒pk18mobsacb-gnd361。(2)mhz-0700中引入點突變按照谷棒經典方法(c.glutamicumhandbook,charpter23)制備mhz-0700感受態細胞。重組質粒pk18mobsacb-gnd361以電穿孔方法轉化該感受態細胞，并在含有15mg/l卡那霉素的固體腦浸心培養基上篩選轉化子，其中感興趣的基因由于同源性被插入到染色體中。將篩得的轉化子過夜培養于普通液體腦心浸液培養基中，培養溫度為33℃，回轉搖床220rpm振蕩培養。此培養過程中，轉化子發生第二次重組，通過基因交換將載體序列從基因組中除去。將培養物做連續梯度稀釋(10-2連續稀釋至10-4)，稀釋液涂布在含有10％蔗糖的普通固體腦心浸液培養基上，33℃靜置培養48h。蔗糖培養基上長出的菌株在其基因組中不攜帶插入的載體序列。通過pcr擴增目的序列，核苷酸測序分析，獲得目的突變菌株命名為mhz-0701。表1引物序列引物核苷酸序列seqidno：gnd-1factgaattcaagatggtccacaacggcatcga1gnd-1ragttgttctcgtcgaagccagccttgatc2gnd-2fgatcaaggctggcttcgacgagaacaact3gnd-2rcgcggatcctatcgacgcccacctccggcgaa4實施例2：l-脯氨酸基因工程菌發酵生產l-脯氨酸1、培養基種子活化培養基：酵母提取物1％，蛋白胨1％，氯化鈉0.5％，葡萄糖0.5％，瓊脂2％，ph7.2。種子培養基：玉米漿2.5％，葡萄糖1.0％，硫酸銨0.4％，硫酸鎂0.05％，磷酸二氫鉀0.1％，尿素0.1％，caco30.5％，ph7.2。發酵培養基：玉米漿0.6％，葡萄糖12.0％，硫酸銨3.7％，硫酸鎂0.05％，磷酸二氫鉀0.1％，caco34％，vh70μg/l，vb1·hcl80μg/l，ph7.2。2、mhz-0701搖瓶發酵生產l-脯氨酸(1)種子培養：挑取mhz-0700、mhz-0701斜面種子1環接至裝有20ml種子培養基的500ml三角瓶中，33℃、220r/min振蕩培養16-22h；(2)發酵培養：將2ml種子液接種至裝有20ml發酵培養基的500ml三角瓶中，33℃、220r/min振蕩培養72h。(3)取1ml發酵液離心(12000rpm，2min)，收集上清液，用hplc檢測工程菌與對照菌發酵液中的l-脯氨酸含量，其濃度如下表2所示。表2l-脯氨酸含量檢測菌株名稱mhz-0700(出發菌)mhz-0701(工程菌)l-脯氨酸濃度g/l30.338.1如上表中所示，出發菌株mhz-0700的l-脯氨酸的積累量為30.3g/l，而本發明的工程菌mhz-0701的l-脯氨酸產量為38.1g/l，比出發菌株產量提高1.26倍，由此可見gnds361f突變利于脯氨酸的積累。sequencelisting<110>廊坊梅花生物技術開發有限公司<120>一種谷氨酸棒桿菌及其構建方法與應用<130>mp1705479<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>32<212>dna<213>人工序列<400>1actgaattcaagatggtccacaacggcatcga32<210>2<211>29<212>dna<213>人工序列<400>2agttgttctcgtcgaagccagccttgatc29<210>3<211>29<212>dna<213>人工序列<400>3gatcaaggctggcttcgacgagaacaact29<210>4<211>32<212>dna<213>人工序列<400>4cgcggatcctatcgacgcccacctccggcgaa32當前第1頁12