本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及細粒棘球絳蟲tsp1重組蛋白及其可溶性表達方法和純化方法。

背景技術：

跨膜蛋白1（tsp1）是細粒棘球絳蟲成蟲cdna文庫中的一個抗原基因。tsp1是一種重要的細粒棘球絳蟲抗原，可能參與了細粒棘球絳蟲信號傳導途徑，對于細胞的生長、分化具有重要的生理意義。tsp1同膜聯蛋白家族(annexinfamily)成員可能是同源基因，屬于annexin家族。研究該抗原的生理功能，不僅可以了解其對于細粒棘球蚴的寄生、生長、發育等生命活動中的重要意義，還可以為治療和預防包蟲病提供新的藥物靶點和候選疫苗?；谝陨涎芯勘尘埃景l明構建了編碼細粒棘球絳蟲tsp1基因的原核表達質粒，轉化入大腸桿菌表達系統，誘導其可溶性表達，并進行蛋白純化，得到了該蛋白，為其今后的免疫原性、生化特性分析以及功能研究奠定了基礎。

技術實現要素：

本發明通過基因工程技術，提供了一種細粒棘球絳蟲tsp1的原核表達載體pet30a-tsp1，利用該載體轉化大腸桿菌（bl21-de3）實現了tsp1的高水平可溶性表達。并提供了一種親和層析純化方法，純化出了大量的高純度的重組tsp1，用于tsp1免疫原性、生化特性分析以及功能研究，抗包蟲疫苗、抗包蟲藥物的研發及囊型包蟲病患者的免疫診斷。

本發明提供細粒棘球絳蟲tsp1重組蛋白，所述細粒棘球絳蟲tsp1重組蛋白的氨基酸序列為序列表seqidno.2。

作為優選，所述細粒棘球絳蟲tsp1重組蛋白編碼的核苷酸序列為序列表seqidno.1中第27位-836位堿基。

本發明還提供上述細粒棘球絳蟲tsp1重組蛋白的可溶性表達，步驟如下：

（1）目的基因tsp1的擴增；

（2）構建tsp1表達質粒：將步驟（1）制備的目的基因tsp1酶切并純化后，構建入pet-30a相應的多克隆酶切位點，構建質粒pet30a-tsp1；

（3）將步驟（2）制備的質粒pet30a-tsp1轉化入e.colibl21(de3)感受態細胞中，將e.colibl21(de3)-pet30a-tsp1進行擴大培養，然后加入0.2mmol/l的iptg于25℃，120r/min誘導振蕩培養8小時；離心重懸后超聲，收集上清液。

作為優選，步驟（3）中所述擴大培養是將e.colibl21(de3)-pet30a-tsp1先接種至lb固體培養基上，37℃孵育過夜；然后挑取培養基上單克隆至lb液體培養基中，于37℃，180r/min振蕩培養3小時，使od值至0.5；最后取菌液接種至lb液體培養基中，于37℃，180r/min振蕩培養，使od值至0.5。

本發明還提供上述細粒棘球絳蟲tsp1重組蛋白的純化方法，是使用ni-ntahis-bind（clontech）純化系統純化重組蛋白，然后使用洗脫緩沖液進行洗脫；所述洗脫緩沖液的配方為：500mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0。

作為優選，步驟如下：

（1）加入超純水于ni-ntahis-bind預裝柱中，使其緩慢的流過柱內填充的介質；

（2）加入結合緩沖液；所述結合緩沖液的配方為：20mm/ltris，500mm/lnacl，20mm/l咪唑，ph8.0；

（3）上樣，加入超聲破碎e.colibl21(de3)-tsp1提取的上清液，靜置后使上清液緩慢流過柱內介質；

（4）加入結合緩沖液，使其緩慢流過柱內介質；所述結合緩沖液的配方為：20mm/ltris，500mm/lnacl，20mm/l咪唑，ph8.0；

（5）加入1號洗脫液，使其緩慢流過柱內介質，所述1號洗脫液的配方為：100mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0；

（6）加入2號洗脫液，使其緩慢流過柱內介質，所述2號洗脫液的配方為：200mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0；

（7）加入3號洗脫液，使其緩慢流過柱內介質，所述3號洗脫液的配方為：300mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0；

（8）加入4號洗脫液，使其緩慢流過柱內介質，所述4號洗脫液的配方為：400mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0；

（9）加入5號洗脫緩沖液，使其緩慢流過柱內介質，收集洗脫液；所述5號洗脫緩沖液的配方為：500mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0。

作為優選，所述超聲破碎e.colibl21(de3)-tsp1提取的上清液與洗脫緩沖液的體積比為1:1。

本發明還提供上述細粒棘球絳蟲tsp1重組蛋白在制備檢測細粒棘球蚴病的elisa試劑盒中的應用。

本發明還提供一種檢測細粒棘球蚴病的elisa試劑盒，所述elisa試劑盒中包被抗原為權利要求1或2所述的細粒棘球絳蟲tsp1重組蛋白。

作為優選，所述包被抗原用ph9.6的0.05m/l碳酸鹽緩沖液稀釋至終濃度8μg/ml；

作為優選，所述試劑盒還包括封閉液，所述封閉液為含有5%脫脂奶粉的tbst，所述百分比的單位為g/ml。

本發明提供了一種新的細粒棘球絳蟲跨膜蛋白1（tsp1）基因及細粒棘球絳蟲tsp1基因所編碼的蛋白質，并提供了一種細粒棘球絳蟲tsp1的原核表達載體pet30a-tsp1。該載體含有t7啟動子和終止子、細菌核糖體結合位點和tsp1基因及一個組氨酸標簽，從細粒棘球絳蟲成蟲cdna文庫中克隆出tsp1基因，用t7啟動子控制它在大腸桿菌中的表達，利用該載體轉化大腸桿菌(bl21-de3)，并在較低溫度、較低誘導劑濃度及較短誘導時間條件下誘導該菌，可實現tsp1的高效可溶性表達：表達的重組蛋白質大部分為可溶性蛋白，占大腸桿菌可溶性總蛋白90%。然后用ni-ntasuperflow親和層析純化重組細粒棘球絳蟲tsp1，得到tsp1純化蛋白。在使用洗脫緩沖液（500mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnaci，ph8.0）10ml時可得到一種新的高純度的細粒棘球絳蟲tsp1。tsp1重組蛋白表達量高，且在特定的誘導條件下呈可溶性表達，純化該蛋白的操作相當簡單，成本也很低，極易重復使用。本發明所制備的重組蛋白可以用于囊型包蟲病患者的免疫診斷，其作為免疫抗原能夠被囊型包蟲病患者血清識別，應用于間接elisa檢測時，具備較高的特異性和靈敏度，臨床檢測符合率高達90％。

附圖說明

附圖用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發明的實施例一起用于解釋本發明，并不構成對本發明的限制。在附圖中：

圖1為細粒棘球絳蟲tsp1基因pcr擴增產物電泳結果；

圖2為細粒棘球絳蟲tsp1的原核表達；

圖3為細粒棘球絳蟲tsp1親和層析純化結果。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市售。

實施例一細粒棘球絳蟲tsp1基因序列及其編碼的蛋白質序列

細粒棘球絳蟲tsp1全長1047個核苷酸，最大的開放閱讀框（orf）位于第27-836位，含810bp，起始密碼子為atg，終止密碼子為tga，編碼269個氨基酸，其核苷酸序列及編碼的氨基酸序列分別見序列表seqidno.1和2。

核苷酸序列：

氨基酸序列：

實施例二細粒棘球絳蟲tsp1的原核表達載體pet30a-tsp1的克隆構建

1．目的基因tsp1的擴增

以細粒棘球絳蟲pbluescriptⅱsk-tsp1（細粒棘球絳蟲pbluescriptⅱsk-tsp1從海南醫學院寄生蟲學教研室獲得，社會公眾也可從該教研室獲得）為模板,根據細粒棘球絳蟲tsp1基因序列設計如下兩對引物：

上游引物序列為：cgcgatatcatgaccactgg，含ecorv酶切位點，

下游引物序列為：gagtcgactcatattggggaagc，含sali酶切位點，

擴增tsp1基因最大的開放閱讀框（orf）中的基因序列（即27-836位基因序列），pcr反應條件：98℃預變性5min；96℃變性35s，65℃復性35s，72℃延伸45s，35個循環；72℃延伸10min。擴增產物電泳結果見圖1。

圖1為細粒棘球絳蟲tsp1基因pcr擴增產物電泳結果；其中，m，markerⅲ；1，tsp1pcr擴增產物。

2．構建tsp1表達質粒

pcr產物經純化后，擴增得到片段被ecorv和sali酶切并純化后，構建入pet-30a相應的多克隆酶切位點，構建質粒pet30a-tsp1，經測序鑒定，tsp1的序列信息與目標基因序列一致：核苷酸序列為序列表seqidno.1中第27-836位，編碼269個氨基酸，編碼的氨基酸序列為序列表seqidno.2。

實施例三細粒棘球絳蟲tsp1的原核表達

在不同誘導條件下，重組蛋白的可溶性表達量有所不同，以下為最佳誘導方法：

制備e.colibl21(de3)感受態細胞，將實施例2制備得到的質粒pet30a-tsp1轉化入e.colibl21(de3)感受態細胞中，劃線接種e.colibl21(de3)-pet30a-tsp1至lb固體培養基上，37℃孵育過夜；挑取培養基上單克隆至5mllb液體培養基中，于37℃，180r/min振蕩培養3小時，使od值至0.5；取1ml菌液接種至200mllb液體培養基中，于37℃，180r/min振蕩培養，使od值至0.5；加入iptg（0.2mmol/l）于25℃，120r/min誘導振蕩培養8小時；4℃12000g/min，離心10min收集細菌，重懸于40ml結合緩沖液中（20mm/ltris，500mm/lnacl，20mm/l咪唑，ph8.0）；超聲破碎細菌，功率200w，超聲8s，間歇8s，25mins后提取上清，并進行sds-page電泳，可見蛋白在上清液中表達量很高，呈可溶性表達（見圖2）。重組蛋白質大部分為可溶性蛋白，占大腸桿菌可溶性總蛋白90%。

為了尋找到最佳誘導條件，申請人進行了大量實驗，圖2為細粒棘球絳蟲tsp1在不同誘導條件下的原核表達。

其中，a圖中，m：marker；1-4，bl21（de3）-pet30a-tsp1于37℃，iptg濃度分別為1、0.8、0.5、0.2mmol/l，誘導18h后上清液的電泳圖；5-8，bl21（de3）-pet30a-tsp1于30℃，iptg濃度分別為1、0.8、0.5、0.2mmol/l，誘導12h后上清液的電泳圖；

b圖中，m：marker；1-3，bl21（de3）-pet30a-tsp1于25℃，iptg分別為0.5、0.2、0.1mmol/l，誘導8h后上清液的電泳圖。

由圖2中可見，在誘導溫度為37℃，iptg分別為1、0.8、0.5、0.2mmol/l，誘導18h后，在上清液中可見表達量極低的呈可溶性表達的tsp1；將誘導溫度降至30℃，iptg分別為1、0.8、0.5、0.2mmol/l，誘導12h，在上清液中可見呈可溶性表達的tsp1，其表達量較37℃時有所增加；進一步降低誘導溫度至25℃，iptg濃度分別為0.5、0.2、0.1mmol/l，誘導8h后，均可使上清液中tsp1的表達量增加，且iptg濃度為0.2mmol/l，可溶性tsp1的表達量最多，故將此條件作為tsp1原核誘導表達的最優條件。

實施例四細粒棘球絳蟲tsp1的親和層析純化

應用ni-ntahis-bind（clontech）純化系統純化目的蛋白。ni-ntahis-bind預裝柱購自美國novagen公司，型號：70691-3。

在滴加各種物質時，滴加速度為1滴/10秒。

不同的純化方法得到的重組蛋白的純化效果不同，需要對純化方法進行優化。以下為部分優化過程：

加入20ml超純水于ni-ntahis-bind預裝柱中，使其緩慢的流過柱內填充的介質；加入20ml結合緩沖液（50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0），使其緩慢的流過柱內填充的介質；上樣，加入4ml通過超聲破碎e.colibl21(de3)-pet30a-tsp1提取的上清液，控制流速使上清液緩慢流過柱內介質并收集；加入40ml漂洗緩沖液（50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，20mm/l咪唑，ph8.0），控制流速使其緩慢流過柱內介質，以洗脫雜蛋白；加入50mm/l咪唑洗脫液（50mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其緩慢流過柱內介質并收集；加入100mm/l咪唑洗脫液（100mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其緩慢流過柱內介質并收集；加入200mm/l咪唑洗脫液（200mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其緩慢流過柱內介質并收集；加入300mm/l咪唑洗脫液（300mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其緩慢流過柱內介質并收集；加入400mm/l咪唑洗脫液（400mm/l咪唑，50mm/lnah2po4，300mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其緩慢流過柱內介質并收集。將收集的洗脫液分別進行sds-page分析，檢查蛋白的純化程度，見圖3中的a圖。

圖3為細粒棘球絳蟲tsp1親和層析純化結果。

其中，在a圖中，m：marker；1-2，bl21（de3）-pet30a-tsp1上清原樣；3，蛋白上樣過柱后流穿液；4，50mm/l咪唑洗脫液；5，100mm/l咪唑洗脫液；6，200mm/l咪唑洗脫液；7，300mm/l咪唑洗脫液；8，400mm/l咪唑洗脫液。

由圖3中的a圖可見：分別用50mm/l、100mm/l、200mm/l、300mm/l、400mm/l咪唑洗脫液均能夠將目的蛋白洗脫下來，尤其是200mm/l咪唑洗脫液洗脫下的目的蛋白量最多，但是蛋白純度不高，雜蛋白含量很高，故進一步優化蛋白純化條件，使用以下方法進行純化。

加入20ml超純水于ni-ntahis-bind預裝柱中，使其緩慢的流過柱內填充的介質以沖洗介質；加入20mltris-結合緩沖液（20mm/ltris，500mm/lnacl，20mm/l咪唑，ph8.0）以平衡介質；上樣，加入10ml通過超聲破碎e.colibl21(de3)-tsp1提取的上清液，控制流速使上清液緩慢流過柱內介質；加入40mltris-結合緩沖液（20mm/ltris，500mm/lnacl，20mm/l咪唑，ph8.0），控制流速使其緩慢流過柱內介質以洗脫雜蛋白；加入1號洗脫液（100mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其緩慢流過柱內介質并收集；加入2號洗脫液（200mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其緩慢流過柱內介質并收集；加入3號洗脫液（300mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其緩慢流過柱內介質并收集；加入4號洗脫液（400mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其緩慢流過柱內介質并收集；加入5號洗脫液（500mm/l咪唑，20mm/ltris，500mm/lnacl，ph8.0）2ml，使其緩慢流過柱內介質并收集；將收集的洗脫液分別進行sds-page分析，檢查蛋白的純化程度?？梢娫谟?號洗脫液洗脫時得到純度很高的tsp1（見圖3b），該蛋白分子量約為29.7kd。sds-page結果見圖3中的b圖。

在圖3的b圖中，m：marker；1-2，bl21（de3）-pet30a-tsp1上清原樣；3，蛋白上樣過柱后流穿液；4，1號洗脫液；5，2號洗脫液；6，3號洗脫液；7，4號洗脫液；8，5號洗脫液（純化效果較好，純度高）。

實施例五檢測細粒棘球蚴病的elisa試劑盒

檢測細粒棘球蚴病的elisa試劑盒包括以下組分：

1、包被抗原：以實施例4得到的純化的重組蛋白為包被抗原，用ph9.6的0.05m/l碳酸鹽緩沖液稀釋純化的重組蛋白至終濃度8μg/ml；

2、封閉液：5g脫脂奶粉溶于100mltbst中；

3、陰性對照：健康人血清，1:200稀釋；

4、酶標二抗：過氧化物酶標記的羊抗人igg，1:10000稀釋；

5、tmb顯色液；

6、終止液：2mol/l濃硫酸。

實施例六細粒棘球絳蟲抗原tsp1的elisa檢測

以純化后的重組蛋白為抗原，對20份感染棘球蚴病人血清樣品和20份健康人血清樣品進行間接elisa檢測。具體方法如下：

用ph9.6的0.05m/l碳酸鹽緩沖液稀釋純化的重組蛋白至終濃度8μg/ml，每孔200包被96孔酶標板，4℃過夜；甩去孔中液體，以ph7.4的pbst洗板3次(5min/次)后每孔加入200μl封閉液，37℃封閉1小時。pbst洗板3次(5min/次)，每孔100分別加入細粒棘球蚴病患者和健康人血清（1∶200稀釋），37℃溫育1小時；pbst洗板3次，每孔100μl加入過氧化物酶標記的羊抗人igg（1：10000稀釋），37℃溫育1小時；pbst洗板3次，每孔100μl加入tmb顯色液，37℃避光反應30分鐘，每孔50μl加入2mol/l濃硫酸終止反應，測定吸光度（）值。以健康人血清的均值2倍加標準差為陽性判斷值。elisa檢測結果如表1所示，本發明的試劑盒對細粒棘球蚴病患者血清的診斷敏感性為90%（18/20），對細粒棘球蚴病有較好的免疫診斷價值。

表1細粒棘球絳蟲tsp1elisa檢測結果

最后應說明的是：以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。

序列表

<110>蘭州大學

<120>細粒棘球絳蟲tsp1重組蛋白及其可溶性表達方法和純化方法

<210>1

<211>1047

<212>dna

<213>細粒棘球絳蟲tsp1核苷酸序列

<400>1

ccggggaccacctacagcggcacacaatgaccactggttatgatataatgcgcagttcct60

gctcgacgttgacgcgattcatcatcggtctgctcaatctgattttgggagttacatttt120

tggtgcttggagtagttggcgtgctgctacgaaccaacaaggaattcttgcttaaattca180

ctaacagtctctccgaaaagttcctcaatgaggcttcacaagaacaggcggatgaaatag240

ctcaattcttgctaaaatacgatgttggaataccggcgatattcatcgtggtgggatttg300

ccatcaccggtgtctgcattctcgggttcatagcgacctgctgttcatgcaataaactcc360

tacaaatctatgcggtgattttaacatccattgttgtgatccaagttatcgccgttggag420

tcatctttggggtcccggacatataccgcagcttagcatttcagggcatggagaaaacgc480

ttgcctactacgatccgagcactcctgagggcaaagggtctgccagactgtgggatctta540

ttatgactgcaaacaaagagacctgttgcggaatggatggagccaatgacttcaaaaaca600

caccttttgatcccaagtgtccaaaatactgttgcaaagcagacaaggactgtttgatta660

ctgatgcattggcgttgactccaccggttgagggatgtcgtggaaagataagacgctacg720

ctgatgaatacatgttgaagattttggtcattcttatcatcttcatcgcttgccaggtag780

ttctttcaatcctcacctacgtggcactgacatgtaagactgcttccccaatatgagagg840

aggggcgccgtttgctgcaccaaattatctctgcttgttttctgcacctcatcattcact900

actgtgttaagagatgtgggttcctctcattgattccccttcactcacaaggaaagttaa960

taaagcgtagagatatgtgcattttttacgtaaaaaaaaaaaaaaaaaacatgtcggccg1020

cctcggcctatgtgcggccgccaccgc1047

<210>2

<211>269

<212>prt

<213>細粒棘球絳蟲tsp1重組蛋白

<400>2

metthrthrglytyraspilemetargsersercysserthrleuthr

151015

argpheileileglyleuleuasnleuileleuglyvalthrpheleu

202530

valleuglyvalvalglyvalleuleuargthrasnlysglupheleu

354045

leulysphethrasnserleuserglulyspheleuasnglualaser

505560

glngluglnalaaspgluilealaglnpheleuleulystyraspval

65707580

glyileproalailepheilevalvalglyphealailethrglyval

859095

cysileleuglypheilealathrcyscyssercysasnlysleuleu

100105110

glniletyralavalileleuthrserilevalvalileglnvalile

115120125

alavalglyvalilepheglyvalproaspiletyrargserleuala

130135140

pheglnglymetglulysthrleualatyrtyraspproserthrpro

145150155160

gluglylysglyseralaargleutrpaspleuilemetthralaasn

165170175

lysgluthrcyscysglymetaspglyalaasnaspphelysasnthr

180185190

propheaspprolyscysprolystyrcyscyslysalaasplysasp

195200205

cysleuilethraspalaleualaleuthrproprovalgluglycys

210215220

argglylysileargargtyralaaspglutyrmetleulysileleu

225230235240

valileleuileilepheilealacysglnvalvalleuserileleu

245250255

thrtyrvalalaleuthrcyslysthralaserproile

260265