本發明屬于生物技術領域，具體涉及gbp蛋白及其編碼基因在調控植物產量中的應用。

背景技術：

隨著人口數目的持續增加、耕地大面積的縮水和鹽漬化以及淡水資源的短缺問題的加劇，使得環境脅迫更加嚴峻，這樣就勢必影響全球的農業生產(rosegrantandcline,2003)。而高等植物本身植根于土壤之中，幾乎無自主性移動能力，主要依賴根從土壤中吸收養料和水分來維持生活周期。而且根的發育直接受各種環境因子的炮轟，因此對作物根系發育的研究會直接影響其產量。并且在多細胞植物的胚后發育過程中，幼苗的地上和地下部分的末端出現兩類干細胞群即莖頂端分生組織(sam)和根分生組織(rm)，這些干細胞在一定的時空條件下進行分裂，其子細胞除了自我更新外也作為各種組織和器官的細胞來源，維持了植物整個世代的生長發育(weigelandjürgens,2002；laux,2003)。

技術實現要素：

本發明的一個目的是提供gbp蛋白的新用途。

所述gbp蛋白是如下a)或b)或c)或d)的蛋白質：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白質；

b)在序列2所示的蛋白質的n端和/或c端連接標簽得到的融合蛋白質；

c)將序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質；

d)與序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白質。

本發明提供了gbp蛋白在調控植物根長和/或分蘗數和/或種子數和/或產量中的應用。

本發明的另一個目的是提供與gbp蛋白相關的生物材料的新用途。

本發明提供了與gbp蛋白相關的生物材料在調控植物根長和/或分蘗數和/或種子數和/或產量中的應用；

所述與gbp蛋白相關的生物材料為下述a1)至a12)中的任一種：

a1)編碼gbp蛋白的核酸分子；

a2)含有a1)所述核酸分子的表達盒；

a3)含有a1)所述核酸分子的重組載體；

a4)含有a2)所述表達盒的重組載體；

a5)含有a1)所述核酸分子的重組微生物；

a6)含有a2)所述表達盒的重組微生物；

a7)含有a3)所述重組載體的重組微生物；

a8)含有a4)所述重組載體的重組微生物；

a9)含有a1)所述核酸分子的轉基因植物細胞系；

a10)含有a2)所述表達盒的轉基因植物細胞系；

a11)含有a3)所述重組載體的轉基因植物細胞系；

a12)含有a4)所述重組載體的轉基因植物細胞系。

上述應用中，a1)所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其編碼序列是序列1所示的cdna分子或dna分子；

2)與1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼gbp蛋白的cdna分子或基因組dna分子；

3)在嚴格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼gbp蛋白的cdna分子或基因組dna分子。

上述應用中，所述調控為提高或降低。

本發明還有一個目的是提供gbp蛋白或與gbp蛋白相關的生物材料的新用途。

本發明提供了gbp蛋白或與gbp蛋白相關的生物材料在培育根長變長和/或分蘗數增加和/或種子數增加和/或產量提高的轉基因植物中的應用。

本發明還提供了gbp蛋白或與gbp蛋白相關的生物材料在培育根長變短和/或分蘗數減少和/或種子數減少和/或產量降低的植物中的應用。

本發明還提供了gbp蛋白或與gbp蛋白相關的生物材料在植物育種中的應用。

本發明還有一個目的是提供一種培育根長變長和/或分蘗數增加和/或種子數增加和/或產量提高的轉基因植物的方法。

本發明提供的培育根長變長和/或分蘗數增加和/或種子數增加和/或產量提高的轉基因植物的方法包括提高受體植物中gbp蛋白的含量和/或活性，得到轉基因植物的步驟；所述轉基因植物的根長和/或分蘗數和/或種子數和/或產量高于受體植物。

上述方法中，所述提高受體植物中gbp蛋白的表達量和/或活性的方法為在受體植物中過表達gbp蛋白；所述過表達的方法為將gbp蛋白的編碼基因導入受體植物。

上述方法中，所述gbp蛋白的編碼基因的核苷酸序列是序列1所示的dna分子。

在本發明的具體實施例中，所述gbp蛋白的編碼基因是通過重組載體pmdc32-35s::gbp導入受體植物。所述重組載體pmdc32-35s::gbp為將序列1所示的gbp基因重組到pmdc32載體的attr1(aaacaagtttgtacaaaaaa)和attr2(tttcttgtacaaagtgg)之間，且保持pmdc32載體的其他序列不變后得到的載體。重組載體pmdc32-35s::gbp表達gbp蛋白。

本發明的最后一個目的是提供一種培育根長變短和/或分蘗數減少和/或種子數減少和/或產量降低的植物的方法。

本發明提供的培育根長變短和/或分蘗數減少和/或種子數減少和/或產量降低的植物的方法包括降低植物中gbp蛋白的含量和/或活性，從而減小植物的根長和/或分蘗數和/或種子數和/或產量。

上述方法中，所述根長為主根長，所述分蘗數為單株分蘗數，所述種子數為單株種子數。

上述方法中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體可為禾本科植物；所述禾本科植物具體可為水稻；所述水稻具體可為gbp突變體或野生型水稻日本晴。

本發明首先從野生型水稻日本晴中上克隆到gbp基因，然后獲得了gbp基因突變的水稻gbp突變體，并且發現和野生型日本晴nip相比，gbp突變體根系萎縮，單株分蘗數、種子數和產量均有所降低，最后構建了超表達載體pmdc32-35s::gbp，并將超表達載體pmdc32-35s::gbp轉入野生型水稻日本晴中，得到t3代轉gbp水稻純合株系。通過實驗證明：和野生型nip相比，t3代轉gbp水稻純合株系oe8、oe10和oe13根系更加發達，單株分蘗數、種子數和產量均高于野生型nip。證明gbp在水稻根系生長以及產量生產方面發揮正向調節作用。

附圖說明

圖1為水稻gbp基因表達量下降后根系萎縮，表達量上調后根系發達。

圖2為水稻gbp基因表達量下降后分蘗數降低，表達量上調后分蘗數增加。

圖3為統計了水稻gbp基因表達量下降后單株種子數降低，表達量上調后單株種子數增加。

圖4為統計了水稻gbp基因表達量下降后單株分蘗數降低，表達量上調后單株分蘗數增加。

圖5為野生型日本晴nip和gbp突變體中gbp基因表達量檢測。

圖6為水稻gbp基因表達量下降后根長變短，表達量上調后根長變長。

圖7為水稻gbp基因表達量下降后主根長變短，表達量上調后主根長變長。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

下述實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。

實施例1、水稻gbp基因的克隆

1、rna的提取

提取野生型水稻日本晴葉片的rna。

2、cdna的獲得

以步驟1獲得的rna為模板，反轉錄得到cdna。

3、pcr擴增

以步驟2獲得的cdna為模板，采用引物5′-caccatggcgacgatgtctcgccgc-3′和5′-aacgttgaaccggaaaagcatg-3′進行pcr擴增，得到pcr擴增產物。

4、測序

將pcr擴增產物進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測并送交測序。測序結果表明：pcr擴增得到大小為1296bp的擴增產物，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，并將序列1所示的基因命名為gbp基因，gbp基因編碼序列表中序列2所示的蛋白質，將序列2所示的氨基酸序列命名為gbp蛋白。

實施例2、gbp突變體的獲得及其性狀檢測

一、gbp突變體的獲得

1、gbp突變體的獲得

將突變體種子(購買于韓國水稻基因沉默突變體公司，種子編號為pfg2b_30061)在30度培養箱中暗培養4天，移到營養液中培養10天，然后再移植到大田中，待一個月后取材提取dna，鑒定純合體，得到突變體植株，將其命名為gbp突變體。

對gbp突變體進行測序。測序結果表明：gbp突變體和野生型水稻日本晴的基因組序列相比，gbp突變體僅是在序列1所示的gbp基因第275-439位插入一段t-dna序列，其余序列與野生型日本晴全部相同。

2、gbp基因表達量檢測

提取野生型日本晴nip和gbp突變體的根的rna，然后反轉錄形成cdna。以獲得的cdna為模板，采用引物gbp-f1：5′-gcgcactcggctctgcgttc-3′和gbp-f2：5′-acatcgcacaacctgaaggatggaa-3′進行pcr半定量，并以ostubulin-rt-f:tcttccaccctgagcagctc和ostubulin-rt-r:aaccttggagaccagtgcag作為內參引物。

結果如圖5所示。從圖中可以看出，內參基因tubulin在野生型日本晴nip和gbp突變體中均能正常轉錄表達，而用引物gbp-f1和gbp-f2均只能在野生型日本晴nip中有擴增條帶，gbp突變體中無擴增產物，說明由于t-dna插入導致gbp突變體中的gbp基因不能正常轉錄表達。

3、gbp純合突變體的獲得

采用如下引物：gbp-f1：5′-gcgcactcggctctgcgttc-3′、gbp-f2：5′-acatcgcacaacctgaaggatggaa-3′和gbp-f3：5′-aacgctgatcaattccacag-3′對gbp突變體進行pcr鑒定，得到gbp純合突變體。

若引物gbp-f1和gbp-f2未擴增出大小為1425bp的條帶，且引物gbp-f2和gbp-f3擴增出大小為498bp的條帶的gbp突變體為gbp純合突變體。

二、gbp突變體的性狀檢測

分別將步驟一中獲得的gbp純合突變體植株(gbp)和野生型水稻日本晴(nip)種子在30℃黑暗培養箱中萌發四天，然后移植到營養液中，生長兩周，再將苗種植于水稻大田，六個月的正常生長，得到gbp純合突變體植株(gbp)和野生型水稻日本晴(nip)。實驗重復3次，結果取平均值。比較gbp純合突變體植株(gbp)和野生型水稻日本晴(nip)的根系生長情況，并統計單株分蘗數和種子數。

結果如圖1、圖2、圖3、圖4、圖6和圖7所示。從圖中可以看出：在正常條件下，和野生型日本晴nip相比，gbp突變體根系萎縮，主根長變短，單株分蘗數和種子數均低于野生型日本晴nip，在產量上有很大程度的降低。表明gbp在水稻根系生長以及產量生產方面發揮正向調節作用。

實施例3、轉gbp水稻的獲得及其性狀檢測

一、轉gbp水稻的獲得

1、重組載體pmdc32-35s::gbp的構建

利用gateway方法將實施例1中克隆得到的序列1所示的gbp基因連入pentr^tm/sd/d-topo載體(invitrogen，貨號為1711243)，得到重組載體pentr^tm/sd/d-topo-gbp，并對其進行測序驗證。經過測序表明：克隆的gbp基因沒有任何點突。

將重組載體pentr^tm/sd/d-topo-gbp、pmdc32載體(biovectorntcc)和重組酶(invitrogen)混勻，于22℃，過夜反應，使序列1所示的gbp基因重組到pmdc32載體的attr1(aaacaagtttgtacaaaaaa)和attr2(tttcttgtacaaagtgg)之間，得到重組載體pmdc32-35s::gbp。重組載體pmdc32-35s::gbp表達gbp蛋白。

2、重組菌的獲得

將重組載體pmdc32-35s::gbp轉入農桿菌eha105(biovectorntcc)中，得到重組菌pmdc32-35s::gbp/eha105。

3、轉gbp水稻的獲得

(1)用75％乙醇和2.5％次氯酸鈉消毒野生型nip水稻種子，然后均勻的鋪在誘導培養基上28℃避光培養28天，誘導愈傷組織。

(2)將誘導28天的愈傷組織來回猛搖幾次，從脫離的愈傷組織中挑選光滑、黃色并且較硬的大小在2-3mm的胚性愈傷，之后放在ms培養基上，28℃避光培養7天。

(3)刮取已活化3天的步驟2中獲得的重組菌pmdc32-35s::gbp/eha105，放入nbco液體培養基中，打散混勻，調od600至0.125。再將胚性愈傷放入上述nbco培養基中，靜止15-20分鐘，倒去菌液吸干均勻的鋪在已加濾紙的nbco共培養基中。于22℃避光培養3天。

(4)共培養愈傷用滅菌水洗三次，后用植物羧芐為500mg/l的滅菌水浸泡15分鐘，吸干放入選擇培養基中。

(5)挑取新長出的愈傷放入預分化培養基中，暗培養一周

(6)將(5)中暗培養的愈傷放入分化培養基，光照培養直到產生葉綠素；

(7)將產生葉綠素的陽性愈傷轉移到生根壯苗培養基中，28℃光照培養，直到長成陽性幼苗；

(8)將陽性幼苗移植到大田，收到的種子即為t1代；

(9)將t1代的種子用潮霉素篩選，將有抗性的小苗移植到水稻田，然后單株收種子即為t2代；

(10)將單株收到的t2代的種子分別用潮霉素篩選，查看種子萌發比例，全部萌發的即為轉基因純和株系。然后將全部萌發的t2代的苗轉移到大田，收種子即為t3代轉gbp水稻純合株系。

4、pcr鑒定

用引物gbp-f1：5′-gcgcactcggctctgcgttc-3′和gbp-f2：5′-acatcgcacaacctgaaggatggaa-3′對t3代轉gbp水稻純合株系進行pcr半定量鑒定。結果如圖5所示。t3代轉gbp水稻純合株系oe8、oe10和oe13中均高表達gbp基因。

二、轉gbp水稻的性狀檢測

分別將步驟一中獲得的陽性t3代轉gbp水稻純合株系oe8、oe10和oe13及野生型水稻日本晴(nip)種子在30℃黑暗培養箱中萌發四天，然后移植到營養液中，生長兩周，再將苗種植于水稻田，六個月的正常生長，每個不同品種的水稻取10株進行統計，實驗重復3次，結果取平均值。比較t3代轉gbp水稻純合株系和野生型水稻日本晴(nip)的根系生長情況，并統計單株分蘗數和種子數。

結果如圖1、圖2、圖3、圖4、圖6和圖7所示。從圖中可以看出：在正常條件下，和野生型日本晴nip相比，t3代轉gbp水稻純合株系oe8、oe10和oe13根系更加發達，主根長變長，單株分蘗數和種子數均高于野生型日本晴nip，在產量上有很大程度的提高。上述結果表明，gbp在水稻根系生長以及產量生產方面發揮正向調節作用。

序列表

<110>河北師范大學

<120>gbp蛋白及其編碼基因在調控植物產量中的應用

<160>2

<210>1

<211>1296bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

atggcgacgatgtctcgccgcgcactcggctctgcgttcgcgggattcacgcggacacca60

gctatgactccgacggccaccttgccttcctcgtgcgcgtccccggcgcgtctcctgcgg120

tggcgccggagcgcgggtgtaggcgcccggcggttcgcgtccggccgcaacgcgcggatt180

agcatgagcctccgcgccggcatcgtcggcctgcccaacgtcggcaagtccacactcttc240

aatgccattgttgaaaatgggaaggcacaagctgcaaactttcccttctgcaccataaac300

cccaacgttggtgttgtggctatcccagatgctcgcttgcatgtgctctcaaaattaagc360

aagtctaaggagacaatcccaacatccatagagcttgtggatattgcaggtctcgtcaaa420

ggagcaagcaaaggagagggactaggaaaccaatttctttcgaacatccgtgaggttgat480

tccatccttcaggttgtgcgatgttttgaagatgatgatattgttcatgtgagtgggaaa540

gttgatcccaaatcagatattgatgtaattaatctggagcttatattttctgatcttgac600

cagatagagaaaagactggataagcttaaaaagagcaaaactaaagaccagcaagtaaag660

gtcaaggaacaagcagagaggactggattggaaaaaattcagactgtacttatggatgga720

aaacctgctagatctgttgatttggctgaccatgagaaagaagctatccaacatctttgt780

ctactaactatgaaacctgtcatttatgttgccaacgtaactgaatctgatcttgctgaa840

cctggtaacaaccctcatgtcaaagaggtagccaaactagcaacagacttggaatctggc900

atggttacaatatcagctcaggttgaggctgaacttgctgaactgccattagaagagaga960

gtcgaatatctaaaatcccttggtgttactgaaagtggactaggaaatttggtaaaggca1020

acatatgaccttctgggattgaggacttatttcacaactggagataaggaaacaaaagct1080

tggactattcttgcaggcatgactgcacctcaagcagcaggagttattcacagtgacttt1140

cagaaaggcttcattagagctgaaactgtatcatatgatgattttgtcgcggcgggttct1200

cttggagttgcaagggagaagggattgttgaggttggaagggaaggattacatcgtgcag1260

gaaggcgatgtcatgcttttccggttcaacgtttga1296

<210>2

<211>431

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

metalathrmetserargargalaleuglyseralaphealaglyphe

151015

thrargthrproalametthrprothralathrleuprosersercys

202530

alaserproalaargleuleuargtrpargargseralaglyvalgly

354045

alaargargphealaserglyargasnalaargilesermetserleu

505560

argalaglyilevalglyleuproasnvalglylysserthrleuphe

65707580

asnalailevalgluasnglylysalaglnalaalaasnpheprophe

859095

cysthrileasnproasnvalglyvalvalalaileproaspalaarg

100105110

leuhisvalleuserlysleuserlysserlysgluthrileprothr

115120125

serilegluleuvalaspilealaglyleuvallysglyalaserlys

130135140

glygluglyleuglyasnglnpheleuserasnilearggluvalasp

145150155160

serileleuglnvalvalargcysphegluaspaspaspilevalhis

165170175

valserglylysvalaspprolysseraspileaspvalileasnleu

180185190

gluleuilepheseraspleuaspglnileglulysargleuasplys

195200205

leulyslysserlysthrlysaspglnglnvallysvallysglugln

210215220

alagluargthrglyleuglulysileglnthrvalleumetaspgly

225230235240

lysproalaargservalaspleualaasphisglulysglualaile

245250255

glnhisleucysleuleuthrmetlysprovaliletyrvalalaasn

260265270

valthrgluseraspleualagluproglyasnasnprohisvallys

275280285

gluvalalalysleualathraspleugluserglymetvalthrile

290295300

seralaglnvalglualagluleualagluleuproleuglugluarg

305310315320

valglutyrleulysserleuglyvalthrgluserglyleuglyasn

325330335

leuvallysalathrtyraspleuleuglyleuargthrtyrphethr

340345350

thrglyasplysgluthrlysalatrpthrileleualaglymetthr

355360365

alaproglnalaalaglyvalilehisserasppheglnlysglyphe

370375380

ileargalagluthrvalsertyraspaspphevalalaalaglyser

385390395400

leuglyvalalaargglulysglyleuleuargleugluglylysasp

405410415

tyrilevalglngluglyaspvalmetleupheargpheasnval

420425430