本發明涉及分子生物學領域，尤其涉及一種檢測calr基因1型突變的引物組合物及試劑盒。

背景技術：

骨髓增殖性腫瘤(mpn)是骨髓中一種或多種髓系細胞增殖和外周血中成熟及不成熟細胞增加的克隆性造血干/祖細胞疾病。近年來，多個分子標志物，如jak2、mpl和tet突變等相繼被發現，這些標志物的發現對于理解mpn的分子發病機制具有重要意義，也有助于對這類疾病的患者進行診斷和治療。但是，有30％～45％的攜有野生型jak2/mpl的原發性血小板增多癥(et)或原發性骨髓纖維化(pmf)患者仍然存在診斷困難，新近報道的鈣網蛋白基因(calr)突變將能部分填補這一空白，有望成為診斷骨髓增殖性腫瘤又一種新的分子標志物。

calr是一種主要位于內質網的有多重功能的鈣離子結合和儲存蛋白分子伴侶，通過協助蛋白質正確折疊和維持細胞鈣離子穩態而參與調節細胞增殖、凋亡、黏附、免疫等過程。calr基因定位于染色體19p13.2，它有9個外顯子和9個蛋白結構域，calr基因突變是由第九外顯子插入和缺失引起，導致一個堿基對的讀碼框移位，繼而產生一種具有缺乏內質網保留序列(kdel氨基酸序列)的新型的c-羧基末端的蛋白。到目前為止，已經檢測到多于40種不同的calr突變體，其中最常見的兩種變異體分別為：由52個堿基缺失引起的1型變異體(p.l367fs*46)和由5個堿基ttgtc插入引起的2型變異體(p.k385fs*47)，它們分別占所有突變體的53％和32％，研究者在體外實驗中發現，過度表達的1型突變體增強了白介素-3表達，也促進了stat5磷酸化作用并且引起信號傳導的激活，這種激活作用能被jak抑制劑阻滯，這說明calr和jak2突變可能有類似的機制。

當前calr基因突變的檢測主要依賴于探針實時pcr法或測序法等，以上方法耗時耗力、報告周期長，且在靈敏度方面存在缺陷，所需檢測設備昂貴，檢測時必須要有專門的設備和訓練有素的技術人員，對技術平臺要求高，不易于廣泛推廣。

技術實現要素：

本發明的目的在于克服現有技術中的缺陷，建立了一種針對calr基因1型突變進行快速檢測的環介導等溫擴增(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)體系。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明提供一種檢測calr基因1型突變的引物組合物，其包括seqidno：2-seqidno：7所示序列的引物。

優選地，上述引物組合物還包括如seqidno：8所示序列的pna探針，該pna探針具有16nt，其末端加了2個賴氨酸，這可增加親水性。

本發明還提供一種含有上述引物組合物的檢測calr基因1型突變的試劑盒。

優選地，上述試劑盒還包括反應緩沖液、bstdna聚合酶、鈣黃綠素、去離子水、dna模板。

優選地，上述試劑盒包含25μl擴增反應體系，該擴增反應體系包括2×反應緩沖液12.5μl，seqidno：2～seqidno：7所示序列中的每一引物各1μl，seqidno：8所示序列的pna探針1μl，bstdna聚合酶1μl，鈣黃綠素1μl，去離子水1.5μl，dna模板2μl。

優選地，在上述試劑盒中，seqidno：2～seqidno：3所示序列中的每一引物的終濃度均為0.2μmol/l；seqidno：4～seqidno：5所示序列中的每一引物的終濃度均為1.6μmol/l；seqidno：6～seqidno：7所示序列中的每一引物的終濃度均為1.6μmol/l；seqidno：8所示序列的pna探針的終濃度為0.8μmol/l。

本發明還提供一種用于非診斷和非治療目的的檢測calr基因1型突變的方法，該方法以被測樣本的dna模板，采用上述引物組合物進行lamp反應，然后進行可視化判讀來鑒定樣本是否為calr基因1型突變陽性。

優選地，所述lamp反應的條件為：58℃-68℃，60min；更優選為65℃，60min。

優選地，所述lamp反應所用的設備為能夠穩定提供65℃恒溫的設備，例如普通pcr儀或恒溫金屬浴等。

最后本發明還提供一種上述引物組合物擴增的calr基因1型突變的靶序列，其由seqidno：1所示序列組成，并且提供一種含有上述calr基因1型突變的靶序列的重組質粒，該重組質粒為含seqidno：1所示序列的ta克隆質粒。

上述引物、探針及靶序列的堿基序列如下表1所示。

表1檢測calr基因1型突變的引物、探針及靶序列的堿基序列表

與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：

本發明所述的calr基因1型突變進行快速檢測的試劑盒和環介導等溫擴增方法，其可對calr基因1型突變進行可視化檢測，與傳統的檢測方法相比，該方法對設備和環境要求低，檢測速度更快，檢測靈敏度更高。

附圖說明

圖1是calr基因1型突變lamp體系特異性的驗證示意圖；

圖中附圖標記為：

b1：臨床calr-2突變陽性基因組dna；b2：臨床calr-1突變陽性基因組dna；b3：臨床calr野生型基因組dna；b4：calr-2突變陽性質粒；b5：calr-1突變陽性質粒；b6：calr野生型質粒；b7：空白對照。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式作進一步描述。以下實施例僅用于更加清楚地說明本發明的技術方案，而不能以此來限制本發明的保護范圍。

實施例1

本實施例為本發明選取的calr基因1型突變的靶序列，以及用于檢測calr基因1型突變的引物及探針序列，。

在calr基因1型突變的位置周圍選定檢測的靶片段，利用在線的lamp引物設計網站primerexplorerv5(https://primerexplorer.jp/lampv5/index.html)針對靶片段，設計適當的特異性引物，

(1)引物序列為：

f3：tgcaggcagcagagaa(seqidno：2)；

b3：tttggcgcggccagct(seqidno：3)；

fip：tctttgtcctcatcatcctccttgacaaatgaaggacaaacagg(seqidno：4)

bip：agatgtccccggccaggcaggcctcagtccagc(seqidno：5)；

lf：tcctctgctcctcgt(seqidno：6)；

lb：gctgtagagaggcctgcctccag(seqidno：7)。

(2)肽核酸封閉探針pna序列為：

cttaaggaggaggaag-kk(seqidno：8)(16nt，末端加了2個賴氨酸，增加親水性)。

(3)靶序列，具體為：

tgcaggcagcagagaaacaaatgaaggacaaacaggacgaggagcagaggacaaggaggatgatgaggacaaagatgaggatgaggaggatgaggaggacaaggaggaagatgaggaggaagatgtccccggccaggccaaggacgagctgtagagaggcctgcctccagggctggactgaggcctgagcgctcctgccgcagagctggccgcgccaaa(219bp)(seqidno：1)。

實施例2

本實施例為本發明檢測calr基因1型突變的試劑盒及其方法。

本發明所采用的試劑盒包括擴增反應體系，該擴增反應體系的總體積為25μl，其包括2×反應緩沖液(rm)12.5μl，引物f3：1μl(終濃度0.2μmol/l)，引物b3：1μl(終濃度0.2μmol/l)，引物fip：1μl(終濃度1.6μmol/l)，引物bip：1μl(終濃度1.6μmol/l)，引物lf：1μl(終濃度0.8μmol/l)，引物lb：1μl(終濃度0.8μmol/l)，pna探針：1μl(終濃度0.8μmol/l)，bstdna聚合酶1μl(8u)，鈣黃綠素(fd)1μl，去離子水1.5μl，dna模板2μl。

采用上述試劑盒進行lamp反應，lamp反應條件為：58℃-68℃，60min；所用的設備為普通pcr儀或恒溫金屬浴等能夠穩定提供65℃恒溫的設備；然后進行可視化判讀來鑒定樣本是否為calr基因1型突變陽性，具體為結果判斷：反應結束后，反應液的顏色由原來的淡黃色變為綠色，即判定為反應陽性。

構建含靶序列的ta克隆質粒，制備梯度濃度的雙份樣本，具體濃度為10¹copies/ml，10²copies/ml，10³copies/ml，10⁴copies/ml，10⁵copies/ml，10⁶copies/ml，10⁷copies/ml，10⁸copies/ml，用所建立的calr基因1型突變lamp反應體系進行檢測，均能檢出；對臨床calr基因1型突變患者全血樣本的基因組dna和構建的重組質粒能特異性的檢出，對calr基因2型突變患者全血樣本的基因組dna和構建的重組質粒或正常人的野生型基因組dna和構建的重組質粒均無非特異性的擴增，檢測效果良好，詳見圖1。

轉入了calr-1型突變質粒的293t細胞、轉入了野生型質粒的293t細胞，均為10⁶個細胞，用基因組dna抽提試劑盒抽提dna，然后按比例稀釋，制成梯度突變負荷濃度的樣本，用所建立的lamp反應體系進行擴增，發現突變負荷檢出敏感性可達到1％，與探針法實時pcr的效果相當。

以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只作為范例，本發明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對該實用進行的等同修改和替代也都在本發明的范疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發明的范圍內。

sequencelisting

<110>復旦大學附屬華山醫院；復旦大學

；上海速創診斷產品有限公司

<120>一種檢測calr基因1型突變的引物組合物及其試劑盒

<160>8

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>219

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>靶序列

<400>1

tgcaggcagcagagaaacaaatgaaggacaaacaggacgaggagcagaggacaaggagga60

tgatgaggacaaagatgaggatgaggaggatgaggaggacaaggaggaagatgaggagga120

agatgtccccggccaggccaaggacgagctgtagagaggcctgcctccagggctggactg180

aggcctgagcgctcctgccgcagagctggccgcgccaaa219

<210>2

<211>16

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴增引物f3

<400>2

tgcaggcagcagagaa16

<210>3

<211>16

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<220>

<223>擴增引物b3

<400>3

tttggcgcggccagct16

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tctttgtcctcatcatcctccttgacaaatgaaggacaaacagg44

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<212>dna

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<223>擴增引物bip

<400>5

agatgtccccggccaggcaggcctcagtccagc33

<210>6

<211>15

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>擴增引物lf

<400>6

tcctctgctcctcgt15

<210>7

<211>23

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<220>

<223>擴增引物lf

<400>7

gctgtagagaggcctgcctccag23

<210>8

<211>16

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>pna探針，末端連接2個賴氨酸

<400>8

cttaaggaggaggaag16