本發(fā)明屬于分子生物學(xué)dna標(biāo)記技術(shù)與應(yīng)用領(lǐng)域，具體地說，涉及一種利用issr反應(yīng)體系分析草果遺傳多樣性的方法。

背景技術(shù)：

草果(amomumtsaokocrevostetlemaire)是姜科豆蔻屬植物中一種多年生草本植物，不僅是我國食品加工業(yè)和輕工業(yè)的重要原料，而且是一種傳統(tǒng)的中藥材，有燥濕、健胃、祛痰、溫中、順氣、抗瘧等功能，還是大眾的調(diào)料食品，國際、國內(nèi)市場需求量大。草果對生長環(huán)境條件要求較高，一般生長在海拔800～1500m的北熱帶和中、南亞熱帶中低山區(qū)，年降雨量在1200～1600mm，年平均氣溫在16～22℃，冬季多霧、濕度大、透光度在40％～50％的陰濕山坡溝谷森林環(huán)境下，主要分布在我國云南、廣西和貴州三省局部地區(qū)，其中云南是草果主產(chǎn)區(qū)，產(chǎn)量約占全國的95％，主要分布在紅河、文山、西雙版納、德宏、保山、思茅、臨滄7個地(州)的31個縣(市)。

分子標(biāo)記是一種以dna序列差異性為標(biāo)記的檢測遺傳多樣性的方法，具有不受外界環(huán)境及基因表達(dá)與否的影響，不影響實(shí)驗(yàn)材料的性狀、可標(biāo)記數(shù)量大及分辨率高等特點(diǎn)，目前被廣泛應(yīng)用于生物遺傳研究。issr(簡單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性，intersimplesequencerepeat)分子標(biāo)記技術(shù)是zietkeiwitcz等(zietkiewicze,rafalskia,labudad(1994)genomefingerprintingbysimplesequencerepeat(issr)-anchoredpolymerasechainreactionamplification.genomics20:176–183)于1994年發(fā)展起來的一種基于微衛(wèi)星序列的分子標(biāo)記。以其簡便迅速、多態(tài)性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于動植物的品種鑒定、dna指紋圖譜構(gòu)建和種質(zhì)資源多樣性研究等領(lǐng)域，同時(shí)在中草藥種內(nèi)和種間鑒定等方面得到廣泛運(yùn)用。目前在姜科植物砂仁中有過利用issr標(biāo)記分析不同產(chǎn)地砂仁遺傳多樣性的報(bào)道，但在草果中，應(yīng)用issr分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析的方法尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明針對上述的問題，提供了一種利用issr反應(yīng)體系分析草果遺傳多樣性的方法，該方法是一種簡單、易于操作的分子標(biāo)記技術(shù)，可為草果資源鑒定、遺傳多樣性分析等科學(xué)研究提供很好的技術(shù)指導(dǎo)和理論支持。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種用于草果遺傳多樣性分析的issr分子標(biāo)記引物體系，所述引物序列包括：

ubc807：其核苷酸序列如seqidno.1所示；

ubc809：其核苷酸序列如seqidno.2所示；

ubc835：其核苷酸序列如seqidno.3所示；

ubc836：其核苷酸序列如seqidno.4所示；

ubc841：其核苷酸序列如seqidno.5所示；

ubc842：其核苷酸序列如seqidno.6所示；

ubc847：其核苷酸序列如seqidno.7所示；

ubc862：其核苷酸序列如seqidno.8所示；

ubc873：其核苷酸序列如seqidno.9所示；

ubc885：其核苷酸序列如seqidno.10所示；

ubc888：其核苷酸序列如seqidno.11所示。

本發(fā)明還公開了一種用于草果遺傳多樣性分析的issr-pcr反應(yīng)體系，每25μl的反應(yīng)體系中含有不含mg²⁺的10×pcrbuffer3.0μl、taq酶1.5u、mg²⁺1.5mmol/l、dntp0.25mmol/l、引物0.3μmol/l和模板dna50ng；將上述反應(yīng)混合液按如下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性5min，95℃變性1min，50-58℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存。

進(jìn)一步地，所述引物選自上述seqidno.1～11中的任一條。

進(jìn)一步地，所述退火溫度根據(jù)所選擇的引物來確定，具體如下：

seqidno.150℃

seqidno.252℃

seqidno.353℃

seqidno.453℃

seqidno.554℃

seqidno.654℃

seqidno.753℃

seqidno.858℃

seqidno.954℃

seqidno.1053℃

seqidno.1152℃。

本發(fā)明還公開了一種利用issr反應(yīng)體系分析草果遺傳多樣性的方法，其步驟包括：

(1)dna的提?。翰杉廴~用于全基因組dna提??；

(2)采用issr-pcr反應(yīng)體系對步驟(1)中提取的dna樣品進(jìn)行擴(kuò)增；

(3)將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物在5％非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，電泳結(jié)束后銀染檢測條帶；

(4)利用issr分子標(biāo)記引物體系將不同來源的草果進(jìn)行聚類及主坐標(biāo)分析；

(5)遺傳多樣性分析：計(jì)算草果實(shí)驗(yàn)材料遺傳多樣性參數(shù)。

進(jìn)一步地，步驟(1)中的dna的提取具體為：采用2*ctab法提取dna，并將提取的dna樣品溶于te緩沖液后存儲于-20℃?zhèn)溆茫瑪U(kuò)增前用雙蒸水將dna樣品稀釋成20ng/μl的工作液，作為pcr擴(kuò)增反應(yīng)的模板。

進(jìn)一步地，步驟(2)中issr-pcr反應(yīng)體系具體為：每25μl的反應(yīng)體系中含有不含mg²⁺的10×pcrbuffer3.0μl、taq酶1.5u、mg²⁺1.5mmol/l、dntp0.25mmol/l、引物0.3μmol/l和模板dna50ng；將上述反應(yīng)混合液按如下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性5min，95℃變性1min，50-58℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存。

進(jìn)一步地，步驟(3)中將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物在5％非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳進(jìn)行分離，電泳結(jié)束后銀染檢測條帶。具體為：電泳結(jié)束后，將膠體從玻璃板上取下，蒸餾水漂洗，轉(zhuǎn)入含有0.2％硝酸銀的染色液中，振蕩10min，蒸餾水漂洗1次約1min，轉(zhuǎn)入含2％氫氧化鈉和0.4％甲醛的顯色液中，輕輕振蕩待條帶顯色完全，將膠體轉(zhuǎn)入蒸餾水中；在凝膠成像系統(tǒng)下對膠體進(jìn)行拍照保存。

進(jìn)一步地，步驟(4)中聚類分析和主坐標(biāo)分析具體為：讀取步驟(3)獲得的譜帶信息，將電泳圖譜上100～2000bp范圍內(nèi)清晰且重復(fù)出現(xiàn)的條帶記為1，同一位置沒有條帶記為0，由此生成0和1原始矩陣；統(tǒng)計(jì)每條引物擴(kuò)增出的總條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)；用ntsys-pc(2.10e)軟件中simqual程序計(jì)算相似系數(shù)矩陣，以clustering程序中shan進(jìn)行upgma聚類；用treeplot模塊生成聚類圖，構(gòu)建分子進(jìn)化樹；根據(jù)計(jì)算的相似系數(shù)矩陣進(jìn)行decenter數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，進(jìn)而進(jìn)行主坐標(biāo)分析。

進(jìn)一步地，步驟(5)中遺傳多樣性分析具體為：根據(jù)01二元數(shù)據(jù)矩陣，統(tǒng)計(jì)issr擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶總數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)(npb)，計(jì)算多態(tài)性條帶所占的比率(ppb)和引物多態(tài)性信息含量(pic)，pici＝2fi(1－fi)，公式中pici表示第i個位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量，fi表示有帶所占的頻率，(1－fi)表示無帶所占的頻率；對每條引物來說，pic＝∑pici/n，式中n表示每條引物的多態(tài)性條帶數(shù)；對每條引物而言，標(biāo)記指數(shù)(mi)按下述公式計(jì)算：mi＝npb*pic；釆用popgene32軟件對所有試驗(yàn)材料進(jìn)行遺傳多樣性參數(shù)計(jì)算：等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、shannon's信息指數(shù)、基因多樣性指數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)比率。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：

1)本發(fā)明優(yōu)化了草果基因組dna的issr反應(yīng)條件；

2)采用5％的非變性聚丙烯酰胺凝膠對issr-pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離，分辨率較瓊脂糖凝膠更高；

3)利用優(yōu)化的pcr反應(yīng)體系，篩選出的11條issr引物在草果中pcr擴(kuò)增反應(yīng)穩(wěn)定，擴(kuò)增片段清晰，多態(tài)性高；

4)本發(fā)明可加快草果資源的鑒定速度，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，結(jié)果穩(wěn)定可靠，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法的不足；

5)本發(fā)明成本低，在短時(shí)間內(nèi)可完成大批試驗(yàn)材料鑒定。

6)利用該技術(shù)能很好的揭示草果居群間的遺傳多樣性，分辨草果種質(zhì)資源間的親緣關(guān)系，對草果資源的保護(hù)及利用具有重要意義。

當(dāng)然，實(shí)施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時(shí)達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1是本發(fā)明ubc835引物擴(kuò)增效果圖，其中，m，2000bpmarker；1-25所對應(yīng)原始編號及采樣點(diǎn)見表1；其中1-25分別代表采自金平的j8、j48、j55、j59、j64、j84、j91、j103、j108、j109、j118、j119、j128和采自元陽的y3、y5、y9、y14、y18、y22、y32、y36、y44、y45、y47、y48；

圖2是本發(fā)明基于issr標(biāo)記的91份草果樣品聚類圖。

圖3是本發(fā)明基于issr標(biāo)記的91份草果樣品主坐標(biāo)分析。

具體實(shí)施方式

以下將配合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式，藉此對本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達(dá)成技術(shù)功效的實(shí)現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。

實(shí)施例1dna的提取

(1)實(shí)驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用的91份草果采自云南省8個草果居群，其中金平縣13份、元陽縣12份、綠春縣11份、屏邊縣9份、瀾滄縣13份、保山市11份、梁河縣12份、云縣10份，具體見表1。

表1試驗(yàn)材料編號及采樣點(diǎn)

(2)dna的提取

在種質(zhì)資源調(diào)查同時(shí)采集嫩葉用于全基因組dna提取。采用2*ctab法提取dna，并將提取的dna樣品溶于te緩沖液后存儲于-20℃?zhèn)溆?。擴(kuò)增前用雙蒸水將dna樣品稀釋成20ng/μl的工作液，作為pcr擴(kuò)增反應(yīng)的模板。

實(shí)施例2本發(fā)明issr-pcr反應(yīng)體系及引物的篩選

(1)采用正交設(shè)計(jì)方法，對mg²⁺、dntps和引物濃度、taqdna聚合酶及模板dna用量等5個因素進(jìn)行篩選，得到適于草果的issr標(biāo)記pcr反應(yīng)體系。issr-pcr的正交設(shè)計(jì)如表2。所選issr-pcr引物為ubc888，試驗(yàn)重復(fù)3次。經(jīng)評分比較后，25μl反應(yīng)體系中10×pcrbuffer(不含mg²⁺)3.0μl、taq酶1.5u、mg²⁺1.5mmol/l、dntp0.25mmol/l、引物0.3μmol/l(每條)和模板dna50ng綜合擴(kuò)增效果最好。

表2issr-pcr反應(yīng)l16(4⁵)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

(2)上述反應(yīng)體系的pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，95℃變性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存。

在試驗(yàn)確定最佳反應(yīng)體系基礎(chǔ)上，在梯度pcr儀上進(jìn)行引物篩選及最佳退火溫度確定，issr引物序列及最佳退火溫度信息見表3。利用上述反應(yīng)體系和反應(yīng)程序共篩選出11條帶型穩(wěn)定、清晰且重復(fù)性好的多態(tài)性引物：ubc807、ubc809、ubc835、ubc836、ubc841、ubc842、ubc847、ubc862、ubc873、ubc885、ubc888。圖1為ubc835對1-25號樣品擴(kuò)增效果圖，表明本發(fā)明所建立的草果issr-pcr反應(yīng)體系擴(kuò)增出的條帶更具有多態(tài)性高、特異性強(qiáng)、背景清楚及穩(wěn)定性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，適合草果遺傳多樣性分析。

表3篩選的issr引物序列

(3)電泳和銀染體系

pcr擴(kuò)增產(chǎn)物在5％非變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離。電泳結(jié)束后銀染檢測條帶，具體操作如下：電泳結(jié)束后，將膠體從玻璃板上取下，蒸餾水漂洗，轉(zhuǎn)入含有0.2％(質(zhì)量百分濃度)硝酸銀的染色液中，振蕩10min，蒸餾水漂洗1次約1min，轉(zhuǎn)入含2％氫氧化鈉和0.4％甲醛(10gnaoh定容至500ml，使用前加入2ml甲醛)的顯色液中，輕輕振蕩待條帶顯色完全，將膠體轉(zhuǎn)入蒸餾水中。在凝膠成像系統(tǒng)下對膠體進(jìn)行拍照保存。

實(shí)施例3issr-pcr反應(yīng)體系在91份草果品種遺傳多樣性分析中的應(yīng)用

(1)聚類分析和主坐標(biāo)分析

將電泳圖譜上100～2000bp范圍內(nèi)清晰且可重復(fù)出現(xiàn)的條帶記為1，同一位置沒有條帶記為0，由此生成0和1原始矩陣。統(tǒng)計(jì)每條引物擴(kuò)增出的總條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)。用ntsys-pc(2.10e)軟件中simqual程序計(jì)算相似系數(shù)矩陣，以clustering程序中shan進(jìn)行upgma(unweightedpair-groupmethodwitharithmeticmeans)聚類；用treeplot模塊生成聚類圖，構(gòu)建分子進(jìn)化樹。根據(jù)計(jì)算的相似系數(shù)矩陣進(jìn)行decenter數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，進(jìn)而進(jìn)行主坐標(biāo)分析。

基于issr標(biāo)記，利用ntsyspc2.10e軟件對8個居群的91份草果進(jìn)行聚類分析和主坐標(biāo)分析。聚類分析中除j119和l49沒能被成功聚類外，其余樣本根據(jù)親緣關(guān)系遠(yuǎn)近均被分到不同類群中，在閾值0.738處可將樣本分為7類，yx1、y14、l44、l34、b4各為1類，l12、l50、ye和yx4聚在一起，剩余的80份樣本聚在一起，d23和d25親緣關(guān)系最近(圖2)。

對91份草果樣本的issr標(biāo)記的原始矩陣進(jìn)行主坐標(biāo)分析，issr標(biāo)記提取的前2個主坐標(biāo)所能解釋的遺傳變異分別為7.12％和3.98％，二維排序圖能夠直觀的表示91份樣本之間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，保山和德宏在親緣關(guān)系上最近，主坐標(biāo)分析結(jié)果與聚類結(jié)果基本一致(圖3)。

(2)遺傳多樣性分析

根據(jù)01二元數(shù)據(jù)矩陣，統(tǒng)計(jì)issr擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶總數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)(npb)，計(jì)算多態(tài)性條帶所占的比率(ppb)和引物多態(tài)性信息含量(pic)，pici＝2fi(1－fi)，公式中pici表示第i個位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量，fi表示有帶所占的頻率，(1－fi)表示無帶所占的頻率；對每條引物來說，pic＝∑pici/n，式中n表示每條引物的多態(tài)性條帶數(shù)；對每條引物而言，標(biāo)記指數(shù)(mi)可以按下述公式計(jì)算：mi＝npb*pic。假定所研究的草果居群都處于hardy-weinberg平衡，釆用popgene32軟件對所有試驗(yàn)材料進(jìn)行遺傳多樣性參數(shù)計(jì)算：等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、shannon's信息指數(shù)、基因多樣性指數(shù)、多態(tài)位點(diǎn)比率等。11條issr引物共擴(kuò)增402個條帶，其中多態(tài)性條帶402條，占總條帶的100％，平均每條引物擴(kuò)增36.545條帶；不同引物所揭示的pic(多態(tài)性信息含量)在0.232～0.301之間，平均為0.258；mi(標(biāo)記指數(shù))最高的是引物ubc842，為13.56，表明該引物在11條引物中的擴(kuò)增效率最高；有效等位位點(diǎn)數(shù)ne、nei基因多樣度及shannon's信息指數(shù)i最高的引物為ubc842，分別為1.302、0.208和0.347，最低的為ubc841，分別為1.186、0.145和0.264(表4)。issr引物擴(kuò)增多態(tài)性表明云南草果遺傳多樣性較低。居群間比較分析表明遺傳多樣性由高到低依次為金平居群、瀾滄居群、綠春居群、云縣居群、元陽居群、屏邊居群、德宏居群、保山居群。在物種水平上，多態(tài)性位點(diǎn)百分率p、觀測等位基因數(shù)na、有效等位位點(diǎn)數(shù)ne、nei基因多樣度h和shannon's信息指數(shù)i分別為100％、2.00、1.215、0.159、0.279(表5)。表明草果無論在居群水平還是物種水平遺傳多樣性都較低，亟需我們加大保護(hù)力度。

表411條issr引物擴(kuò)增結(jié)果

注：tnp：擴(kuò)增總條帶數(shù)；npb：多態(tài)性條帶數(shù)；ppb：多態(tài)性比率；na：觀測等位基因數(shù)；ne：有效等位基因數(shù)；h：nei基因多樣度；i：shannon's信息指數(shù)；pic：多態(tài)性信息含量；mi：標(biāo)記指數(shù)。

表5草果居群issr遺傳多樣性分析

注：p：多態(tài)性位點(diǎn)百分率；na：觀測等位基因數(shù)。

上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實(shí)施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進(jìn)行改動。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

序列表

<110>紅河學(xué)院

<120>一種利用issr反應(yīng)體系分析草果遺傳多樣性的方法

<130>2017

<160>11

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

agagagagagagagagt17

<210>2

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

agagagagagagagagg17

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

agagagagagagagagyc18

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

agagagagagagagagya18

<210>5

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gagagagagagagagayc18

<210>6

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

gagagagagagagagayg18

<210>7

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

cacacacacacacacarc18

<210>8

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

agcagcagcagcagcagc18

<210>9

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

gacagacagacagaca16

<210>10

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

bhbgagagagagagaga17

<210>11

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

bdbcacacacacacaca17