背景技術：

惡性腫瘤的發病是由多種外源性致癌物誘導和內源性基因表達失控共同作用的結果，其中基因的異常表達包括多種癌基因的活化和/或多種抑癌基因的失活。fbxw7基因(f框/wd40域蛋白基因)又稱hcdc4，其表達的蛋白屬于f-box蛋白，是scf(skp1-cul1-fbox)泛素連接酶的靶蛋白識別組分，參與降解周期蛋白myc，notch1等，在人體細胞周期的進程、細胞的生長和分化中發揮著重要的調節作用，其缺失能引起和/或加快癌細胞增殖，是近年來發現的重要的抑癌基因。

fbxw7基因共有12個外顯子，在人類基因組中高度保守，其表達的蛋白有3個結構域，包括f-box，wd40重復序列和d結構域。其中n末端的wd40重復序列為底物結合域。fbxw7基因在癌癥中的整體突變率約為6％，而在急性t淋巴細胞白血病中的突變率高達31％，且43％的突變發生在兩個突變熱點：arg465和arg479，頻率約為29％和14％。fbxw7的突變將影響自身功能，進而對下游參與細胞周期的蛋白產生影響，使血液中的白細胞上升，導致疾病發生。akhoondi等發現fbxw7突變體可上調cycline的水平并且延長其半衰期。oneil等現fbxw7突變體和野生型共同形成的異二聚體雖然能和作為靶標的myc結合，但卻不能正常地使其降解。2013年，king等將fbxw7突變體轉入小鼠的白血病造血干細胞中，發現癌細胞大量擴增，說明該基因突變使得白血病干細胞更具侵染性。

目前，fbxw7突變對于預后的意義存在差異，主要原因是：不同的治療方案對預后有不同的影響；白血病的成因復雜，有其他的不良因素同時干擾等。但是檢測fbxw7的突變是否存在，對于白血病風險預測以及針對性制定治療方案無疑有積極意義。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供檢測fbxw7基因突變的寡核苷酸，采用pcr技術，可用于快速檢測急性t淋巴細胞白血病患者體內的fbxw7基因外顯子突變情況。所述寡核苷酸包括至少一對擴增fbxw7基因外顯子的引物，所述至少一對擴增引物選自fbxw7-1f/fbxw7-1r、fbxw7-2f/fbxw7-2r、fbxw7-3f/fbxw7-3r、fbxw7-4f/fbxw7-4r、fbxw7-5f/fbxw7-5r、fbxw7-6f/fbxw7-6r、fbxw7-7/8f/fbxw7-7/8r、fbxw7-9f/fbxw7-9r、fbxw7-10f/fbxw7-10r、fbxw7-11f/fbxw7-11r、fbxw7-12f/fbxw7-12r，其堿基序列為：

fbxw7-1f:tgtaaaacgacggccagtggttgccgcctggtttag；

fbxw7-1r:aacagctatgaccatgtccctttgccaactgctg；

fbxw7-2f:tgtaaaacgacggccagttgttttttaccctattttcccc；

fbxw7-2r:aacagctatgaccatgcctctacaccccacacaagc；

fbxw7-3f:tgtaaaacgacggccagtatcatcacacactgttcttctgg；

fbxw7-3r:aacagctatgaccatggtaacaagacacaggggctcata；

fbxw7-4f:tgtaaaacgacggccagtacaggcgttatataggagggag；

fbxw7-4r:aacagctatgaccatgtttgcagcaattaagtgaggc；

fbxw7-5f:tgtaaaacgacggccagtcctgatcaactatggttgtgtg；

fbxw7-5r:aacagctatgaccatgcaatgtttaaaggtggtagctgt；

fbxw7-6f:tgtaaaacgacggccagtaagagcagagacagagaggttta；

fbxw7-6r:aacagctatgaccatgattcggctcatctgaatgtgtag；

fbxw7-7/8f:

tgtaaaacgacggccagtgaaggcaatttactcttgaactg；

fbxw7-7/8r:aacagctatgaccatgtgagctctgatatttgctatcca；

fbxw7-9f:tgtaaaacgacggccagtgtgatgggatcattttatacgg；

fbxw7-9r:aacagctatgaccatgaatagaggaagaagtcccaacc；

fbxw7-10f:tgtaaaacgacggccagttgtttttctgtttctccctctg；

fbxw7-10r:aacagctatgaccatgctggatcagcaatttgacagtg；

fbxw7-11f:tgtaaaacgacggccagtccccctttcctactaggattaa；

fbxw7-11r:aacagctatgaccatgtgctaaggctccatatttctct；

fbxw7-12f:tgtaaaacgacggccagttcctaaaatactgaggacatggg；

fbxw7-12r:aacagctatgaccatgaaaaaaaaagcttttcatgataa。

進一步地，所述寡核苷酸還包括一對測序引物m13f和m13r，其堿基序列為：

m13f：tgtaaaacgacggccagt；

m13r：aacagctatgaccatg。

進一步地，fbxw7-1f：fbxw7-1r、fbxw7-2f：fbxw7-2r、fbxw7-3f：fbxw7-3r、fbxw7-4f：fbxw7-4r、fbxw7-5f：fbxw7-5r、fbxw7-6f：fbxw7-6r、fbxw7-7/8f：fbxw7-7/8r、fbxw7-9f：fbxw7-9r、fbxw7-10f：fbxw7-10r、fbxw7-11f：fbxw7-11r、fbxw7-12f：fbxw7-12r的比值均為1。

進一步地，m13f：m13r的比值為1。

進一步地，所述寡核苷酸在輔助檢測急性t淋巴細胞白血病中的應用。

本發明的目的還在于提供一種檢測fbxw7基因突變的方法，包括以下步驟：

(1)抽提樣本中的基因組dna；

(2)利用至少一對擴增引物對(1)中的dna進行擴增，獲得擴增產物；

(3)利用一對測序引物m13f和m13r對(2)中的擴增產物進行測序，獲得所述擴增產物的堿基序列；

(4)將(3)中的堿基序列與fbxw7基因野生型參考序列進行比較，確定突變位點是否存在，其中，所述至少一對擴增引物選自fbxw7-1f/fbxw7-1r、fbxw7-2f/fbxw7-2r、fbxw7-3f/fbxw7-3r、fbxw7-4f/fbxw7-4r、fbxw7-5f/fbxw7-5r、fbxw7-6f/fbxw7-6r、fbxw7-7/8f/fbxw7-7/8r、fbxw7-9f/fbxw7-9r、fbxw7-10f/fbxw7-10r、fbxw7-11f/fbxw7-11r、fbxw7-12f/fbxw7-12r，其堿基序列為：

fbxw7-1f:tgtaaaacgacggccagtggttgccgcctggtttag；

fbxw7-1r:aacagctatgaccatgtccctttgccaactgctg；

fbxw7-2f:tgtaaaacgacggccagttgttttttaccctattttcccc；

fbxw7-2r:aacagctatgaccatgcctctacaccccacacaagc；

fbxw7-3f:tgtaaaacgacggccagtatcatcacacactgttcttctgg；

fbxw7-3r:aacagctatgaccatggtaacaagacacaggggctcata；

fbxw7-4f:tgtaaaacgacggccagtacaggcgttatataggagggag；

fbxw7-4r:aacagctatgaccatgtttgcagcaattaagtgaggc；

fbxw7-5f:tgtaaaacgacggccagtcctgatcaactatggttgtgtg；；；

fbxw7-5r:aacagctatgaccatgcaatgtttaaaggtggtagctgt；

fbxw7-6f:tgtaaaacgacggccagtaagagcagagacagagaggttta；

fbxw7-6r:aacagctatgaccatgattcggctcatctgaatgtgtag；

fbxw7-7/8f:

tgtaaaacgacggccagtgaaggcaatttactcttgaactg；

fbxw7-7/8r:aacagctatgaccatgtgagctctgatatttgctatcca；

fbxw7-9f:tgtaaaacgacggccagtgtgatgggatcattttatacgg；

fbxw7-9r:aacagctatgaccatgaatagaggaagaagtcccaacc；

fbxw7-10f:tgtaaaacgacggccagttgtttttctgtttctccctctg；

fbxw7-10r:aacagctatgaccatgctggatcagcaatttgacagtg；

fbxw7-11f:tgtaaaacgacggccagtccccctttcctactaggattaa；

fbxw7-11r:aacagctatgaccatgtgctaaggctccatatttctct；

fbxw7-12f:tgtaaaacgacggccagttcctaaaatactgaggacatggg；

fbxw7-12r:aacagctatgaccatgaaaaaaaaagcttttcatgataa；

所示

m13f：tgtaaaacgacggccagt；

m13r：aacagctatgaccatg。

進一步地，fbxw7-1f：fbxw7-1r、fbxw7-2f：fbxw7-2r、fbxw7-3f：fbxw7-3r、fbxw7-4f：fbxw7-4r、fbxw7-5f：fbxw7-5r、fbxw7-6f：fbxw7-6r、fbxw7-7/8f：fbxw7-7/8r、fbxw7-9f：fbxw7-9r、fbxw7-10f：fbxw7-10r、fbxw7-11f：fbxw7-11r、fbxw7-12f：fbxw7-12r的比值均為1。

進一步地，m13f：m13r的比值為1。

進一步地，所述方法在輔助檢測急性t淋巴細胞白血病中的應用。

本發明的目的還在于提供一種檢測fbxw7基因突變的試劑盒，所述試劑盒包括檢測體系pcr擴增反應液、測序體系反應液，其中，檢測體系pcr擴增反應液包括至少一對擴增引物，所述測序體系反應液包括一對測序引物m13f和m13r，所述至少一對擴增引物選自fbxw7-1f/fbxw7-1r、fbxw7-2f/fbxw7-2r、fbxw7-3f/fbxw7-3r、fbxw7-4f/fbxw7-4r、fbxw7-5f/fbxw7-5r、fbxw7-6f/fbxw7-6r、fbxw7-7/8f/fbxw7-7/8r、fbxw7-9f/fbxw7-9r、fbxw7-10f/fbxw7-10r、fbxw7-11f/fbxw7-11r、fbxw7-12f/fbxw7-12r，其堿基序列為：

fbxw7-1f:tgtaaaacgacggccagtggttgccgcctggtttag；

fbxw7-1r:aacagctatgaccatgtccctttgccaactgctg；

fbxw7-2f:tgtaaaacgacggccagttgttttttaccctattttcccc；

fbxw7-2r:aacagctatgaccatgcctctacaccccacacaagc；

fbxw7-3f:tgtaaaacgacggccagtatcatcacacactgttcttctgg；

fbxw7-3r:aacagctatgaccatggtaacaagacacaggggctcata；

fbxw7-4f:tgtaaaacgacggccagtacaggcgttatataggagggag；

fbxw7-4r:aacagctatgaccatgtttgcagcaattaagtgaggc；

fbxw7-5f:tgtaaaacgacggccagtcctgatcaactatggttgtgtg；

fbxw7-5r:aacagctatgaccatgcaatgtttaaaggtggtagctgt；

fbxw7-6f:tgtaaaacgacggccagtaagagcagagacagagaggttta；

fbxw7-6r:aacagctatgaccatgattcggctcatctgaatgtgtag；

fbxw7-7/8f:

tgtaaaacgacggccagtgaaggcaatttactcttgaactg；

fbxw7-7/8r:aacagctatgaccatgtgagctctgatatttgctatcca；

fbxw7-9f:tgtaaaacgacggccagtgtgatgggatcattttatacgg；

fbxw7-9r:aacagctatgaccatgaatagaggaagaagtcccaacc；

fbxw7-10f:tgtaaaacgacggccagttgtttttctgtttctccctctg；

fbxw7-10r:aacagctatgaccatgctggatcagcaatttgacagtg；

fbxw7-11f:tgtaaaacgacggccagtccccctttcctactaggattaa；

fbxw7-11r:aacagctatgaccatgtgctaaggctccatatttctct；

fbxw7-12f:tgtaaaacgacggccagttcctaaaatactgaggacatggg；

fbxw7-12r:aacagctatgaccatgaaaaaaaaagcttttcatgataa；

所述一對測序引物的堿基序列為：

m13f：tgtaaaacgacggccagt；

m13r：aacagctatgaccatg。

進一步地，fbxw7-1f：fbxw7-1r、fbxw7-2f：fbxw7-2r、fbxw7-3f：fbxw7-3r、fbxw7-4f：fbxw7-4r、fbxw7-5f：fbxw7-5r、fbxw7-6f：fbxw7-6r、fbxw7-7/8f：fbxw7-7/8r、fbxw7-9f：fbxw7-9r、fbxw7-10f：fbxw7-10r、fbxw7-11f：fbxw7-11r、fbxw7-12f：fbxw7-12r的比值均為1。

進一步地，m13f：m13r的比值為1。

進一步地，所述檢測體系pcr擴增反應液還包括2×pcrbuffer、dntps和kodfxdnapolymerase。

進一步地，所述測序體系反應液還包括測序純化液、牛小腸堿性磷酸酶、edta、無水乙醇、75％乙醇、hidi和bigdyeterminatorv3.1。

進一步地，所述測序純化液包括核酸外切酶i、牛小腸堿性磷酸酶。

進一步地，所述試劑盒還包括陽性對照品、陰性對照品和空白對照品。

進一步地，所述試劑盒在輔助檢測急性t淋巴細胞白血病中的應用。

進一步地，引物序列fbxw7-1f和fbxw7-1r是擴增fbxw7基因第1號外顯子序列的引物，引物序列fbxw7-2f和fbxw7-2r是擴增fbxw7基因第2號外顯子序列的引物，引物序列fbxw7-3f和fbxw7-3r是擴增fbxw7基因第3號外顯子序列的引物，引物序列fbxw7-4f和fbxw7-4r是擴增fbxw7基因第4號外顯子序列的引物，引物序列fbxw7-5f和fbxw7-5r是擴增fbxw7基因第5號外顯子序列的引物，引物序列fbxw7-6f和fbxw7-6r是擴增fbxw7基因第6號外顯子序列的引物，引物序列fbxw7-7/8f和fbxw7-7/8r是擴增fbxw7基因第7和8號外顯子序列的引物，引物序列fbxw7-9f和fbxw7-9r是擴增fbxw7基因第9號外顯子序列的引物，引物序列fbxw7-10f和fbxw7-10r是擴增fbxw7基因第10號外顯子序列的引物，引物序列fbxw7-11f和fbxw7-11r是擴增fbxw7基因第11號外顯子序列的引物，引物序列fbxw7-12f和fbxw7-12r是擴增fbxw7基因第12號外顯子序列的引物。

有益效果：(1)本發明設計了擴增fbxw7基因全部12個外顯子序列的引物，通過加接頭，使所有11對引物的pcr產物均可以用一對測序引物進行測序，而現有的測序技術要對每種擴增產物設計特異性的測序引物，這就需要設計11條測序引物(單向測序)或22條測序引物(雙向測序)，因此，本發明提供的擴增引物既能將所述fbxw7全外顯子序列都擴增出來，也保證無論這些外顯子的何處位置發生突變，都不會出現漏檢的情況；(2)在設計引物時，通過讓fbxw7基因的第7和8號外顯子共用一對引物，讓fbxw7基因的第7和8號外顯子共用一對引物，降低擴增引物的數量，這也會降低擴增產物的數量，從而降低測序引物的數量，因而極大地降低檢測成本；(3)本發明采用pcr技術，通過調整引物濃度、退火溫度等反應條件，可使擴增效率達到最佳；(4)常用的熒光定量pcr法要針對fbxw7基因全部12個外顯子可能發生突變的眾多突變位點設計多個探針，因此，在12個外顯子中，假設每個外顯子存在3個突變位點，則要設計36個探針，檢測成本顯著增加，而本發明通過給設計的擴增引物添加接頭，僅需使用一對測序引物就可檢測這36個突變位點以及還未被發現的其他突變類型，從而使得檢測成本顯著降低。

附圖說明

圖1為fbxw7基因在染色體上的定位圖。

圖2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12為fbxw7-1f/fbxw7-1r、fbxw7-2f/fbxw7-2r、fbxw7-3f/fbxw7-3r、fbxw7-4f/fbxw7-4r、fbxw7-5f/fbxw7-5r、fbxw7-6f/fbxw7-6r、fbxw7-7/8f/fbxw7-7/8r、fbxw7-9f/fbxw7-9r、fbxw7-10f/fbxw7-10r、fbxw7-11f/fbxw7-11r、fbxw7-12f/fbxw7-12r的電泳圖。

圖13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23分別為樣本1的fbxw7基因第1、2、3、4、5、6、7/8、9、10、11、12號外顯子野生型測序截圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例和附圖，進一步闡述本發明。應當注意的是，實施例中未說明的常規條件和方法，通常按照所屬領域實驗人員常規采用方法：譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學實驗指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。

實施例1

一種檢測fbxw7基因多態突變位點的寡核苷酸，該寡核苷酸是針對fbxw7基因至少一個外顯子所設計的，包括至少一對擴增引物，所述至少一對擴增引物選自fbxw7-1f/fbxw7-1r、fbxw7-2f/fbxw7-2r、fbxw7-3f/fbxw7-3r、fbxw7-4f/fbxw7-4r、fbxw7-5f/fbxw7-5r、fbxw7-6f/fbxw7-6r、fbxw7-7/8f/fbxw7-7/8r、fbxw7-9f/fbxw7-9r、fbxw7-10f/fbxw7-10r、fbxw7-11f/fbxw7-11r、fbxw7-12f/fbxw7-12r，其堿基序列為：

fbxw7-1f:tgtaaaacgacggccagtggttgccgcctggtttag

fbxw7-1r:aacagctatgaccatgtccctttgccaactgctg

fbxw7-2f:tgtaaaacgacggccagttgttttttaccctattttcccc

fbxw7-2r:aacagctatgaccatgcctctacaccccacacaagc

fbxw7-3f:tgtaaaacgacggccagtatcatcacacactgttcttctgg

fbxw7-3r:aacagctatgaccatggtaacaagacacaggggctcata

fbxw7-4f:tgtaaaacgacggccagtacaggcgttatataggagggag

fbxw7-4r:aacagctatgaccatgtttgcagcaattaagtgaggc

fbxw7-5f:tgtaaaacgacggccagtcctgatcaactatggttgtgtg

fbxw7-5r:aacagctatgaccatgcaatgtttaaaggtggtagctgt

fbxw7-6f:tgtaaaacgacggccagtaagagcagagacagagaggttta

fbxw7-6r:aacagctatgaccatgattcggctcatctgaatgtgtag

fbxw7-7/8f:tgtaaaacgacggccagtgaaggcaatttactcttgaactg

fbxw7-7/8r:aacagctatgaccatgtgagctctgatatttgctatcca

fbxw7-9f:tgtaaaacgacggccagtgtgatgggatcattttatacgg

fbxw7-9r:aacagctatgaccatgaatagaggaagaagtcccaacc

fbxw7-10f:tgtaaaacgacggccagttgtttttctgtttctccctctg

fbxw7-10r:aacagctatgaccatgctggatcagcaatttgacagtg

fbxw7-11f:tgtaaaacgacggccagtccccctttcctactaggattaa

fbxw7-11r:aacagctatgaccatgtgctaaggctccatatttctct

fbxw7-12f:tgtaaaacgacggccagttcctaaaatactgaggacatggg

fbxw7-12r:aacagctatgaccatgaaaaaaaaagcttttcatgataa

所述寡核苷酸還包括一對測序引物m13f和m13r，其堿基序列為：

m13f：tgtaaaacgacggccagt；

m13r：aacagctatgaccatg。

一種檢測fbxw7基因突變的試劑盒，包括檢測體系pcr擴增反應液和測序體系反應液，其中，

檢測體系pcr擴增反應液包括：2×pcrbuffer(10.0μl)；dntps(2mm)；kodfxdnapolymerase(1u/μl)；fbxw7基因12個外顯子的上、下游引物fbxw7-1f(10μm)、fbxw7-1r(10μm)、fbxw7-2f(10μm)、fbxw7-2r(10μm)、fbxw7-3f(10μm)、fbxw7-3r(10μm)、fbxw7-4f(10μm)、fbxw7-4r(10μm)、fbxw7-5f(10μm)、fbxw7-5r(10μm)、fbxw7-6f(10μm)、fbxw7-6r(10μm)、fbxw7-7/8f(10μm)、fbxw7-7/8r(10μm)、fbxw7-9f(10μm)、fbxw7-9r(10μm)、fbxw7-10f(10μm)、fbxw7-10r(10μm)、fbxw7-11f(10μm)、fbxw7-11r(10μm)、fbxw7-12f(10μm)、fbxw7-12r(10μm)。

測序體系反應液包括：測序純化液(核酸外切酶i:0.6u，牛小腸堿性磷酸酶:1.2u)；edta(125mm)；無水乙醇；75％乙醇；hidi(高度去離子甲酰胺)；一對測序引物m13f(3.2μm)、m13r(3.2μm)；bigdyeterminatorv3.1(購買自美國appliedbiosystems公司)。

優選地，該試劑盒還包括血液dna抽提試劑。

優選地，該試劑盒還包括陽性對照品、陰性對照品和空白對照品。陽性對照品為含有人fbxw7基因外顯子dna的溶液，嚴禁反復凍融。陰性對照品為ddh2o。空白對照品為2μl生理鹽水或不加任何物質。

實施例2血液樣本dna抽提

血液樣本dna抽提(根據天根生物血液/細胞/組織基因dna提取試劑盒說明書)：抽提人血液樣本dna，具體抽提方法如下：

(1)抽取300μl血液加入900μl紅細胞裂解液，顛倒混勻，室溫放置5分鐘，期間再顛倒混勻幾次。12000rpm離心1min，吸去上清，留下白細胞沉淀，加200μl緩沖液ga，振蕩至徹底混勻；

(2)加入20μl蛋白酶k溶液，混勻；

(3)加入200μl緩沖液gb，充分顛倒混勻，70℃放置10分鐘，溶液應變清亮，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠；

(4)加入200μl無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能會出現絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠；

(5)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱cb3放回收集管中；

(6)向吸附柱cb3中加入500μl緩沖液gd(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱cb3放入收集管中；

(7)向吸附柱cb3中加入700μl漂洗液pw(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱cb3放入收集管中；

(8)向吸附柱cb3中加入500μl漂洗液pw，12000rpm離心30秒，倒掉廢液；

(9)將吸附柱cb3放回收集管中，12000rpm離心2分鐘，倒掉廢液，將吸附柱cb3置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；

(10)將吸附柱cb3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100μl洗脫緩沖液te，室溫放置2～5分鐘，12000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。

實施例3樣本dna擴增

按照實施例2抽提的血液樣本dna，然后利用實施例1中的擴增引物擴增人fbxw7基因外顯子，獲得擴增產物。擴增時在常規pcr儀上進行，可用儀器包括abiveriti(美國appliedbiosystems公司)等。詳情如下所示：

(i)按樣品數n(樣品數＝待測樣本數+陰性對照1個+陽性對照1個+空白對照1個)取測體系pcr擴增反應液，每管19μl分裝于反應管中；

(ii)將上述處理好的待測樣本和陰性對照品、陽性對照品各取1μl分別加入反應管中，混勻，低速離心數秒，進行pcr擴增，獲得擴增產物。測體系pcr擴增反應液配制方法如表1所示。pcr擴增擴增反應條件如表2所示。每對擴增引物的詳細信息如表3所示。

表1.測體系pcr擴增反應液配制

注：表中的primerf和primerr選自fbxw7-1f/fbxw7-1r、fbxw7-2f/fbxw7-2r、fbxw7-3f/fbxw7-3r、fbxw7-4f/fbxw7-4r、fbxw7-5f/fbxw7-5r、fbxw7-6f/fbxw7-6r、fbxw7-7/8f/fbxw7-7/8r、fbxw7-9f/fbxw7-9r、fbxw7-10f/fbxw7-10r、fbxw7-11f/fbxw7-11r、fbxw7-12f/fbxw7-12r。

表2.pcr擴增擴增反應條件

表3.每對擴增引物信息

實施例4sanger測序

取9μl實施例3中的擴增產物和2μl實施例1中的測序純化液按照表4中所述的程序進行純化，從而獲得純化產物。

表4純化程序

將1μl所獲得的純化產物分別與實施例1中的測序引物m13f(3.2μm)、m13r(3.2μm)按照表5中的體系進行混合，然后按照表6中的測序反應程序進行測序。

表5

表6.測序反應程序

沉淀環節：

向完成測序反應的產物中加入2μl125mm的edta，靜置5min；加入15μl無水乙醇，漩渦混勻；3700rpm離心30min；倒置離心15sec，加入50μl70％乙醇，漩渦混勻；3700rpm離心15min；倒置離心15sec，置于95℃金屬浴上；加入10μlhidi后進行變性試驗。變性試驗步驟為：95℃，5min；接著在-30℃2min，然后在4℃保存。

變性程序結束后，上測序儀(abi3730)測序。

結果判斷：

分別將測序結果與fbxw7野生型參考序列(genbankaccn：nc_000004.12)進行比對，根據實際突變情況對結果進行報告。

實施例5臨床樣本檢測

取16例臨床血液樣本(樣本編號為1～16)先后按照實施例1、實施例2、實施例3和實施例4，配制試劑、抽提樣本dna、擴增(獲得擴增產物)和測序。每份樣本往檢測體系pcr反應液中加入1μl。

利用所獲得的擴增產物，開展dna電泳，電泳條件為1.5％瓊脂糖凝膠電泳，110v，25min，凝膠成像系統觀察。電泳結果如圖2～12所示。

圖2～12為這16例血液樣本以fbxw7-1f/fbxw7-1r、fbxw7-2f/fbxw7-2r、fbxw7-3f/fbxw7-3r、fbxw7-4f/fbxw7-4r、fbxw7-5f/fbxw7-5r、fbxw7-6f/fbxw7-6r、fbxw7-7/8f/fbxw7-7/8r、fbxw7-9f/fbxw7-9r、fbxw7-10f/fbxw7-10r、fbxw7-11f/fbxw7-11r、fbxw7-12f/fbxw7-12r等11對擴增引物擴增后所得擴增產物的電泳圖譜，m為markerdl2000，1～16為送檢的血液樣本編號1～16號。這11對引物擴增的片段長度分別為411bp、907bp、639bp、410bp、312bp、533bp、1361bp、376bp、340bp、368bp、970bp，通過電泳圖的分析表明這11對引物擴增有效，且條帶單一。

在這16例樣品中，以樣本1為例進行詳細說明。樣本1的測序結果如圖13～23所示。

圖13顯示是樣本1的fbxw7基因第1號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的1號外顯子未發生突變。

圖14顯示是樣本1的fbxw7基因第2號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的2號外顯子未發生突變。

圖15顯示是樣本1的fbxw7基因第3號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的3號外顯子未發生突變。

圖16顯示是樣本1的fbxw7基因第4號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的4號外顯子未發生突變。

圖17顯示是樣本1的fbxw7基因第5號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的5號外顯子未發生突變。

圖18顯示是樣本1的fbxw7基因第6號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的6號外顯子未發生突變。

圖19顯示是樣本1的fbxw7基因第7/8號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的7、8號外顯子未發生突變。

圖20顯示是樣本1的fbxw7基因第9號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的9號外顯子未發生突變。

圖21顯示是樣本1的fbxw7基因第10號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的10號外顯子未發生突變。

圖22顯示是樣本1的fbxw7基因第11號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的11號外顯子未發生突變。

圖23顯示是樣本1的fbxw7基因第12號外顯子野生型測序截圖，說明樣本1的12號外顯子未發生突變。

從檢測結果可以看出，本發明所述引物已經把fbxw7基因共12個外顯子序列包括在內了，能夠擴展出fbxw7基因全部12個外顯子，并且測序結果完全準確。由檢測結果可知，樣本1的12個外顯子均為野生型。另外，對fbxw7基因外顯子突變陽性樣本的檢測也表明本發明的寡核苷酸、方法和試劑盒能夠檢測出fbxw7基因外顯子突變的突變情況。

sequencelisting

<110>武漢艾迪康醫學檢驗所有限公司

<120>檢測fbxw7基因突變的方法、寡核苷酸及其應用

<130>

<160>24

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tgtaaaacgacggccagtggttgccgcctggtttag36

<210>2

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

aacagctatgaccatgtccctttgccaactgctg34

<210>3

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tgtaaaacgacggccagttgttttttaccctattttcccc40

<210>4

<211>36

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

aacagctatgaccatgcctctacaccccacacaagc36

<210>5

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

tgtaaaacgacggccagtatcatcacacactgttcttctgg41

<210>6

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

aacagctatgaccatggtaacaagacacaggggctcata39

<210>7

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

tgtaaaacgacggccagtacaggcgttatataggagggag40

<210>8

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

aacagctatgaccatgtttgcagcaattaagtgaggc37

<210>9

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

tgtaaaacgacggccagtcctgatcaactatggttgtgtg40

<210>10

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

aacagctatgaccatgcaatgtttaaaggtggtagctgt39

<210>11

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

tgtaaaacgacggccagtaagagcagagacagagaggttta41

<210>12

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

aacagctatgaccatgattcggctcatctgaatgtgtag39

<210>13

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

tgtaaaacgacggccagtgaaggcaatttactcttgaactg41

<210>14

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

aacagctatgaccatgtgagctctgatatttgctatcca39

<210>15

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

tgtaaaacgacggccagtgtgatgggatcattttatacgg40

<210>16

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

aacagctatgaccatgaatagaggaagaagtcccaacc38

<210>17

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

tgtaaaacgacggccagttgtttttctgtttctccctctg40

<210>18

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

aacagctatgaccatgctggatcagcaatttgacagtg38

<210>19

<211>40

<212>dna

<213>人共序列

<400>19

tgtaaaacgacggccagtccccctttcctactaggattaa40

<210>20

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

aacagctatgaccatgtgctaaggctccatatttctct38

<210>21

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>21

tgtaaaacgacggccagttcctaaaatactgaggacatggg41

<210>22

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>22

aacagctatgaccatgaaaaaaaaagcttttcatgataa39

<210>23

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>23

tgtaaaacgacggccagt18

<210>24

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>24

aacagctatgaccatg16