本發明涉及亞硫酸氫根熒光檢測技術，具體涉及一種檢測亞硫酸氫根的試劑及其合成方法和應用。

背景技術：

最新研究表明，生物體內亞硫酸鹽可以通過活性氧物質(ros)氧化硫化氫或含硫氨基酸而內源性產生，這可能導致體內氧化與抗氧化作用失衡，進而引發氧化應激性疾病。h2o2作為一種活性氧物質(ros)，是細胞代謝的必然副產物。氧化應激的信號分子如：二氧化硫(so2)也被認為是一種環境污染物，研究表明，二氧化硫通常與神經系統疾病，心血管疾病甚至肺癌的病發相關。so2的毒性主要歸因于其二種還原劑衍生物，亞硫酸鹽(so3^2-)和亞硫酸氫鹽(hso3^-)，因此，開發有效的方法監測亞硫酸氫根具有重大的研究有意義，對于生物研究和臨床診斷起著至關重要的作用。

目前，大部分熒光探針使用熒光增強型實現三亞硫酸氫根的檢測，檢測限較高。因此研究開發一種信號響應明顯且檢測限低的、可以在細胞濃度水平上檢測亞硫酸的試劑顯得尤為重要。

在本發明中，合成了一種基于半花菁的化合物，通過亞硫酸氫根和化合物在親核取代反應前后熒光強度的比率變化，實現亞硫酸氫根的特異性檢測。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種合成簡單、操作方便、選擇性高、信號響應強、檢測限低的定量檢測亞硫酸氫根的試劑及其制備方法，以及該試劑在亞硫酸氫根和雙氧水檢測中的應用。

本發明提供的一種檢測亞硫酸氫根的試劑，它是(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物，英文名稱是：(e)-2-(2-(3h-benzo[f]chromen-2-yl)vinyl)-3-methylbenzo[d]thiazol-3-iumiodide，結構式為：

(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的合成方法，步驟為：

將摩爾比為1:2.5:2.5的2-羥基-1-萘甲醛和丙烯醛及碳酸鉀溶解在的1,4-二氧六環溶液中；混合物在105℃加熱反應72-75小時；反應完成后，將其冷卻至室溫倒入冰水中攪拌30分鐘；混合物用乙酸乙酯萃取三次,有機相減壓旋干；經硅膠柱色譜分離(乙酸乙酯:石油醚，9:1,v/v)純化得3h-苯并[f]色烯-2-甲醛；

將摩爾比為1:1.4的3h-苯并[f]色烯-2-甲醛和2,3-二甲基苯并噻唑-3-碘化物溶于乙醇中，加入催化劑哌啶；混合物在78℃攪拌回流12-14小時，然后冷卻至室溫，過濾、洗滌、真空干燥得到墨綠色固體，即(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物。

一種檢測亞硫酸氫根的方法，步驟為：

(1)、配制ph＝7.4、濃度為10mm的pbs緩沖溶液，并用dmso配制2mm(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的dmso溶液；

(2)、按體積比9:1將pbs緩沖溶液和dmso溶液加到2ml熒光比色皿中，在熒光分光光度儀上檢測，隨著待測樣的加入,630nm處的熒光強度的逐漸降低，伴隨著520nm熒光強度顯著增強；

(3)、用蒸餾水配制2mm的亞硫酸氫根溶液，按體積比9:1將pbs緩沖溶液和dmso溶液加到2ml熒光比色皿中，逐漸加入亞硫酸氫根溶液的體積為0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30μl，同時在熒光光譜儀上測定520nm處與630nm處相對熒光強度的比值(i520/i630)為、0.404、0.609、1.231、2.667、4.471、6.970、9.583、11.500、13.529、14.375、14.385，以亞硫酸氫根濃度為橫坐標，以相對熒光強度比值(i520/i630)為縱坐標繪制圖，得到亞硫酸氫根濃度的工作曲線；線性回歸方程為：f520/f630＝0.71c-3.52，c的單位為10^-6mol/l；

(4)、測定樣品溶液時，將測得的熒光強度代入線性回歸方程，即可求得亞硫酸氫根的濃度。

一種檢測過氧化氫的方法，步驟為：

(1)、配制ph＝7.4、濃度為10mm的pbs緩沖溶液，并用dmso配制2mm(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的dmso溶液；

(2)、把10μldmso溶液加入到2mlpbs–dmso(10mm,ph＝7.4,9:1,v/v)的熒光比色皿中，在熒光分光光度儀上檢測，隨著待測樣亞硫酸氫根的加入,630nm處的熒光強度的逐漸降低，伴隨著在520nm熒光強度顯著增強；

(3)、用蒸餾水配制2mm的過氧化氫溶液，取100μm過氧化氫溶液，逐漸用微量進樣器加到加入上述比色皿中，邊加過氧化氫邊在熒光分光光度儀上檢測，隨著過氧化氫的加入，520nm處熒光強度降低，630nm處熒光強度逐漸增強,體系熒光逐漸恢復到探針本身的熒光強度。

本發明的(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物還可用于細胞成像。

與現有技術相比，本發明具有如下優點和效果：1、檢測體系成本低廉，且兩步合成；2、本發明的檢測方法，對亞硫酸氫根檢測顯示了高的靈敏性和選擇性；3、檢測手段簡單，只需要借助熒光光譜儀即可實現。4、檢測信號明顯，為比率型熒光。

附圖說明

圖1實施例1制備的(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的核磁氫譜圖

圖2實施例1制備的(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的核磁碳譜圖

圖3實施例1制備的(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的質譜圖

圖4實施例2(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物與hso3^-作用的熒光發射圖

圖5實施例3(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物與hso3^-作用后過氧化氫可逆性恢復探針熒光發射圖

圖6實施例4(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物與各種分析物的熒光柱狀圖

圖7實施例5測定亞硫酸氫根的工作曲線

圖8實施例6測定樣品的熒光發射圖

圖9實施例7檢測亞硫酸氫根的細胞成像圖

具體實施方式

實施例1(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的制備及表征

將丙烯醛(0.5ml,7.5mmol)和2-羥基-1-萘甲醛(0.516g,3.0mmol)溶解在含有碳酸鉀(1.035g,7.5mmol)的1,4-二氧六環溶液中。混合物在105℃加熱反應72小時。反應完成后，將其冷卻至室溫倒入冰水中攪拌30分鐘。混合物用乙酸乙酯萃取三次,有機相減壓旋干,然后通過柱層析分離(乙酸乙酯:石油醚，9:1,v/v)得到3h-苯并[f]色烯-2-甲醛。

將3h-苯并[f]色烯-2-甲醛(0.105g,0.5mmol)和2,3-二甲基苯并噻唑-3-碘化物(0.204g,0.7mmol)溶于乙醇中，加入催化劑哌啶(30μl)催化劑。混合物在78℃攪拌回流12小時，然后冷卻至室溫，過濾、洗滌、真空干燥得到墨綠色固體。即為e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物。

¹hnmr(600mhz,dmso)δ8.44(d,j＝8.0hz,1h),8.33(s,1h),8.23(d,j＝8.4hz,1h),8.20(d,j＝8.5hz,1h),8.07(d,j＝15.6hz,1h),7.99(d,j＝8.9hz,1h),7.94(d,j＝8.1hz,1h),7.88(t,j＝7.8hz,1h),7.80(t,j＝7.7hz,1h),7.67(t,j＝7.6hz,1h),7.49(t,j＝7.4hz,1h),7.39(d,j＝15.7hz,1h),7.25(d,j＝8.8hz,1h),5.38(s,2h),4.32(s,3h),2.09(s,1h).(圖1).¹³cnmr(151mhz,dmso)δ170.77,153.89,144.86,141.56,132.80,132.10,129.46,128.80,128.51,128.32,127.70,127.47,127.39,127.17,124.15,123.66,120.91,116.81,116.15,114.73,111.87,63.65,35.61(圖2).esi-ms:m/zcalcd356.1104,found356.1116(圖3).

實施例2

配制ph＝7.4、濃度為10mm的pbs緩沖溶液，并用dmso配制2mm(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的溶液；把10μl(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的dmso溶液加入到2mlpbs–dmso(10mm,ph＝7.4,9:1,v/v)的熒光比色皿中，取亞硫酸氫根溶液，逐漸用微量進樣器加到此比色皿中，邊加樣邊在熒光分光光度儀上檢測，隨著亞硫酸氫根的加入，630nm處熒光強度降低，并伴隨著520nm處熒光強度逐漸增強。熒光發射圖見圖4。

實施例3

配制ph＝7.4、濃度為10mm的pbs緩沖溶液，并用dmso配制2mm(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的溶液；把10μl(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的dmso溶液加入到2mlpbs–dmso(10mm,ph＝7.4,9:1,v/v)的熒光比色皿中，取30μm亞硫酸氫根溶液，加入上述緩沖溶液當中，待體系熒光強度不在發生變化時，取100μm過氧化氫溶液，逐漸用微量進樣器加到此比色皿中，邊加樣邊在熒光分光光度儀上檢測，隨著過氧化氫的加入，520nm處熒光強度降低，630nm處熒光強度逐漸增強,體系熒光逐漸恢復到探針本身的熒光強度。熒光發射圖見圖5。

實施例4

配制ph＝7.4、濃度為10mm的pbs緩沖溶液，并用dmso配制2mm的(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物溶液；在21個熒光比色皿中，各加入2ml的pbs-dmso(9:1，ph7.4)溶液和10μl(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的dmso溶液，再分別加入3摩爾當量亞硫酸氫根，以及30摩爾當量的各種分析物：cys，hcy，gsh，h2s，cn^-，so4^2-，co3^2-，f^-，cl^-，br^-，i^-，hpo4^2-，h2po4^-，no3^-，scn^-，hco3^-，s2o3^2-，n3^-，aco^-，so3^2-，hso3^-在熒光分光光度儀上檢測，繪制不同分析物對應的520nm處和630nm處相對熒光強度比值的柱狀圖，(見圖6)。亞硫酸氫根和亞硫酸根使得(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物在520nm處和630nm的熒光強度明顯變化，其它的分析物基本沒有引起(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物熒光變化。

實施例4

配制ph＝7.4、濃度為10mm的pbs緩沖溶液，并用dmso配制2mm(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的溶液；把10μl(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的dmso溶液加入到2mlpbs–dmso(10mm,ph＝7.4,9:1,v/v)的熒光比色皿中，逐漸加入亞硫酸氫根溶液的體積為0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30μl，同時在熒光光譜儀上測定520nm處與630nm處相對熒光強度的比值(i520/i630)為、0.41、0.61、1.23、2.67、4.47、6.96、9.58、11.50、13.53、14.38、14.39，以亞硫酸氫根濃度為橫坐標，以相對熒光強度比值(i520/i630)為縱坐標繪制圖(見圖7)，得到亞硫酸氫根濃度的工作曲線；線性回歸方程為：f520/f630＝0.71c-3.52，c的單位為10^-6mol/l。

實施例6

配制ph＝7.4、濃度為10mm的pbs緩沖溶液，并用dmso配制2mm(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的溶液；把10μl(e)-2-(2-(3h-苯并[f]色烯-2-基)乙烯基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-碘化物的dmso溶液加入到2mlpbs–dmso(10mm,ph＝7.4,9:1,v/v)的熒光比色皿中，取nahso3的溶液8μl，用微量進樣器加到此比色皿中，同時在熒光光譜儀上測定520nm和630nm處熒光強度為200.6和94，520nm處與630nm處相對熒光強度的比值(i520/i630)為2.134,通過實施例4的線性回歸方程，求得c＝7.96×10^-6mol/l10^-6mol/l。偏差為0.5％。見圖8。

實施例7

用dmso配制2mm的探針dmso溶液；將探針dmso溶液加入mcf-7細胞培養液中，使得其濃度為10μm，與mcf-7細胞在37℃下孵育30分鐘。此時體系在共聚焦顯微鏡紅色通道中顯示處紅色熒光，而綠色通道只有很微弱的綠色熒光。將50μmhso3^-與上述預處理過的mcf-7細胞再孵育30分鐘后，此時體系在共聚焦顯微鏡綠色通道顯示強烈的綠色熒光，而紅色通道的熒光基本消失。對照組中，將上述50μmhso3^-與10μm探針預處理過的mcf-7孵育后的體系中再次加入50μm的過氧化氫，30分鐘之后在共聚焦顯微鏡綠色通道熒光明顯減弱，同時紅色通道熒光增強。這些結果表明，探針能夠檢測活細胞中外源性的hso3^-，同時可以實現細胞內過氧化氫與亞硫酸氫根可逆性氧化還原過程監測。圖9為共聚焦顯微鏡下mcf-7細胞與探針作用后的成像圖(a1，b1，c1,d1)。探針預處理后的mcf-7細胞再與外源的亞硫酸氫根作用后的細胞成像圖(a2，b2，c2,d2)，探針預處理后的mcf-7細胞與亞硫酸氫根作用后再次孵育過氧化氫的成像圖(a3，b3，c3,d3)。