專利名稱：植物抗凍蛋白的基因序列、編碼蛋白及其應用的制作方法
植物抗凍蛋白的基因序列、編碼蛋白及其應用技術領域
本發明本發明涉及植物抗凍蛋白的基因序列、編碼蛋白及其應用，更具體涉及一種從小麥冷凍處理的AFLP-CDNA差異文庫中篩選出小麥抗凍蛋白TaAFPIII的核苷酸序列、 編碼蛋白及其應用。
背景技術：
抗凍蛋白(antifreeze protein, AFP)又稱為熱滯蛋白，最早是1969年Devnes在極區海魚淋巴中被發現，研究對象先后從極區魚類擴展到昆蟲，最后又擴展到植物甚至微生物。
低溫凍害是農業生產中一種嚴重的自然災害，也是某些農作物區域性和季節性限定因素。世界上氣溫每降低l°c，糧食就會減產40%。全世界每年因為凍害造成的經濟損失達到10億美元。我國在1999年發生在廣東、廣西、福建三省的低溫凍害造成經濟損失 150億元左右，受害面積在1500萬畝以上。受2009年冬天大雪和2010年倒春寒等氣候的影響，石家莊市有100萬畝小麥出現不同程度的死苗死蘗現象，其中10萬畝需要毀種，減產幅度在2 3成左右。因此如何改造農作物的遺傳特性，使之從凍害的危害中解脫出來一直是農業科學工作者的理想和追求。
許多研究表明，植物要抵抗冰凍的危害需要具備兩個基本要素一是避免細胞內結冰；二是細胞膜結構及核酸蛋白質等生命物質的低溫穩定性。細胞外結冰和細胞液的過冷卻是植物避免細胞內結冰傷害的主要和最普遍的適應機制。AFP對膜系統提供一種保護作用，即避免胞外冰晶透過細胞而使胞內液體結冰。據此推測植物體內存在能夠阻止冰核形成的物質，這種物質的含量會隨著季節和溫度的變化而消長。AFPs被發現以來，研究對象先后從極區魚擴展到昆蟲。直到1992年，加拿大Griffith等第一次明確提出獲得植物內生AFP，他們從經過低溫處理的冬黑小麥(Secale cereale L.)葉片的質外體中提取并部分純化了該蛋白，實驗證明該蛋白具有和魚AFP相似的功能特點。同年，Duman從白英 (Solanum dulcamara)中發現多種具有熱滯效應的蛋白質，兩年之后，Fei從常綠植物沙冬青(Amopiptanthus monglicus)中分離到了抗凍蛋白。2005年，Zhou等從日本大戟中證明植物中存在和魚AFP能發生免疫反應的蛋白。
目前影響小麥生產的小麥凍害類型有冬季凍害、早春凍害和低溫凍害。抗性育種一直是育種研究者們追求的目標，因為這和豐產育種、品質育種密切相關。植株生長發育階段只有適應外界的環境才能獲得豐產豐收，才能使產品具有好的品質。但是近年來，我國的各個小麥生產區都受到不同程度的低溫侵襲，經濟上受到了巨大損失，尤其是以春小麥為主的地區，這種現象則更為嚴重。目前在小麥中已經克隆出許多和低溫相關的基因，同時證明這些基因的表達確實能夠提高小麥的低溫抗性，但提高的程度很有限，這就是小麥低溫抗性育種停滯不前的主要原因。研究表明小麥對低溫適應性受多基因調控，其中有主效基因和微效基因兩類，如果能夠分離出主效基因，無論對基因功能還是調控機理以及生產方面都有非常重大的意義。另外根據現在許多研究表明多數基因在抗逆境方面具有多重性，即一個基因的表達提高能夠影響轉基因植物對低溫、干旱、鹽等多種非生物的脅迫。從基因數量和低溫有關的信號傳遞方面來看，研究進展還很緩慢。發明內容
本發明所要解決的第1個技術問題是提供一種植物抗凍蛋白的基因序列。
本發明所要解決的第2個技術問題是上述基因序列的編碼蛋白。
本發明所要解決的第3個技術問題上述編碼蛋的應用。
本發明所述的基因TaAFPIII是從小麥cDNA_AFLP差減文庫中篩選到的一個新基因。其cDNA序列和編碼蛋白的氨基酸序列如下。該基因cDNA全長782bp，開放閱讀框為 507bp，編碼一個含有168個氨基酸殘基的蛋白質。該基因是首次在植物中發現的和極區魚抗凍蛋白同源性達到93%。在GenBank中進行同源搜索，發現該基因尚無報道。
所述編碼蛋在抗凍小麥、抗凍煙草中的應用。
本發明與現有技術相比，轉TaAFPIII基因的煙草抗凍性顯著提高，在-20°c條件下冷凍Ih后，仍然能夠在室溫下恢復生長。與前人抗凍蛋白轉基因植物相比，效果極其顯著。這對以后轉基因抗凍植物的應用提供寶貴的基因資源。又因為小麥是主要糧食作物， 其體內的AFP對人的身體健康沒有副作用，因此體外大量合成后可以將之應用于食品行業作為添加劑，必定有廣闊的應用前景。


圖1為熒光定量PCR檢測不同天數冷凍誘導對AFP表達量的影響。
a表示葉子中的表達量；b表示根中的表達量
圖2為用不同激素處理對小麥AFPIII表達量的影響，
圖中1為水楊酸、2為PEG10000，3為ABA，4為茉莉酸甲酯，圖2表明0. 2mM茉莉酸甲酯和15% PEG10000在噴灑小麥Mi的時候，TaAFPIII表達量有所提高，但隨著時間的延長，AFP表達量又趨于正常。0. ImM水楊酸對TaAFPIII表達量沒有影響，而0.2mM脫落酸 (ABA)對TaAFPIII的表達反而有一定程度的抑制作用。
具體實施方式
下面結合實施例對本發明作詳細的說明。
實施例1 小麥抗凍基因的獲得
1、采取異硫氰酸胍-酚法提取小麥RNA
(1)取IOOmg小麥(中國春Chinese Spring)葉片放入研缽中，加入液氮充分研磨，加入1. 5mL異硫氰酸胍(4M異硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉(pH 7. 0),0. 5%十二烷基磺酸鈉，0. IM β -巰基乙醇)。轉移到2mL離心管中，置于冰上放置。
(2)加入100 μ L 2M NaAc, 200 μ L氯仿/異戊醇，ImL水飽和酚，混勻。
(3)劇烈振蕩10s，冰上放置15min。
(4) 4°C，12000rpm 離心 20min。
(5)將上清轉移至焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的離心管中，加入等體積異丙醇，混勻，-20°C沉淀Ih。
(6)4°C，12000rpm 離心 20min，棄上清。(7)70%乙醇重懸漂洗兩次，41，12000印111離心51^11。棄上清。(8)加入40 μ L DEPC處理的水溶液，溶解得到總RNA。2、SMART cDNA 文庫的構建^ M BD Clonetech & 目白勺 Switching Mechanism At 5’ end of the RNATranscript (SMART) cDNA文庫構建試劑盒，按照說明書步驟分別構建室溫培養和4°C處理小麥兩種cDNA文庫，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，比較冷處理和正常處理的小麥樣本的電泳結果，挑取差異片段委托上海生工完成測序工作，得到其中一條差異序列如下TAAGTCCGTGGTGGCCAACCAGCTGATCCCCATAAATACTGCCCTGACTCTAGTGATGATGMGGCGGA GGAAGTCAGCCCAAAGGGCATCCCTGCCGAGGAGATCCCCAAACTAGTGGGAATGCAAGTGAACAGGGCAGTGTATC TGGACCAAACCCTAATGCCAGATATGGTGAAAAACTATGAGATGA。3. RACE技術擴增AFPIII全長采用clonetech smarter RACE試劑盒，根據以上得到的基因片段序列，設計兩條特異引物Pl :GATGAAGGCGGAGGAAGT和P2 :CTGGCATTAGGGTTTGGT，按照試劑盒說明書，進行 PCR擴增，得到的目的條帶委托上海生工測序后獲得5 ‘端基因序列和3’端基因序列，經過序列拼接后得到該基因全長。該cDNA全長782bp，含有504bp的開放閱讀框。編碼一個含有168個氨基酸殘基的蛋白質，推測其分子量為18. 19kD，pI值為8. 8。在GeneBank中進行同源搜索，發現它與極區魚類抗凍蛋白AFPIII達到93%，為一種新型的植物抗凍蛋白基因。我們命名為TaAFPIII。實施例2 小麥抗凍基因的表達模式分析1.小麥葉片和根的冷處理取中國春種子放在鋪有濾紙的9#培養皿中，加水使濾紙濕潤，于25°C暗培養Mh， 待其萌發后，16h光培養，8h暗培養的條件下培養一周，150 μ EnT2 s_2福照度待小麥長至 7-8cm長度時，加入霍格蘭Hogland營養液進行培養，取一半小麥作為處理組移入4°C冷庫， 剩下作為對照組。每天分別在25°C條件下和4°C條件下取三株小麥材料，連續取樣一周，共取7次樣，分別提取小麥葉片和根部的RNA。2.小麥葉片和根的植物激素處理取中國春種子放在鋪有濾紙的9#培養皿中，加少量水使濾紙濕潤，于25°C暗培養 Mh，待其萌發后，光培養一周，待小麥長至7-8cm長度時，分別用0. ImM的水楊酸、0. 2mM茉莉酸甲酯、0. 2mM ABA和15%PEG10000溶液10mL，對小麥葉片進行噴灑，分別于0h、6h、12h、 18h、24h取樣，置于_20°C，提取各樣品的RNA。3.對以上兩種模式的real-time RT-PCR反應使用異硫氰酸胍法(實施例1)分別提取小麥總RNA，分別設計AFPIII引物P3 =TTT GCT GTT CGT CCT CCT TT、P4 :TCC GAT TAT TCG GGG AAT GT禾口 β-Actin 引物P5 :GTC GGT GAA GGG GAC TTA CA、P6 :TTC ATA CAG CAG GCA AGCAC，熒光定量PCR反應條件為94°C (30 秒)-58 V (30秒)-72 V (1分鐘)，30個循環。結果如圖1、2所示小麥的葉片在4°C冷處理的在第二天的時候葉子中的 TaAFPIII基因表達量突然長至平時基因的266倍，之后又恢復正常水平，而根中的 TaAFPIII基因在第三天時表達量有所上升，長至平時的3倍多。證明該基因受溫度顯著調控。0. 2mM茉莉酸甲酯和15% PEG10000在噴灑小麥6h的時候，TaAFPIII表達量有所提高，但隨著時間的延長，TaAFPIII表達量又趨于正常。水楊酸對TaAFPIII表達量沒有影響，而ABA對TaAFPIII的表達反而有一定程度的抑制作用。實施例3 =AFPIII基因在煙草中的表達1.植物表達載體pBI121-AFP的構建根據TaAFPIII 基因全長序列設計一對引物 P7 :ACT TCTAGA ATG AAG TCA GTTGTT TTA ACT (劃線部分為 Xba I 酶切位點)，P8 :ACT GGATCC CTC ATA GTT TTT CACCAT ATC (戈Ij 線部分為BamHI酶切位點)從反轉錄的cDNA模板上擴增出帶有酶切位點的TaAFPIII基因全長序列。退火溫度設置為65°C。用BamHI和)(baI雙酶切回收后的RT-PCR產物和pBI121 質粒，使用天根的膠回收試劑盒對基因片段進行回收，用Takara的連接酶連接后形成重組載體，用凍融法轉入農桿菌LB4404菌株中。(凍融法轉入農桿菌參考文獻余云舟等，2003. 重組質粒導入根癌農桿菌凍融法的研究，吉林農業大學學報(3) :257-259)2.使用農桿菌侵染煙草方法如下(參考文獻Horsch，R.B.，J. E. Fry, et al. (1985). “ A Simpleand General Method for Transferring Genes into Plants. " Science 227(4691) 1229-1231.)一周后，待其分化出小芽，當小芽長至2 3cm時，切下芽，將其插在常用的生根培養基(如 J/^MS+O. 3mg/L NM+100mg/L Kan+250mg/L Cef)上，置于培養瓶中，28°C光培養。一個月后，待其根系較粗時移盆，溫室培養。選擇長勢較好的移盆的煙草進行低溫冷凍處理，選擇兩株對照(沒有進行農桿菌轉化，僅僅同時培養的煙草)，兩株PCR檢測陽性植株。放入冰柜中冷凍處理，池后，打開冰柜，煙草表型上沒有區別，用手觸摸葉片發現，轉基因煙草葉片表面冰冷但質地柔軟，與正常葉片相似。而對照煙草葉片冰冷且質地僵硬，明顯感覺有冰晶的形成。取出后放于室溫下，對照葉片開始凋落，而轉基因植株沒有任何變化。但對照組尚有一株沒有完全萎焉，因此選擇在放入冰柜Ih冷凍處理。冷凍處理4h后，對照的兩株煙草已經全部凋落，而轉基因植株沒有明顯變化。將煙草放入光照培養室，進行恢復培養，一天后，對照組煙草已經枯萎，而轉基因植株仍然正常生長。上述結果顯示轉入了 TaAFPIII基因的煙草具有在_20°C至少4h的的低溫環境中仍能存活。
權利要求
1.植物抗凍蛋白的基因序列，其特征在于其由序列表SEQID NO :1的核苷酸序列定義。
2.植物抗凍蛋白的基因序列的編碼蛋白，其特征在于其由序列表SEQIDNO :2的氨基酸序列定義。
3.權利要求2所述的植物抗凍蛋白的基因序列的編碼蛋白在植物抗凍方面的應用。
全文摘要
本發明公開了植物抗凍蛋白的基因序列、編碼蛋白及其應用，所述的基因序列，其由序列表SEQ ID NO1的核苷酸序列定義。本發明與現有技術相比，轉TaAFPIII基因的煙草抗凍性顯著提高，在-20℃條件下冷凍1h后，仍然能夠在室溫下恢復生長。與前人抗凍蛋白轉基因植物相比，效果極其顯著。這對以后轉基因抗凍植物的應用提供寶貴的基因資源。又因為小麥是主要糧食作物，其體內的AFP對人的身體健康沒有副作用，因此體外大量合成后可以將之應用于食品行業作為添加劑，必定有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N15/84GK102505015SQ20111036479
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月17日 優先權日2011年11月17日
發明者于紅梅, 何光源, 程立寶, 高軒 申請人:安徽師范大學