本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一種谷氨酸棒桿菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，尤其是涉及一種產(chǎn)L-谷氨酰胺的谷氨酸棒桿菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用
背景技術(shù)：
：L-谷氨酰胺(L-Glutamine)，學(xué)名為2-氨基-5-羧基戊酰胺，分子式為C5H10N2O3，分子量為146。L-谷氨酰胺是人體內(nèi)氮源代謝過程中不可缺少的條件性必需氨基酸，對保持肌肉新陳代謝、細胞分化和生長、組織創(chuàng)傷的修復(fù)、體內(nèi)毒素的中和有著重要作用。L-谷氨酰胺廣泛存在于自然界，例如，以游離狀態(tài)含于南瓜、向日葵的幼苗中。雖然可自天然產(chǎn)物提取谷氨酰胺，但L-Gln的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、酶促合成法和發(fā)酵法?；瘜W(xué)合成法是以L-Glu為原料,經(jīng)過多步化學(xué)反應(yīng)合成L-Gln。其中研究時間最長、技術(shù)條件最成熟的合成法主要有：L-Gln甲酯法(“手性源”合成法)和肼法。合成法的特點是使用化學(xué)試劑直接合成,方法直接且反應(yīng)速度較快,但轉(zhuǎn)化率不高且產(chǎn)品中反應(yīng)物及副產(chǎn)物殘留是限制產(chǎn)品質(zhì)量和使用范圍。酶促合成法生產(chǎn)L-Gln是以NH4+及谷氨酸作原料，經(jīng)L-Gln合成酶(GS)催化而成。與化學(xué)合成法相比，酶促合成法反應(yīng)步驟相對簡單，其中三磷酸腺苷(ATP)是必需的。ATP價格昂貴，同時酶促反應(yīng)底物NH4+、副產(chǎn)品二磷酸腺苷(ADP)都明顯抑制L-Gln的生成，因此該生產(chǎn)方法不能滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要。發(fā)酵法是目前最常用的L-Gln生產(chǎn)方法，以谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)為生產(chǎn)菌發(fā)酵生產(chǎn)L-Gln。谷氨酸棒桿菌是革蘭氏陽性微生物，具有生長速度快、非致病、對自身代謝物弱降解能力的特性，作為傳統(tǒng)工業(yè)微生物，谷氨酸棒桿菌廣泛用于生產(chǎn)L-氨基酸、核苷酸及其他有機酸。發(fā)酵法具有原料來源廣泛、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品質(zhì)量可控、產(chǎn)物單一等優(yōu)點。但目前L-Gln的菌種的發(fā)酵性能仍較差、L-Gln的轉(zhuǎn)化率仍較低，仍不能滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需求。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種L-谷氨酰胺產(chǎn)量高的谷氨酸棒桿菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種谷氨酸棒桿菌，具有L-谷氨酰胺生產(chǎn)能力并且其細胞內(nèi)腺苷?；D(zhuǎn)移酶和谷氨酰胺酶活性同時降低或喪失。具有L-谷氨酰胺生產(chǎn)能力并且其細胞內(nèi)腺苷?；D(zhuǎn)移酶和谷氨酰胺酶活性同時降低或喪失。腺苷酰基轉(zhuǎn)移酶的活性降低或喪失可解除對谷氨酰胺合成酶的腺苷?；揎椬饔脧亩黾覮-谷氨酰胺的產(chǎn)量。而谷氨酰胺酶活性降低或喪失可減少L-谷氨酰胺的分解，使培養(yǎng)基中L-谷氨酰胺的量增多。優(yōu)選的，所述谷氨酸棒桿菌具有L-谷氨酰胺生產(chǎn)能力并且其細胞內(nèi)編碼腺苷酰基轉(zhuǎn)移酶的glnE基因和編碼谷氨酰胺酶的glsA基因表達同時降低或喪失。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解所述腺苷酰基轉(zhuǎn)移酶和谷氨酰胺酶活性的降低不限于基因表達的降低，還可以通過對腺苷?；D(zhuǎn)移酶和谷氨酰胺酶進行蛋白修飾實現(xiàn)。進一步的，基因表達的降低或喪失的基因編輯技術(shù)包括但不限于編碼基因被敲除、RNAi干擾。優(yōu)選的，所述谷氨酸棒桿菌具有L-谷氨酰胺生產(chǎn)能力并且其細胞內(nèi)編碼腺苷?；D(zhuǎn)移酶的glnE基因和編碼谷氨酰胺酶的glsA基因被敲除。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種谷氨酸棒桿菌MHZ-0512-3，其細胞內(nèi)glnE和glsA被敲除，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.13404。本發(fā)明提供了一種所述谷氨酸棒桿菌的構(gòu)建方法，包括：步驟A、分別構(gòu)建glnE基因敲除重組載體和glsA基因敲除重組載體；步驟B、將glnE基因敲除重組載體轉(zhuǎn)化谷酸棒桿菌MHZ-0512-1中獲得重組菌株；步驟C、將glsA基因敲除重組載體轉(zhuǎn)化步驟B獲得的重組菌株即得。優(yōu)選的，所述glnE基因敲除重組載體和glsA基因敲除重組載體均通過采用同源重組的方法構(gòu)建。優(yōu)選的，所述載體為pK18mobsacB。即所述glnE基因敲除重組載體為pK18mobsacB-ΔglnE。所述glsA基因敲除重組載體為pK18mobsacB-ΔglsA。利用本發(fā)明獲得的谷氨酸棒桿菌進行發(fā)酵生產(chǎn)，可獲得L-谷氨酰胺的有效積累，為L-谷氨酰胺的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。因此本發(fā)明還提供了所述谷氨酸棒桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酰胺中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述谷氨酸棒桿菌為保藏編號為CGMCCNo.13404的谷氨酸棒桿菌MHZ-0512-3。進一步的，本發(fā)明還提供了一種L-谷氨酰胺的生產(chǎn)方法，將保藏編號為CGMCCNo.13404的谷氨酸棒桿菌接種于種子培養(yǎng)基進行擴繁，然后將擴繁后的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵。其中，優(yōu)選的，所述種子培養(yǎng)基由葡萄糖50g/L，尿素5g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，玉米漿30g/L組成，pH7.0。優(yōu)選的，所述擴繁的條件為33℃、培養(yǎng)5-10小時。優(yōu)選的，所述發(fā)酵培養(yǎng)基由葡萄糖90g/L，(NH4)2SO440g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，玉米漿10g/L，CaCO350g/L組成，pH7.0。優(yōu)選的，所述發(fā)酵條件為33℃，發(fā)酵48h。由上述技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了一種谷氨酸棒桿菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。本發(fā)明所述谷氨酸棒桿菌，具有L-谷氨酰胺生產(chǎn)能力并且其細胞內(nèi)腺苷酰基轉(zhuǎn)移酶和谷氨酰胺酶活性同時降低或喪失。本發(fā)明所述谷氨酸棒桿菌解除了對谷氨酰胺合成酶的腺苷?；揎椬饔脧亩黾覮-谷氨酰胺的產(chǎn)量，同時減少L-谷氨酰胺的分解，使培養(yǎng)基中L-谷氨酰胺的量增多，進而提高菌株發(fā)酵產(chǎn)L-谷氨酰胺的能力。實驗表明本發(fā)明所述谷氨酸棒桿菌為L-谷氨酰胺高產(chǎn)菌株，能有效積累L-谷氨酰胺，提高L-谷氨酰胺的產(chǎn)量，為L-谷氨酰胺的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。生物保藏說明MHZ-0512-3，分類命名：谷氨酸棒桿菌，Corynebacteriumglutamicum，于2016年11月30日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNo.13404。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。圖1示重組質(zhì)粒pK18mobsacB-ΔglnE圖譜；圖2示重組質(zhì)粒pK18mobsacB-ΔglsA圖譜。具體實施方式本發(fā)明公開了一種谷氨酸棒桿菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法進行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。為了進一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行詳細闡述，如無特殊說明，本發(fā)明實施例中所涉及的試劑均為市售產(chǎn)品，均可以通過商業(yè)渠道購買獲得。其中，本實驗出發(fā)菌株MHZ-0512-1為谷氨酸棒狀桿菌ATCC14067。所述BHI液體培養(yǎng)基配方為3.7％腦心浸粉溶液，所述BHI固體培養(yǎng)基配方為3.7％腦心浸粉溶液和1.8％瓊脂粉。實施例1：重組質(zhì)粒pK18mobsacB-ΔglnE，pK18mobsacB-ΔglsA的構(gòu)建在NCBIGenBank數(shù)據(jù)庫中獲得谷氨酸棒桿菌ATCC14067glnE基因的核苷酸序列，設(shè)計在特定位置(敲除該基因ORF序列1位-500位500bp核苷酸序列)引入堿基缺失以使glnE基因失活，基于堿基序列及所選缺失位置合成了四條引物(如表1所示)。利用Phusion超保真聚合酶(NewEnglandBioLabs)，以A1/A2，A3/A4作為引物，以谷氨酸棒桿菌ATCC14067的基因組DNA作為模板制備glnE堿基缺失位點的上下游片段。PCR程序為：98℃變性10s，50℃復(fù)性20s，72℃延伸20s，循環(huán)30次后。所得兩個片段經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根)純化后，利用引物組A1/A4進行overlapPCR擴增得到產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒(天根)純化后利用XbaI/SacI進行消化，同時將pK18mobsacB利用XbaI/SacI進行消化，并用T4DNA連接酶(TransGenBiotech)將片段與載體進行連接，轉(zhuǎn)化Trans1T1感受態(tài)細胞(TransGenBiotech)，挑取卡那抗性克隆，XbaI/SacI酶切鑒定得到overlapPCR片段插入pK18mobsacB的陽性克隆，提取質(zhì)粒，用T1/T2擴增片段，通過測序(Invitrogen公司)鑒定插入的片段確實為glnE基因待缺失位點的上下游同源臂片段，即為pK18mobsacB-ΔglnE重組質(zhì)粒。pK18mobsacB-ΔglsA質(zhì)粒的構(gòu)建與上述類似，同樣敲除glsA基因ORF序列1位-500位500bp核苷酸序列，所用引物為B1/B3，B2/B4擴增glsA缺失基因的上下游同源臂片段。表1引物序列引物核苷酸序列SEQIDA1GCTCTAGACAACTGCGGCAACCTGGGGTGTA1A2GCGACCCAATAAAGGAGGGGAGAAGCTTTTTTACACG2A3GGCCCGGTAACACTAGCCGTGTAAAAAAGCTTCTCCC3A4TCTGTCGACCGCCCAGCGCTTGTAATACGCCA4T1CTCGTATGTTGTGTGGAATTGTG5T2AGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGG6B1GCTCTAGACCTTGCACTTCACGGCTCAT7B2CGCAAAAGAAATCACTAGTCTTGATTCTCCTCTCCATC8B3TTGCGCAGCATGTGGGCGATGGAGAGGAGAATCAAGA9B4TCTGTCGACTTGGATGAAGGTGGTGTCGC10實施例2：從MHZ-0512-1菌株構(gòu)建glnE基因破壞的菌株谷氨酸棒桿菌感受態(tài)的制備：從-80℃冰箱中劃線轉(zhuǎn)接出谷氨酸棒桿菌種MHZ-0512-1至BHI固體培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)；挑取單菌落，轉(zhuǎn)接到5mlBHI液體培養(yǎng)基(3.7％腦心浸粉)試管中，200rpm，30℃培養(yǎng)12h。按1％接種量接種至100mlBHIS液體培養(yǎng)基(3.7％腦心浸粉，9.1％山梨醇)中，200rpm，30℃培養(yǎng)至OD600達到1.5。4℃，6000rpm離心20min，收集菌體，棄上清液。用TGBuffer(1mMTris，10％甘油(v/v)，pH7.5)懸浮后于4℃，6000rpm離心20min，棄上清液，并重復(fù)一遍；用10％的甘油懸浮后于4℃，6000rpm離心20min，棄上清液，并重復(fù)一遍；加入1ml10％甘油懸浮菌體后分裝。將感受態(tài)細胞放于-70℃冰箱保存或直接用于電擊轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)化：將谷氨酸棒桿菌MHZ-0512-1感受態(tài)細胞從冰箱中拿出并于冰水中融化，添加10-15μlpK18mobsacB-ΔglnE重組質(zhì)粒DNA入溶化的感受態(tài)細胞中，吹吸混勻后將其轉(zhuǎn)移至1mm電擊杯(BioRad公司)中，于1.8kv，5ms條件下在電擊儀(BioRad公司)上電擊，然后立即加入46℃預(yù)熱的BHI液體培養(yǎng)基中，輕輕混勻，將混合液轉(zhuǎn)入15ml離心管中，46℃水浴6min，30℃活化培養(yǎng)2h，離心收集菌體，將菌體涂布于含有25mg/L卡那霉素的BHI固體培養(yǎng)基上，30℃于恒溫箱中培養(yǎng)24h。在含有25mg/L的卡那霉素的BHI固體選擇培養(yǎng)基上選擇單交換轉(zhuǎn)化體，其中帶有g(shù)lnE堿基缺失的序列通過與內(nèi)源glnE基因同源重組連同重組載體整合到基因組中。利用FastTaqDNA聚合酶(TransGenBiotech)，以A1/T2，T1/A4引物對進行菌落PCR鑒定具有卡那霉素抗性的單克隆，PCR反應(yīng)程序為：94℃30s，50℃30s，72℃40s，共26個循環(huán)。兩個引物對均擴增出目的片段的克隆為陽性克隆。將挑選出的陽性克隆接種入無抗BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～14h，將菌液稀釋100-1000倍后涂布在含有10％蔗糖的BHI固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，將所篩選出的菌株進一步進行卡那霉素抗性表型驗證，挑選對卡那霉素抗性敏感的二次重組子利用A1/A4引物對擴增目的片段，陽性克隆的目的片段較野生型所擴增的片段小，將陽性克隆進行測序驗證，得到glnE堿基缺失的菌株，命名為MHK-0512-2。實施例3：從MHZ-0512-2菌株構(gòu)建glsA基因破壞的菌株參照實施例2方法制備MHZ-0512-2感受態(tài)細胞。通過電轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒pK18mobsacB-ΔglsA轉(zhuǎn)化該感受態(tài)細胞，并在含有25mg/L卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，其中帶有g(shù)lsA堿基缺失的序列通過與內(nèi)源glsA基因同源重組連同重組載體整合到基因組中。利用FastTaqDNA聚合酶(TransGenBiotech)，以B1/T2，T1/B4引物對進行菌落PCR鑒定有卡那霉素抗性的單克隆，PCR反應(yīng)程序為：94℃30s，50℃30s，72℃40s，共26個循環(huán)，兩個引物對均擴增出目的片段的克隆為陽性克隆。將挑選出的陽性克隆接種入無抗BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～14h，將菌液稀釋100-1000倍后涂布在含有10％蔗糖的BHI固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，將所篩選出的菌株進一步進行卡那抗性表型驗證，挑選對卡那霉素抗性敏感的二次重組子利用B1/B4引物對擴增目的片段，陽性克隆的目的片段較野生型所擴增的片段小，將陽性克隆進行測序驗證，得到glsA堿基缺失的菌株，命名為MHZ-0512-3。實施例4：從MHZ-0512-1菌株構(gòu)建glsA基因破壞的菌株參照實施例2方法制備MHZ-0512-1感受態(tài)細胞。通過電轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒pK18mobsacB-ΔglsA轉(zhuǎn)化該感受態(tài)細胞，并在含有25mg/L卡那霉素抗性的BHI固體選擇培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子，其中帶有g(shù)lsA堿基缺失的序列通過與內(nèi)源glsA基因同源重組連同重組載體整合到基因組中。利用FastTaqDNA聚合酶(TransGenBiotech)，以B1/T2，T1/B4引物對進行菌落PCR鑒定KanR克隆，PCR反應(yīng)程序為：94℃30s，50℃30s，72℃40s，共26個循環(huán)。兩個引物對均擴增出目的片段的克隆為陽性克隆。將挑選出的陽性克隆接種入無抗BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～14h，將菌液稀釋100-1000倍后涂布在含有10％蔗糖的BHI固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，將所篩選出的菌株進一步進行卡那霉素抗性表型驗證，挑選對卡那霉素抗性敏感的二次重組子利用B1/B4引物對擴增目的片段，陽性克隆的目的片段較野生型所擴增的片段小，將陽性克隆進行測序驗證，得到glsA堿基缺失的菌株，命名為MHZ-0512-4。實施例5：L-谷氨酰胺基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)L-谷氨酰胺分別將出發(fā)菌株MHZ-0512-1、實施例2-4所構(gòu)建基因工程菌株MHZ-0512-2、MHZ-0512-3和MHZ-0512-4接種于量程大小為200ml三角瓶進行種子培養(yǎng)，裝液量50ml/瓶，裝液量為種子培養(yǎng)基含量。然后于量程大小500ml三角搖瓶中進行發(fā)酵培養(yǎng)，裝液量為20ml/瓶，接種量為10％。培養(yǎng)溫度33℃，培養(yǎng)時間48h。每組實驗設(shè)置三個平行，最終結(jié)果取三組實驗的平均值。各菌株發(fā)酵產(chǎn)L-谷氨酰胺結(jié)果見表2。其中所述種子培養(yǎng)基成分如下：葡萄糖50g/L，尿素5g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，玉米漿30g/L，NaOH調(diào)pH7.0。所述發(fā)酵培養(yǎng)基組分如下：葡萄糖90g/L，(NH4)2SO440g/L，KH2PO42.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，玉米漿10g/L，CaCO350g/L，NaOH調(diào)pH7.0。表2：各菌株發(fā)酵產(chǎn)L-谷氨酰胺結(jié)果菌株OD562(×100)L-Gln含量(g/L)L-Gln轉(zhuǎn)化率(％)L-Glu含量(g/L)MHZ-0512-10.4914.516.115.7MHZ-0512-20.4818.220.225.4MHZ-0512-40.4617.619.550.5MHZ-0512-30.5228.431.550.3由表2可知，敲除glnE基因的菌株MHZ-0512-2谷氨酰胺的產(chǎn)量和對照組菌株MHZ-0512-1相比有所提高，差異顯著(P＜0.05)。同樣敲除glsA基因的菌株MHZ-0512-4的L-谷氨酰胺的產(chǎn)量有一定的增加，和對照相比差異顯著(P＜0.05)，并且副產(chǎn)物L(fēng)-谷氨酸含量下降。同時敲除glnE基因和glsA基因的菌株MHZ-0512-3，相比對照組菌株MHZ-0512-1產(chǎn)量具有顯著差異(P＜0.05)，產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率有大幅度提高，L-谷氨酰胺產(chǎn)量提高了13.9g/L，轉(zhuǎn)化率提高了15.44％。與對照組菌株相比，此時培養(yǎng)基中只有微量的L-谷氨酸殘余。glnE基因和glsA基因的功能同時喪失具有一定的協(xié)同作用，使L-谷氨酰胺的產(chǎn)量大幅度提高，副產(chǎn)物含量降低，從而提高了發(fā)酵過程中L-谷氨酰胺的產(chǎn)量。綜上所述，本發(fā)明所構(gòu)建的L-谷氨酰胺基因工程菌MHZ-0512-3(保藏編號為CGMCCNo.13404)能夠?qū)崿F(xiàn)發(fā)酵過程中L-谷氨酰胺的有效積累，且具有較高的轉(zhuǎn)化率，該菌株具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景。SEQUENCELISTING<110>廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司<120>一種谷氨酸棒桿菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用<130>MP1623784<160>10<170>PatentInversion3.3<210>1<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>1gctctagacaactgcggcaacctggggtgta31<210>2<211>37<212>DNA<213>人工序列<400>2gcgacccaataaaggaggggagaagcttttttacacg37<210>3<211>37<212>DNA<213>人工序列<400>3ggcccggtaacactagccgtgtaaaaaagcttctccc37<210>4<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>4tctgtcgaccgcccagcgcttgtaatacgcca32<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>5ctcgtatgttgtgtggaattgtg23<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>6aggctgcgcaactgttgggaagg23<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>7gctctagaccttgcacttcacggctcat28<210>8<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>8cgcaaaagaaatcactagtcttgattctcctctccatc38<210>9<211>37<212>DNA<213>人工序列<400>9ttgcgcagcatgtgggcgatggagaggagaatcaaga37<210>10<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>10tctgtcgacttggatgaaggtggtgtcgc29當(dāng)前第1頁1 2 3