本發明涉及一種與生殖支原體mgpa相互作用的受體蛋白——組蛋白h2b(histoneh2b)，還提供了該蛋白的分離方法和用途，屬于生物工程和疾病診斷與防治技術領域。

背景技術：

生殖支原體(mycoplasmagenitalium，mg)是首次從一名非淋菌性尿道炎患者尿道分泌物中分離出的一種泌尿生殖道感染支原體。臨床研究表明，女性感染mg可引起宮頸炎、盆腔炎和不孕等；而男性感染則可引起急慢性非淋菌性尿道炎和不育；另外，mg感染還與人類免疫缺陷病毒(hiv)的機會感染密切相關。

病原體和宿主細胞膜上相應受體的結合是病原體感染宿主的第一步，對其能否感染宿主細胞至關重要。研究表明，mg必須先黏附于泌尿生殖道或呼吸道黏膜上皮細胞才能感染宿主并定植于感染部位或侵入細胞內。

支原體沒有細胞壁，但在mg的膜上存在較多的膜蛋白。mg通過細胞膜上的膜蛋白介導其定植到宿主細胞表面而感染致病。生殖支原體黏附蛋白(mycoplasmagenitaliumproteinofadhesion,mgpa)是mg含量最多的一種膜蛋白，且是一種最主要的黏附蛋白，在介導mg黏附甚至侵入宿主上皮細胞的過程中發揮著至關重要的作用。自發性的無細胞黏附活性的mg突變株則缺乏mgpa。iverson-cabralsl等的研究也表明在mg的持續性感染過程中，機體產生的抗體主要針對于mgpa保守的c端可變區，說明mgpa的c端與其免疫原性密切相關。dehonpm等研究表明針對mgpac端的抗體能部分抑制mg對hep-2細胞的黏附，說明mgpa是一種重要的黏附蛋白，且主要通過其c端黏附于宿主上皮細胞。既然mgpa與mg的粘附、感染致病有關，因此在宿主細胞上可能存在與mgpa相互作用的受體蛋白。然而，迄今為止，關于mg通過mgpa與宿主細胞膜上什么受體分子相互作用，從而導致其黏附或入侵到宿主上皮細胞，尚未見相關報道。

宿主細胞表面的受體是決定生殖支原體對宿主細胞是否易感的關鍵因素，且是決定生殖支原體的入侵途徑、傳播方式、和宿主的病理特征的主要因素之一。因此，對生殖支原體受體的研究有助于從分子水平上闡明生殖支原體的致病機理及其與宿主細胞相互作用的關系，利用人工表達的受體蛋白阻擋生殖支原體與其受體的結合，是防治生殖支原體感染的重要途徑。

技術實現要素：

本發明利用超聲破碎法提取人尿道上皮細胞(sv-huc-1cell)的膜蛋白，應用改進的病毒鋪覆蛋白印跡技術(vopba)，即利用原核表達并經純化的重組蛋白rmgpa直接與轉印至pvdf膜上的細胞膜蛋白組分進行孵育，篩選得到了位于人尿道上皮細胞膜表面的受體蛋白——組蛋白h2b。所述蛋白分離自人尿道上皮細胞的細胞膜蛋白，其核苷酸序列如seqidno.1所示，由126個氨基酸組成。

本發明還提供了上述受體蛋白組蛋白h2b的分離制備方法，包括以下步驟：

(1)、對生殖支原體的膜蛋白mgpa進行表達、純化，制得重組蛋白rmgpa；

(2)、采用超聲破碎法提取人尿道上皮細胞的膜蛋白；

(3)、采用改進的病毒鋪覆蛋白印跡技術篩選步驟(2)中制得的膜蛋白中與重組蛋白rmgpa特異結合的膜蛋白，篩選得到一條約14kda的蛋白；

(4)、將步驟(3)中得到的約14kda蛋白進行質譜分析鑒定，即得上述的受體蛋白組蛋白h2b。

步驟(2)中，取培養形態良好的人尿道上皮細胞，胰蛋白酶消化5min，加入培養基終止消化，離心6min后收集細胞沉淀；然后加入pbs輕輕吹打細胞沉淀，洗三次；再加入細胞裂解液冰浴20min，加入蛋白酶抑制劑pmsf，超聲破碎，10w，5s/次，間歇15s，共計30次，然后2500rpm/min離心10min，取上清離心30min，沉淀用pbs重懸，-80℃保存，即獲得人尿道上皮細胞的膜蛋白提取物。

步驟(3)的具體步驟為：

a、sds-page

將步驟(2)中提取的人尿道上皮細胞膜蛋白，測定濃度后加入上樣緩沖液(5×)，混勻后煮沸5min，1000g離心1min，取10μl上樣進行sds-page分離，分離膠為12％，濃縮膠為5％，電泳條件為：濃縮膠80v，分離膠120v；同時設置對照組；

b、轉膜與封閉

(i)pvdf膜的處理及凝膠的平衡：裁剪一張比凝膠片段略大的pvdf膜，將其用甲醇浸泡10-15s后再用去離子水漂洗10s，隨后經轉膜緩沖液平衡10min，電泳結束后，將分離膠中的目的片段放置于轉膜緩沖液中平衡10min；

(ii)在半干轉膜儀中，將已經平衡好的濾紙、pvdf膜、凝膠、濾紙從下到上依次疊加，用玻璃棒將氣泡排除，在恒壓條件進行轉膜：條件為15v，30min；

(iii)pvdf膜浸入封閉液中，4℃過夜后用tbst漂洗5次，每次5min；

c、免疫印跡

(i)rmgpa蛋白孵育：加入rmgpa蛋白，在4℃孵育過夜，tbst漂洗5次，每次5min；

(ii)孵育一抗：加入稀釋1:1000的兔抗rmgpa的多克隆抗體，37℃孵育2h，tbst漂洗5次，每次5min；

(iii)孵育二抗：加入稀釋1:5000的hrp標記的羊抗兔igg，37℃孵育1h，tbst漂洗5次，每次5min；

(iv)顯影。

受體是生殖支原體感染宿主細胞時遇到的第一個分子，揭示受體的種類和結構，有助于進一步闡明生殖支原體的致病機制。本發明利用改進的vopba方法篩選mgpa在人尿道上皮細胞膜上的受體，為進一步闡明mg可能的黏附與致病機制，為進一步設計受體模擬分子和拮抗分子阻擋mg黏附或侵入宿主細胞，為mg感染防治提供前期實驗基礎。因此所述受體蛋白組蛋白h2b能夠用于制備治療或預防生殖支原體感染性疾病的靶向藥物中。

附圖說明

圖1為sds-page對人尿道上皮細胞膜蛋白分析圖；

圖2為改進的vopba技術篩選到的rmgpa結合蛋白圖；

圖3為間接elisa鑒定rmgpa與h2b的特異性結合圖；

圖4為westernblotting鑒定rmgpa與細胞膜蛋白中h2b的結合圖；

圖5為h2b蛋白在人尿道上皮細胞上的定位圖；

圖6為rmgpa被h2b處理后的間接免疫熒光黏附抑制實驗圖；

圖7為mg被h2b處理后的間接免疫熒光黏附抑制實驗圖。

具體實施方式

目前，質譜分析技術已在蛋白質與蛋白質組學研究中發揮重要作用。它可以利用蛋白質分子荷質比(m/z)的不同而將不同的蛋白質分離開來，從而分析鑒定未知蛋白質。本發明專利中對約14kda蛋白進行質譜分析，結果表明14kda受體蛋白與組蛋白h2b有較強的相關性。

獲得受體蛋白和受體蛋白抗體有助于研究受體蛋白的特性和功能，本發明中進一步利用h2b蛋白及h2b抗體，經elisa、far-westernblotting方法研究rmgpa和受體蛋白的相互作用。結果表明rmgpa能與h2b相互作用而特異結合；約14kda的目標條帶里的特定蛋白也能與rmgpa結合，說明約14kda蛋白中含有組蛋白h2b。本發明利用間接免疫熒光試驗檢測組蛋白h2b在人尿道上皮細胞細胞的定位。結果顯示，一部分熒光信號在膜上，一部分在細胞質內，說明組蛋白h2b在人尿道上皮細胞膜上有分布，由于病原體的受體主要集中在宿主細胞膜表面，因此免疫熒光試驗的結果從側面反映了組蛋白h2b蛋白可能是能與rmgpa相互作用的受體。

本發明中還進一步驗證組蛋白h2b是rmgpa的受體，即組蛋白h2b能介導rmgpa和mg黏附于人尿道上皮細胞，并用黏附抑制試驗證明組蛋白h2b能抑制rmgpa和mg對人尿道上皮細胞的黏附，說明組蛋白h2b能用于治療mg引起的感染性疾病。

以上內容所述的具體實施例如下：

1、制備重組蛋白rmgpa

根據發明人前期摸索的條件，對重組蛋白rmgpa進行表達、純化，超濾濃縮、鑒定及去內毒素處理。經bca試劑盒測定蛋白濃度約為2000μg/ml。

2、超聲破碎法提取人尿道上皮細胞膜蛋白

(1)取培養形態良好的人尿道上皮細胞約10⁷/ml，胰蛋白酶消化5min，加入培養基終止消化，1000g，離心6min后收集細胞沉淀；

(2)加入pbs輕輕吹打細胞沉淀，洗三次；

(3)加入細胞裂解液冰浴20min，加入蛋白酶抑制劑pmsf，超聲破碎(10w，5s/次，間歇15s，共計30次)然后2500rpm/min離心10min，取上清16000g離心30min，沉淀用300μl的pbs重懸，-80℃保存；

使用超聲破碎法提取人尿道上皮細胞膜蛋白后進行sds-page分析，結果如圖1所示，在12～55kda范圍內，皆有明顯的條帶出現，超速離心后重懸的膜蛋白，經bca法測定其濃度為600μg/ml，說明成功提取到人尿道上皮細胞的膜蛋白。

3、改進的vopba法篩選與rmgpa相互作用的細胞膜蛋白

3.1sds-page

將提取的人尿道上皮細胞膜蛋白，測定濃度后取20μl加入5μl上樣緩沖液(5×)，混勻后煮沸5min，1000g離心1min，取10μl上樣進行sds-page分離。分離膠為12％，濃縮膠為5％，電泳條件為：濃縮膠80v，分離膠120v；同時設置對照組。

3.2轉膜與封閉

(1)pvdf膜的處理與凝膠的平衡：裁剪一張比凝膠片段略大的pvdf膜，放于甲醇中浸泡10-15s后再用去離子水漂洗，將pvdf膜用轉膜緩沖液平衡10min。電泳結束后，將目的片段放置于轉膜緩沖液中平衡10min。

(2)在半干轉膜儀中，將已經平衡好的濾紙、pvdf膜、凝膠、濾紙從下到上依次疊加，用玻璃棒排除氣泡后在恒壓條件進行轉膜：條件為15v，30min。

(3)pvdf膜浸入封閉液中，4℃過夜后用tbst漂洗5次，每次5min。

3.3免疫印跡

(1)rmgpa蛋白孵育：加入rmgpa蛋白，在4℃孵育過夜，tbst漂洗5次，每次5min；

(2)孵育一抗：加入稀釋1:1000的rmgpa的多克隆抗體，37℃孵育2h，tbst漂洗5次，每次5min；

(3)孵育二抗：加入稀釋1:5000的hrp標記的羊抗兔igg，37℃孵育1h，tbst漂洗5次，每次5min；

(4)顯影。

結果如下：

提取的膜蛋白經sds-page分析并轉膜后，將其與rmgpa孵育，兔抗rmgpa抗體為一抗，hrp標記的羊抗兔igg為二抗。結果表明，經與rmgpa孵育的泳道在分子量約為14kda處有一明顯的條帶出現，而未與rmgpa孵育的泳道沒有明顯條帶出現，如圖2所示，說明約14kda蛋白可能為與rmgpa相互作用的靶蛋白。

4、質譜分析鑒定目標條帶

(1)取測定濃度后的人尿道上皮細胞膜蛋白10μl加入2.5μl(5×蛋白電泳上樣緩沖液)，混勻后煮沸5min，1000g離心1min，取10μl上樣進行sds-page分離。分離膠為12％，濃縮膠為5％，電泳條件為：濃縮膠80v，分離膠120v。

(2)帶上口罩和薄膜手套進行拆膠；

(3)考馬斯亮藍染色液染色3h，脫色液脫色2h，至目標條帶清晰可見；

(4)將切膠用的刀片洗干凈，切下來的條帶用去離子水洗刷好；

(5)將目標條帶放入進口ep管內，用封口膜將ep管封好，常溫運輸；

(6)由輝駿生物科技進行lc-ms鑒定。

質譜鑒定結果

通過lc-ms的鑒定，檢索ncbi數據庫，同時把所測得的蛋白做二級質譜分析，經過蛋白質比對匹配分析，組蛋白h2b蛋白得分很高，可能是能與rmgpa相互作用的受體蛋白。

5、間接elisa鑒定rmgpa與h2b的結合情況

(1)tbs稀釋rmgpa至100μg/ml，取150μl包被elisa板，4℃濕盒過夜；同時設置對照組；

(2)甩掉包被液，用tbst清洗3次，加滿封阻液，4℃封阻2h；

(3)洗板3～5次，用封阻液稀釋h2b蛋白(1:1000)，100μl/孔，37℃，2h；

(4)洗板3～5次，用封阻液稀釋h2b蛋白抗體(1:1000)，100μl/孔，37℃，2h；

(5)洗板6次，加入hrp標記的羊抗兔igg(1:5000)，100μl/孔，37℃，1h；

(6)37℃，1h后，tbst洗6～8次；

(7)加入a，b顯色劑，37℃避光孵育1h；

(8)加入終止液，用酶標儀450nm處測吸光值a。

結果如下：

利用間接elisa檢測rmgpa與組蛋白h2b的特異結合，結果表明：與空白對照組相比，rmgpa與組蛋白h2b孵育組的吸光值大于1.0，如圖3所示，陽性對照兔抗rmgpa抗體孵育組的吸光值也大于1.0，而空白對照組的吸光度值小于0.5，具有統計學意義(p<0.05)，這些結果說明rmgpa能與h2b相互作用而發生特異結合。

6、westernblotting鑒定rmgpa與組蛋白h2b的特異結合

6.1鑒定rmgpa與組蛋白h2b的直接結合

(1)sds-page

取20μl的rmgpa加入5μl(5×蛋白電泳上樣緩沖液)，混勻后煮沸5min，1000g離心1min，每孔加10μl上樣進行sds-page分離。

(2)轉膜與封閉

在恒流條件進行轉膜：條件為0.03a，30min，其余操作步驟見3.2。

(3)免疫印跡

①組蛋白h2b蛋白孵育：加入h2b蛋白(1:1000)，在4℃孵育6h或過夜，tbst漂洗5次，每次5min。

②孵育一抗：加入稀釋1:1000的組蛋白h2b抗體，37℃孵育2h，tbst漂洗5次，每次5min。

③孵育二抗：加入稀釋的hrp標記的羊抗兔igg(1:5000)，37℃孵育1h，tbst漂洗5次，每次5min。

④顯影

6.2鑒定rmgpa與細胞膜蛋白的結合

(1)sds-page

取20μl的rmgpa加入5μl(5×蛋白電泳上樣緩沖液)，混勻后煮沸5min，1000g離心1min，每孔加10μl上樣進行sds-page分離。

(2)轉膜與封閉

在恒流條件進行轉膜：條件為0.03a，30min，其余操作步驟見3.2。

(3)免疫印跡

①人尿道上皮細胞膜蛋白孵育：加入膜蛋白，在4℃孵育4h或過夜，tbst漂洗5次，每次5min。

②孵育一抗：加入稀釋1:1000的組蛋白h2b抗體，37℃孵育2h，tbst漂洗5次，每次5min。

③孵育二抗：加入稀釋的hrp標記的羊抗兔igg(1:5000)，37℃孵育1h，tbst漂洗5次，每次5min。

④顯影。

6.3約14kda目標蛋白與組蛋白h2b抗體的結合

(1)sds-page

取20μl的細胞膜蛋白加入5μl(5×蛋白電泳上樣緩沖液)，混勻后煮沸5min，1000g離心1min，每孔加10μl上樣進行sds-page分離。

(2)轉膜與封閉

在恒壓條件進行轉膜：條件為15v，30min，其余操作步驟見3.2。

(4)免疫印跡

①孵育一抗：加入稀釋1:1000的組蛋白h2b抗體，37℃孵育2h，tbst漂洗5次，每次5min。

②孵育二抗：加入稀釋的hrp標記的羊抗兔igg(1:5000)，37℃孵育1h，tbst漂洗5次，每次5min。

③顯影。

鑒定分析結果

rmgpa能與細胞膜蛋白中的組蛋白h2b相互作用而發生特異結合

將rmgpa進行sds-page并轉膜后，用westernblotting檢測其能否與細胞膜蛋白中的h2b結合，結果如圖4所示，當用膜蛋白與rmgpa孵育后，加入組蛋白h2b抗體，再加入二抗顯色，在約37kda處有特異性條帶出現；而對照組沒有條帶出現，說明rmgpa能與細胞膜蛋白中的組蛋白h2b特異結合。

用間接免疫熒光試驗檢測h2b蛋白在人尿道上皮細胞中的定位，結果如圖5所示，由圖5中可以看出，人尿道上皮細胞的細胞膜、細胞質和細胞核區域都有紅色熒光，細胞核為藍色；說明在細胞內和細胞膜上都存在h2b蛋白。

7、組蛋白h2b對rmgpa和mg黏附人尿道上皮細胞的抑制作用

(1)取一瓶生長狀態良好，鋪滿細胞培養瓶底部80％～90％的人尿道上皮細胞，細胞洗滌液清洗3次，胰蛋白酶消化，然后加入5ml培養基，吹打均勻；

(2)向24孔板的孔(帶細胞爬片)中加入500μl培養液，接著吸取50μl懸浮的人尿道上皮細胞到每個孔中，置于37℃，5％co2培養箱中培養；

(3)rmgpa(30μg)與組蛋白h2b單獨預孵育，4℃，2h；

(4)100μl的mg懸浮液(1×10⁷ccu/ml)與h2b單獨預孵育，37℃，30min；

(5)pbs(ph7.4)洗滌細胞3次，接著用4％的多聚甲醛固定細胞，4℃，30min；

(6)棄去4％的多聚甲醛，pbs洗滌3次，加入f-12k培養基封閉，37℃，1h；

(7)棄去封閉液，pbs洗滌3次，加入組蛋白h2b抗體到24孔板的孔中，置于37℃，孵育2h；

(8)分別加入rmgpa蛋白預孵育混合物和100μlmg懸浮液預孵育混合物到24孔板的孔中，置于37℃，2h；

(9)加入一抗和二抗的步驟及觀察樣本與rmgpa和mg的黏附試驗相同。

結果如下：

為了進一步驗證組蛋白h2b是能與rmgpa相互作用的受體蛋白，將rmgpa與組蛋白h2b預孵育后，再檢測rmgpa對人尿道上皮細胞的黏附情況。結果如圖6所示：與對照組相比，人尿道上皮細胞膜表面的紅色熒光明顯減少，說明部分rmgpa預孵育時與組蛋白h2b發生了特異結合，導致rmgpa對人尿道上皮細胞的黏附減少。這些結果說明組蛋白h2b能部分抑制rmgpa對人尿道上皮細胞的黏附。

然后，將mg與組蛋白h2b預孵育后，用間接免疫熒光檢測組蛋白h2b能否抑制mg對人尿道上皮細胞的黏附，在熒光顯微鏡下觀察到：與對照組相比，試驗組中人尿道上皮細胞膜表面和胞漿內的紅色熒光明顯減少，說明黏附和侵入人尿道上皮細胞的mg減少，如圖7所示。這些結果表明組蛋白h2b蛋白能部分抑制生殖支原體對人尿道上皮細胞的黏附與侵入。

<110>：南華大學

<120>：與生殖支原體mgpa相互作用的受體蛋白及其分離方法和用途

<160>：1

<210>：1

<211>：126

<212>：prt

<213>：人工序列

<400>：1

metprogluproalalysseralaproalaprolyslysglyserlys

151015

lysalavalthrlysalaglnlyslysaspglylyslysarglysarg

202530

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