本發明涉及生物
技術領域：
，具體涉及一種γδt細胞培養方法。
背景技術：
：γδt細胞是一類分布于外周血及粘膜組織的非mhc限制性固有t淋巴細胞，γδt細胞被認為是介于獲得性與天然免疫之間的特殊免疫細胞類型，占cd3+t細胞的1％～5％，大部分γδt細胞不表達cd4、cd8分子，有特異性識別抗原功能而無mhc限制，并在機體抗感染和自身免疫疾病及抗腫瘤等過程中起重要作用。在人體的外周血中均能分離得到γδt細胞。在大腸癌、肺癌、乳腺癌、腎癌、前列腺癌等多種腫瘤組織中亦分離得到γδt細胞。γδt細胞不僅能殺傷自體腫瘤細胞，還能殺傷異體腫瘤細胞，但對正常細胞無毒性?，F有γδt細胞培養技術是直接分離外周血中的單個核細胞(pbmc)，然后將pbmc細胞在含有一定濃度的il-2的培養基中與腫瘤細胞混合培養2周，得到109的細胞，并將其作為細胞制劑，運用于機體保健或臨床。現有技術主要采用il-2和腫瘤細胞共同刺激單個核細胞，使細胞進行擴增。其缺點主要是細胞擴增倍數相對較低，純度相對較低，且存在腫瘤細胞無法完全與γδt細胞分開等風險。技術實現要素：有鑒于此，本發明公開了一種γδt細胞培養方法，本發明將將高密度細胞培養瓶進行改造，然后將分離得到的單個核細胞采用il-2進行誘導，培養γδt細胞，并且采用腫瘤細胞裂解后的內容物來致敏γδt細胞，使γδt細胞的擴增效果得到增強，且其殺傷活性也大大增強。本發明公開的γδt細胞培養方法包括以下步驟：1)收集外周血，離心分離得到外周血單個核細胞；2)對步驟1)分離得到的外周血單個核細胞進行誘導培養；3)制備腫瘤細胞裂解內容物，將所述腫瘤細胞裂解內容物與步驟2)的產物進行共培養；4)對步驟3)的產物進行檢測。優選地，步驟2)所述的誘導培養為：將步驟1)分離得到的細胞以一定密度加入到xvivo-15培養基，并往培養基中加入濃度為50-500μg/ml的okt-3和濃度為100-1000u/ml的il-2。在本發明提供的實施例中，xvivo-15培養基購至瑞士lonza公司。作為優選，誘導培養的條件為37℃，二氧化碳含量為5％的二氧化碳培養箱。作為優選，誘導培養采用高密度細胞培養瓶進行培養。在本發明提供的實施例中，高密度細胞培養瓶購至美國cellline公司。在本發明中，高密度細胞培養瓶為一種雙室細胞培養瓶，主要模擬生物反應器進行細胞培養。在本發明中，腫瘤細胞裂解內容物為k562細胞經過反復凍融離心后的上清液。優選地，腫瘤細胞裂解內容物的制備方法為：將腫瘤細胞k562從培養箱中拿出來，迅速放入-196℃的液氮中30分鐘。從液氮中拿出來使勁搖晃，直到完成融解。再放入-196℃的液氮中。如此反復3-5次，直到腫瘤細胞完全破裂，細胞內容物完全釋放出來。然后將細胞內容物進行離心，5000rpm10分鐘，收集上清液即為腫瘤細胞裂解內容物。用bca法檢測內容物的蛋白濃度，得蛋白濃度為62.4μg/ml。相比于現有技術，本發明公開的γδt細胞培養方法具有以下優點：1、本發明專利主要采用改造后的高密度細胞培養瓶，在添加il-2的情況下誘導培養γδt細胞，使γδt細胞的擴增效果得到增強，且所用培養基減少，繼而降低了生產成本；2、本發明專利采用腫瘤細胞裂解后的內容物刺激γδt細胞，使其殺傷活性大大增強，且規避了γδt細胞終仍混有輻照后的腫瘤細胞的風險。附圖說明圖1示培養2周后γδt細胞的形態(100倍)，其中1-1為對比例1培養的γδt細胞，1-2為實施例1培養的γδt細胞；圖2示培養2周后γδt細胞的流式檢測結果；其中2-1～2-7分別為實施例1-6、對比例1培養的γδt細胞流式檢測結果。具體實施方式本發明公開了一種γδt細胞培養方法。下面將結合本發明具體實施例對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例只是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。本領域技術人員應當理解，對本發明的具體實施例進行修改或者對部分技術特征進行同等替換，而不脫離本發明技術方案的精神，均應涵蓋在本發明保護的范圍中。實施例中使用的試劑和組分均為市售或自制來源。在本發明中，高密度細胞培養瓶為一種雙室細胞培養瓶，主要模擬生物反應器進行細胞培養。該高密度細胞培養瓶購至cellline公司。腫瘤細胞裂解內容物為k562細胞經過反復凍融離心后的上清液。k562細胞為人慢性髓系白血病細胞株，由暨南大學生物醫藥研究基地惠贈。實施例1：(1)采集志愿者20ml血液；(2)離心后收集血漿；(3)將下層血細胞用生理鹽水進行稀釋，再將稀釋液加入已有ficoll分離液(購至stemcell公司)的sepmate離心管(購至stemcell公司)中，離心10-20min；(4)離心后將上層液體從離心管中倒出，再加入一定量的生理鹽水重懸細胞，離心；(5)按照1-2×106的細胞密度加入xvivo-15培養基進行培養，并在培養基中加入50μg/ml的okt-3和100u/ml的il-2。每日觀察γδt細胞的形態(圖1-2)。(6)以后每隔兩天補加一定的細胞培養液和細胞因子。(7)第6天，加入50ng/ml腫瘤細胞裂解后的內容物，對γδt細胞進行刺激。(8)以后每隔兩天補加一定的細胞培養液和細胞因子。(9)14天后，抽取1×106的細胞進行γδt細胞進行流式檢測，抽取8×106的細胞對k562細胞進行殺傷活性檢測，抽取部分消培養液檢測il-4和ifn-γ的表達量。實施例2：(1)采集志愿者20ml血液；(2)離心后收集血漿；(3)將下層血細胞用生理鹽水進行稀釋，再將稀釋液加入已有ficoll分離液(購至stemcell公司)的sepmate離心管(購至stemcell公司)中，離心10-20min；(4)離心后將上層液體從離心管中倒出，再加入一定量的生理鹽水重懸細胞，離心；(5)按照1-2×106的細胞密度加入xvivo-15培養基進行培養，并在培養基中加入500μg/ml的okt-3和100u/ml的il-2。每日觀察γδt細胞的形態(與圖1-2相似)。(6)以后每隔兩天補加一定的細胞培養液和細胞因子。(7)第6天，加入50ng/ml腫瘤細胞裂解后的內容物，對γδt細胞進行刺激。(8)以后每隔兩天補加一定的細胞培養液和細胞因子。(9)14天后，抽取1×106的細胞進行γδt細胞進行流式檢測，抽取8×106的細胞對k562細胞進行殺傷活性檢測，抽取部分消培養液檢測il-4和ifn-γ的表達量。實施例3：(1)采集志愿者20ml血液；(2)離心后收集血漿；(3)將下層血細胞用生理鹽水進行稀釋，再將稀釋液加入已有ficoll分離液(購至stemcell公司)的sepmate離心管(購至stemcell公司)中，離心10-20min；(4)離心后將上層液體從離心管中倒出，再加入一定量的生理鹽水重懸細胞，離心；(5)按照1-2×106的細胞密度加入xvivo-15培養基進行培養，并在培養基中加入100μg/ml的okt-3和100u/ml的il-2。每日觀察γδt細胞的形態(與圖1-2相似)。(6)以后每隔兩天補加一定的細胞培養液和細胞因子。(7)第6天，加入50ng/ml腫瘤細胞裂解后的內容物，對γδt細胞進行刺激。(8)以后每隔兩天補加一定的細胞培養液和細胞因子。(9)14天后，抽取1×106的細胞進行γδt細胞進行流式檢測，抽取8×106的細胞對k562細胞進行殺傷活性檢測，抽取部分消培養液檢測il-4和ifn-γ的表達量。實施例4：(1)采集志愿者20ml血液；(2)離心后收集血漿；(3)將下層血細胞用生理鹽水進行稀釋，再將稀釋液加入已有ficoll分離液(購至stemcell公司)的sepmate離心管(購至stemcell公司)中，離心10-20min；(4)離心后將上層液體從離心管中倒出，再加入一定量的生理鹽水重懸細胞，離心；(5)按照1-2×106的細胞密度加入xvivo-15培養基進行培養，并在培養基中加入50μg/ml的okt-3和1000u/ml的il-2。每日觀察γδt細胞的形態(與圖1-2相似)。(6)以后每隔兩天補加一定的細胞培養液和細胞因子。(7)第6天，加入50ng/ml腫瘤細胞裂解后的內容物，對γδt細胞進行刺激。(8)以后每隔兩天補加一定的細胞培養液和細胞因子。(9)14天后，抽取1×106的細胞進行γδt細胞進行流式檢測，抽取8×106的細胞對k562細胞進行殺傷活性檢測，抽取部分消培養液檢測il-4和ifn-γ的表達量。實施例5：(1)采集志愿者20ml血液；(2)離心后收集血漿；(3)將下層血細胞用生理鹽水進行稀釋，再將稀釋液加入已有ficoll分離液(購至stemcell公司)的sepmate離心管(購至stemcell公司)中，離心10-20min；(4)離心后將上層液體從離心管中倒出，再加入一定量的生理鹽水重懸細胞，離心；(5)按照1-2×106的細胞密度加入xvivo-15培養基進行培養，并在培養基中加入50μg/ml的okt-3和500u/ml的il-2。每日觀察γδt細胞的形態(與圖1-2相似)。(6)以后每隔兩天補加一定的細胞培養液和細胞因子。(7)第6天，加入50ng/ml腫瘤細胞裂解后的內容物，對γδt細胞進行刺激。(8)以后每隔兩天補加一定的細胞培養液和細胞因子。(9)14天后，抽取1×106的細胞進行γδt細胞進行流式檢測，抽取8×106的細胞對k562細胞進行殺傷活性檢測，抽取部分消培養液檢測il-4和ifn-γ的表達量。實施例6：(1)采集志愿者20ml血液；(2)離心后收集血漿；(3)將下層血細胞用生理鹽水進行稀釋，再將稀釋液加入已有ficoll分離液(購至stemcell公司)的sepmate離心管(購至stemcell公司)中，離心10-20min；(4)離心后將上層液體從離心管中倒出，再加入一定量的生理鹽水重懸細胞，離心；(5)按照1-2×106的細胞密度加入xvivo-15培養基進行培養，并在培養基中加入50μg/ml的okt-3和100u/ml的il-2。每日觀察γδt細胞的形態(與圖1-2相似)。(6)以后每隔兩天補加一定的細胞培養液和細胞因子。(7)第6天，加入50ng/ml腫瘤細胞裂解后的內容物，對γδt細胞進行刺激。(8)以后每隔兩天補加一定的細胞培養液和細胞因子。(9)14天后，抽取1×106的細胞進行γδt細胞進行流式檢測，抽取8×106的細胞對k562細胞進行殺傷活性檢測，抽取部分消培養液檢測il-4和ifn-γ的表達量。對比例1(1)采集志愿者20ml血液；(2)離心后收集血漿；(3)將下層血細胞用生理鹽水進行稀釋，再將稀釋液加入已有ficoll分離液(購至stemcell公司)的sepmate離心管(購至stemcell公司)中，離心10-20min；(4)離心后將上層液體從離心管中倒出，再加入一定量的生理鹽水重懸細胞，離心；(5)按照1-2×106的細胞密度加入xvivo-15培養基進行培養，并在培養基中加入50μg/ml的okt-3和100u/ml的il-2。每日觀察γδt細胞的形態(圖1-1)。(6)以后每隔兩天補加一定的細胞培養液和細胞因子。(7)第6天，收集所有的γδt細胞與在8kgry的條件下輻照4小時后的k562細胞共培養，γδt細胞與k562細胞的比例為10:1。(8)14天后，抽取1×106的細胞進行γδt細胞進行流式檢測，抽取8×106的細胞k562細胞進行殺傷活性檢測，抽取部分消培養液檢測il-4和ifn-γ的表達量。試驗例1流式細胞儀檢測γδt細胞表面標志物取實施例1、對比例1分選后及共同培養后的γδt細胞進行cd56和cd3的流式檢測。流式檢測方法如下：取1×106個γδt細胞；250g離心5min去上清；用含10％fbs的pbs溶液清洗2次；避光加入cd56和cd3抗體2.5μl室溫孵育30min；用含10％fbs的pbs溶液清洗2次；用500mlrpmi1640培養基重懸細胞并過濾，上流式細胞儀進行檢測(圖2)。結果顯示，對比例中cd56+和cd3+雙陽性表達率比所有實施例組都低，且差異具有統計學意義。試驗例2檢測γδt細胞的殺傷活性對上述實施例1-6和對比例1收集的γδt細胞的共培養物進行殺傷活性檢測。鋪板時各實驗孔和對照設置如下：實驗孔：按效靶比40:1、20:1和10:1進行靶細胞(k562)和效應細胞(實施例1-3得到的共培養物)的鋪板。其中，效應細胞的濃度分別為4×106個/ml，2×106個/ml，1×106個/ml，每孔100μl，每組3個復孔；k562濃度為1×105個/ml，每孔100μl，每組3個復孔。效應細胞自然釋放孔：4×106個/ml，2×106個/ml，1×106個/ml，每孔100μl，每組3個復孔，每孔加入100μl培養基。靶細胞最大釋放孔：1×105個/ml的靶細胞，每孔100μl，每組3個復孔，每孔加入100μl培養基，于37℃、5％二氧化碳培養箱孵育前45min每孔加入20μl細胞裂解液。靶細胞自然釋放孔：1×105個/ml的靶細胞，每孔100μl，每組3個復孔，每孔加入100μl培養基。培養液空白對照：每孔200μl培養液，每組3個復孔。體積糾正對照：每孔200μl培養液，每組3個復孔，于37℃、5％二氧化碳培養箱孵育前45min每孔加入20μl細胞裂解液。鋪板后將培養板250g離心4min，置于37℃、5％二氧化碳培養箱孵育4h。在培養結束前45min，取出培養板，在靶細胞最大釋放組和體積糾正組每孔加入20μl細胞裂解液，250g離心4min，繼續培養45min后取出。進行ldh(乳酸脫氫酶)測定，具體步驟如下：250g離心4min，每孔吸出50μl上清轉移到另一新的96孔板中，每孔加底物溶液50μl，室溫避光孵育30min。每孔加入50μl終止液，用振蕩器將色素顆粒打散，測定490波長處的吸光度值。試驗組、靶細胞ldh自然釋放組和效應細胞ldh自然釋放組的吸光度均值減去培養液空白對比例吸光度值均值，獲得校正值。靶細胞ldh最大釋放組的吸光度均值減去體積糾正組吸光度值均值，獲得校正值。殺傷活性按如下公式計算：活性＝(a-e-t)/(tmax-t)×100％………………(1)a:試驗組吸光度值校正值，e:效應細胞自然釋放孔吸光度值校正值，t：靶細胞自然釋放孔吸光度值校正值，tmax：靶細胞最大釋放組吸光度值校正值。檢測結果見表1。表1γδt細胞對k562細胞的殺傷活性檢測結果效靶比40:120:110:1實施例146.96％35.20％12.50％實施例252.30％42.10％15.30％實施例358.21％43.12％19.24％實施例449.52％35.90％14.23％實施例554.20％40.27％16.2％實施例651.23％34.20％17.65％對比例125.60％15.90％6.50％試驗例3檢測γδt細胞的il-4和ifn-γ的表達量(1)將巨噬細胞培養后的細胞培養液收集起來進行濃縮，為實驗品；分別將ifn-γ和il-4標準品溶解，分別設置了5個濃度，分別是10μg/ml，20μg/ml，30μg/ml、40μg/ml及50μg/ml；從已恢復到室溫的密封袋中取出實驗所需板條；(2)留空白孔，提前30min制備生物素化抗體工作液，于10℃～35℃下避光放置；(3)分別將實驗品或不同濃度的標準品(0μg/ml孔加試劑稀釋液)加入相應孔中，100μl/孔，用封板膠紙封住反應孔，37℃孵箱孵育90min；(4)洗板4次：(5)除空白孔外，加入酶結合物工作液，100μl/孔。用膠紙封住反應孔，于37℃孵箱避光孵育60min；(6)洗板4次；(7)除空白孔外，加入酶結合物工作液，100μl/孔。用膠紙封住反應孔，于37℃孵箱避光孵育30min；(8)洗板4次；(9)加入顯色底物，100μl/孔，于37℃孵箱避光孵育15min：(10)加入終止液，100μl/孔，混勻后檢測其吸光度值(od450值)。檢測結果見表2。表2ifn-γ和il-4含量以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。當前第1頁12