本申請是申請號為201110127667.4，發明名稱為培養基、細胞培養用試劑盒及細胞培養方法的中國發明專利申請(申請日為2011年5月17日)的分案申請。

本發明涉及培養基、細胞培養用試劑盒及細胞培養方法，特別是用于上皮細胞培養的培養基、細胞培養用試劑盒及細胞培養方法。

背景技術：

人體重要器官如肺、腎、肝、胰腺和皮膚都由器官特異性分化的上皮細胞為其組成成分。這些特異性分化的上皮細胞與不同器官的特異性功能直接相關，如肺的氣體交換功能、腎的過濾功能、肝的解毒及中和功能、胰腺細胞產生胰島素、皮膚具有保護機體免受外界環境的傷害。而這些重要器官一旦發生病變或退化就會威脅人類的健康，因為這些重要器官是很難被替換的，不同器官的特異性細胞也不能相互取代其它器官的細胞。

特異性分化的細胞，如腎上皮細胞、胰腺的胰島素產生細胞、真皮的毛囊和腺體細胞都是很難再生的，更不要說在體外進行培養增殖了。實驗動物(包括各種轉基因和克隆動物)是用于疾病發病機理研究和新藥研發的必要工具。但是，對于分離自人和哺乳動物的原代上皮細胞的體外培養仍然是很困難的。應用目前的無血清培養基，有的只能進行短期的原代培養(存活數天，如肺和胰腺等上皮細胞)，有的只能進行有限的傳代培養(1-3代，如氣管/支氣管及前列腺等上皮細胞)，有的甚至根本不能體外培養(如肝和結腸等上皮細胞)，只有來自于人體皮膚的角化上皮細胞可以傳代培養10代左右。而且從每個動物或活體組織樣品中獲得的上皮細胞產量仍然很低，包括細胞的數量、直接分離或短期培養的細胞純度都是很低的，這些原代和傳代上皮細胞的增殖速度也極為有限。

為了在體外進行上皮細胞的培養，目前國外嘗試通過遺傳操作，如轉入病毒(sv40t或hpv16e6e7)或細胞癌基因，可以延長體外細胞存活的代數。然而遺傳操作的最大缺點是會改變這些細胞的遺傳背景和表型，以致讓這些正常上皮細胞丟失其正常生理功能,如p53和prb信號通路常常被抑制。而且，這些經遺傳修飾的細胞是不可能重新再移植進機體的。但是由于目前缺乏有效的體外培養上皮細胞的技術，上述這些細胞在當今世界的醫學和生命科學研究中仍然備受青睞。在非癌癥研究領域，它們就代表著最初來源的“功能”性的組織或器官。在癌癥研究領域，它們還常常被用來作為“正常細胞”對照。而且它們的市場價格還非常昂貴。

抗腫瘤藥物研究的第一步就是藥物對癌細胞的特異性毒性實驗，目前所用的癌細胞株(如hela和a539等)多在體外傳代數年甚至數十年，它們在很大程度上已不能反應同類型人體惡性腫瘤的特性，一些實驗室還存在大量癌細胞株的交叉污染。而且對于不同的個體，即使同一類型的腫瘤也可能由不同的原因或機制所導致，因此對于每一種腫瘤，都需要有能代表其特定發病機制的細胞株來進行新藥研發。更為突出的例子，如前列腺癌的研究領域根本沒有人類原發前列腺癌的細胞系，僅有的細胞系(lncap,pc-3,du-145)都是來自轉移后的腫瘤組織。盡管如此，全世界90％以上的腫瘤研究和幾乎所有抗癌新藥的研究還在繼續使用著可能根本沒有代表性的癌細胞株。因此，目前癌癥研究和新藥研發要解決的關鍵問題是，如何能獲得反應各種類型人體腫瘤特性、同種腫瘤代表不同個體特性或不同發病機制的癌細胞。當然，歸根結底的真正難題是缺乏有效的上皮細胞的原代和傳代培養技術。另外，抗腫瘤藥物存在的很多毒副作用，很大程度上是因為新藥研究缺乏正常的細胞對照。若能得到來自于同一個體同一組織的癌細胞和正常細胞(美國asterand公司用上述hpve6e7轉化得到的所謂的“正?！焙桶┑那傲邢偌毎?，價格雖然高達1,2000美金/對，但還是十分搶手)，新藥研發的第一步將會回歸科學，抗癌新藥研究的歷史必將重寫。

再生醫學是現代臨床醫學的一種嶄新的治療模式，即以再生、再造、代替和新生為基本治療原理的現代干細胞移植治療術，利用干細胞(胚胎干細胞和成體干細胞)具有向各種細胞分化轉變能力，治療臨床上眾多的、目前尚無治療辦法的變性、壞死性和損傷性疾病，具有顯著和獨特的醫療效果。然而目前面臨的困境是，雖然胚胎干細胞具有分化能力，再生性和可塑性強，但可能致瘤和面臨倫理爭議，如何誘導其定向分化和增加移植的成活率仍然是未解的難題；而成體干細胞來源稀少，難以識別、分離及純化，因此阻礙了其臨床應用；目前新興的研究熱點——誘導性多能干細胞，由于其涉及遺傳操作導致細胞遺傳背景的改變，且導入的外源基因和病毒基因有致癌或致畸的潛能而不能用于臨床治療。

個體化醫學是現代醫學今后的發展方向。根據臨床病人的疾病發生/發展有關的遺傳背景及相關因素,在最短時間內準確地對疾病進行診斷、監測，制定真正的個體化治療方案是解決問題的關鍵。例如，世界衛生組織調查發現藥物安全性問題是住院病人致死最重要的原因之一。藥物反應個體差異所致不良反應已成為危害人類健康的重要公共衛生問題。而遺傳因素是造成藥物反應個體差異的主要原因。在美國，已經有70余種藥物經fda批準貼上了遺傳標簽,用于指示不同基因型的臨床患者在應用藥物時對療效和毒性的預測作用，而遺傳背景清晰的新藥研發必將成為未來發展的趨勢。如何利用極其微量的活檢組織(如針吸細胞等)對惡性腫瘤等疾病進行早期快速診斷、體外藥敏實驗、療效監測是對腫瘤患者個體化治療的關鍵。所有這些都將依賴于快速、有效的原代細胞培養技術才能真正實現。

生物銀行(時代周刊稱之為改變世界的十大觀念之一)正在全世界范圍興起。美國國立衛生研究院的研究人員正努力創建全美首個保存人類生物組織樣本、腫瘤細胞、dna，以及血液的全國性生物銀行。英、加、挪威和瑞典已設立了這類全國性的機構。搜集和儲藏足夠多的，從癌癥、大腦紊亂到新陳代謝疾病的生物組織樣本，為建立個體化醫學和新藥研發奠定基礎，讓篩選和治療患者更有針對性。但是目前生物銀行所儲存的只是包括冰凍組織、固定的組織、dna、rna、蛋白質、血液、血漿、血清和尿液等，這些極其寶貴的資源用之即去，無法再生。有效的原代和傳代細胞培養技術必將為生物銀行注入真正的“活”力。這種具有“再生”能力的生物銀行的出現將對現代醫學研究、個體化診斷和治療、新藥研發具有里程碑意義。

綜上所述，目前急需解決的問題是，如何快速、有效地進行組織器官來源的原代上皮細胞的增殖以及這些上皮細胞的傳代培養，并且能有效地延長上皮細胞的培養代數，同時又不能改變細胞的遺傳背景。

技術實現要素：

本發明人針對上述問題進行了深入研究，提出了新的培養基和試劑盒，通過使用該培養基或試劑盒體外增殖原代上皮細胞和傳代培養上皮細胞，能夠在不改變細胞遺傳背景的情況下，有效地延長上皮細胞的培養代數。

即，本發明提供下述培養基(也稱作本發明的培養基)：

1.一種培養基，其包含

血清，

鈣成分，和

rock抑制劑。

2.根據項1所述的培養基，其中，所述血清的含量是1.0～35v/v％。

3.根據項1所述的培養基，其中，所述rock抑制劑是選自法舒地爾、h-1152、y-27632、ha1100、ha1077和gsk429286中的一種或兩種以上。

4.根據項1所述的培養基，其用于培養上皮細胞。

5.根據項4所述的培養基，其中，所述上皮細胞是非角質上皮細胞。

6.根據項4所述的培養基，其中，所述上皮細胞是原代細胞。

7.根據項4所述的培養基，其中，所述上皮細胞是傳代細胞。

8.根據項4所述的培養基，其中，所述上皮細胞是腫瘤細胞。

9.根據項5所述的培養基，其中，所述非角質上皮細胞是鱗狀上皮細胞、柱狀上皮細胞、腺體上皮細胞或過渡類型上皮細胞。

10.根據項5所述的培養基，其中，所述非角質上皮細胞是口腔的、鼻粘膜的，氣管的、支氣管的、肺上皮的、食管上皮的，胃粘膜上皮的、大腸上皮的、小腸上皮的、肝細胞的、膽管上皮的，膽囊的，胰腺的、胰島β細胞,腎的、膀胱的、尿道上皮的、睪丸上皮的、卵巢上皮的、甲狀腺的、甲狀腺濾泡上皮細胞、腎上腺的、胸腺的、前列腺的、乳腺的、扁桃腺的，垂體的細胞，角膜上皮細胞，視網膜色素上皮細胞。

11.根據項1所述的培養基，其中，所述鈣成分的含量以鈣離子計為0.1μm～30mm。

12.根據項1所述的培養基，其中，該培養基還包含飼養細胞。

13.根據項1所述的培養基，其中，該培養基中包含條件培養基。

此外，本發明還提供下述試劑盒(也稱作本發明的試劑盒)：

14.一種試劑盒，其包含培養基、血清和rock抑制劑。

15.根據項14所述的試劑盒，該試劑盒用于培養上皮細胞。

16.根據項15所述的試劑盒，其中，所述上皮細胞是非角質上皮細胞。

17.根據項15所述的試劑盒，其中，所述上皮細胞是原代細胞。

18.根據項15所述的試劑盒，其中，所述上皮細胞是傳代細胞。

19.根據項15所述的試劑盒，其中，所述上皮細胞是腫瘤細胞。

20.根據項16所述的試劑盒，其中，所述非角質上皮細胞是鱗狀上皮細胞、柱狀上皮細胞、腺體上皮細胞或過渡類型上皮細胞。

21.根據項16所述的試劑盒，其中，所述非角質上皮細胞是口腔的、鼻粘膜的，氣管的、支氣管的、肺上皮的、食管上皮的，胃粘膜上皮的、大腸上皮的、小腸上皮的、肝細胞的、膽管上皮的，膽囊的，胰腺的、胰島β細胞,腎的、膀胱的、尿道上皮的、睪丸上皮的、卵巢上皮的、甲狀腺的、甲狀腺濾泡上皮細胞、腎上腺的、胸腺的、前列腺的、乳腺的、扁桃腺的，垂體的細胞，角膜上皮細胞，視網膜色素上皮細胞。

22.根據項14所述的試劑盒，其還包含鈣成分。

23.根據項14所述的試劑盒，其還包含飼養細胞。

24.根據項23所述的試劑盒，其中，所述飼養細胞是低溫凍存的。

25.根據項23所述的試劑盒，其中，所述飼養細胞是低溫儲存的。

26.根據項14所述的試劑盒，其中，其還包含用于在進行細胞培養時單獨盛放所述飼養細胞的容器，該容器具有可通透性膜結構。

27.根據項23所述的試劑盒，其中，所述飼養細胞是小鼠或人的成纖維細胞。

28.根據項14所述的試劑盒，其中，所述培養基包含條件培養基。

29.根據項14所述的試劑盒，其中，所述rock抑制劑是選自法舒地爾、h-1152、y-27632、ha1100、ha1077和gsk429286中的一種或兩種以上。

30.一種試劑盒，其包含項1～13中任一項所述的培養基和飼養細胞。

31.根據項30所述的試劑盒，其中，所述飼養細胞是低溫凍存的。

32.根據項30所述的試劑盒，其中，所述飼養細胞是低溫儲存的。

33.根據項30所述的試劑盒，其中，其還包含用于在進行細胞培養時單獨盛放所述飼養細胞的容器，該容器具有可通透性膜結構。

此外，本發明還提供下述的培養上皮細胞的方法(也稱作本發明的培養方法)：

34.一種培養上皮細胞的方法，該方法包括

步驟a：使用項1～13中任一項所述的培養基將上皮細胞與飼養細胞共培養。

35.根據項34所述的培養上皮細胞的方法，其中，所述上皮細胞是原代細胞。

36.根據項34所述的培養上皮細胞的方法，其中，所述上皮細胞是傳代細胞。

37.根據項34所述的培養上皮細胞的方法，其中，所述上皮細胞是腫瘤細胞。

38.根據項34所述的培養上皮細胞的方法，其中，所述上皮細胞是非角質上皮細胞。

39.根據項38所述的培養上皮細胞的方法，其中，所述非角質上皮細胞是鱗狀上皮細胞、柱狀上皮細胞、腺體上皮細胞或過渡類型上皮細胞。

40.根據項38所述的培養上皮細胞的方法，其中，所述非角質上皮細胞是口腔的、鼻粘膜的，氣管的、支氣管的、肺上皮的、食管上皮的，胃粘膜上皮的、大腸上皮的、小腸上皮的、肝細胞的、膽管上皮的，膽囊的，胰腺的、胰島β細胞,腎的、膀胱的、尿道上皮的、睪丸上皮的、卵巢上皮的、甲狀腺的、甲狀腺濾泡上皮細胞、腎上腺的、胸腺的、前列腺的、乳腺的、扁桃腺的，垂體的細胞，角膜上皮細胞，視網膜色素上皮細胞。

41.根據項34所述的培養上皮細胞的方法，其中，該培養上皮細胞的方法是上皮細胞傳代培養方法。

42.根據項34所述的培養上皮細胞的方法，其中，該培養上皮細胞的方法是原代上皮細胞增殖培養方法。

43.根據項34所述的培養上皮細胞的方法，其中，將上皮細胞與飼養細胞置于同一培養器皿中。

44.根據項34所述的培養上皮細胞的方法，其中，將飼養細胞單獨置于具有可通透性膜結構的容器中。

45.根據項34所述的培養上皮細胞的方法，其中，所述飼養細胞是小鼠或人的成纖維細胞。

46.一種培養上皮細胞的方法，該方法包括

步驟b：使用項12或13所述的培養基培養上皮細胞。

47.根據項46所述的培養上皮細胞的方法，其中，所述上皮細胞是原代細胞。

48.根據項46所述的培養上皮細胞的方法，其中，所述上皮細胞是傳代細胞。

49.根據項46所述的培養上皮細胞的方法，其中，所述上皮細胞是腫瘤細胞。

50.根據項46所述的培養上皮細胞的方法，其中，所述上皮細胞是非角質上皮細胞。

51.根據項50所述的培養上皮細胞的方法，其中，所述非角質上皮細胞是鱗狀上皮細胞、柱狀上皮細胞、腺體上皮細胞或過渡類型上皮細胞。

52.根據項50所述的培養上皮細胞的方法，其中，所述非角質上皮細胞是口腔的、鼻粘膜的，氣管的、支氣管的、肺上皮的、食管上皮的，胃粘膜上皮的、大腸上皮的、小腸上皮的、肝細胞的、膽管上皮的，膽囊的，胰腺的、胰島β細胞,腎的、膀胱的、尿道上皮的、睪丸上皮的、卵巢上皮的、甲狀腺的、甲狀腺濾泡上皮細胞、腎上腺的、胸腺的、前列腺的、乳腺的、扁桃腺的，垂體的細胞，角膜上皮細胞，視網膜色素上皮細胞。

53.根據項46所述的培養上皮細胞的方法，其中，該培養上皮細胞的方法是上皮細胞傳代培養方法。

54.根據項46所述的培養上皮細胞的方法，其中，該培養上皮細胞的方法是原代上皮細胞增殖培養方法。

通過使用本發明的培養基或試劑盒培養上皮細胞，能夠在不改變細胞遺傳背景的情況下，有效增殖培養原代上皮細胞，并有效地延長上皮細胞的培養代數。

附圖說明

圖1是本發明培養方法示意圖，其中，方案①、②、③是本發明的培養基與飼養細胞組合的三種培養系統。

圖2是采用本發明的條件培養基進行上皮細胞培養的工作流程圖。

圖3是采用本發明的飼養細胞間接(transwell)共培養系統進行上皮細胞培養的工作流程圖。

圖4是采用本發明的飼養細胞與上皮細胞直接共培養系統的工作流程圖。

圖5是正常人的支氣管原代上皮細胞在無血清培養基(左)和含血清培養基(右)中培養的生長狀態比較。圖中顯示，支氣管上皮細胞在含血清的培養基中不能增殖。按實施例5的方法分離制備原代支氣管上皮細胞，最后將獲得的細胞沉淀重新懸浮于完全的dmem培養基[成分為dmem,加入10％胎牛血清(fbs),100u/ml青霉素(penicillin)和100μg/ml鏈霉素(streptomycin)]中，或者是無血清的上皮細胞培養基sfm(gibco#10744-019)(見實施例10)。一周后，在常規倒置顯微鏡下觀察并照相。雖然培養效果不佳，但無血清培養基仍然廣泛用于常規的上皮細胞原代與傳代培養。

圖6是培養的正常人支氣管原代上皮細胞生長狀態比較。圖中顯示，對于支氣管上皮細胞，采用本發明的三種培養系統進行培養，細胞的生長增殖明顯優于使用常規的無血清培養基。按實施例5的方法分離制備原代支氣管上皮細胞，將獲得的細胞沉淀重新懸浮于實施例8的條件培養基中(方法見圖2)，或者重懸細胞于本發明的hl培養基(見實施例2，hl培養基6)中，按圖3的方法和實施例9所說明的飼養細胞間接共培養，或按圖4和實施例6進行原代培養。一周后，在常規倒置顯微鏡下觀察并照相。本圖示的研究中所需要的飼養細胞按照實施例1進行傳代和保種。本圖示的研究中所需要的hl培養基按實施例2制備。本圖示的研究中所需要的飼養細胞按實施例3和4獲得。

圖7是正常人支氣管上皮細胞體外傳代培養的比較。橫坐標表示培養天數，縱坐標表示細胞增殖的倍數。圖中顯示，對于支氣管上皮細胞，采用本發明的三種培養系統進行培養，細胞可以在體外傳代至少10代左右，明顯優于采用無血清培養基的培養。按實施例5的方法分離制備原代支氣管上皮細胞，將獲得的細胞沉淀重新懸浮于實施例8的條件培養基中(方法見圖2)，或者重懸細胞于本發明的hl培養基(見實施例2，hl培養基6)中，按圖3的方法和實施例9所說明的飼養細胞間接共培養，或按圖4和實施例6和7的說明進行傳代培養。本圖示的研究中所需要的飼養細胞按照實施例1進行傳代和保種。本圖示的研究中所需要的hl培養基按實施例2制備。本圖示的研究中所需要的飼養細胞按實施例3和4獲得。

圖8總結了本發明方法已經成功培養的上皮細胞的種系和類型。這些細胞分別來自于人、小鼠和大鼠。這些細胞的組織類型有，但不限定于：口腔、氣管、支氣管、肺上皮、胃、結腸、前列腺、乳腺、肝、胰腺、膀胱、卵巢和扁桃腺。具體實施步驟按實施例5的方法分離制備原代上皮細胞，將獲得的細胞沉淀重新懸浮于實施例8的條件培養基中進行培養(方法見圖2)，或者重懸細胞于本發明的hl培養基(見實施例2，其中hl培養基1用于乳腺、前列腺、胃、膀胱來源的上皮細胞培養；hl培養基2用于肝來源的上皮細胞培養；hl培養基3用于結腸、扁桃腺、乳腺、胃來源的上皮細胞培養；hl培養基4用于卵巢、扁桃腺來源的上皮細胞培養；hl培養基5用于胰腺、扁桃腺來源的上皮細胞培養；hl培養基6用于口腔、氣管、支氣管、肺來源的上皮細胞培養)，按圖3和實施例9所說明的飼養細胞間接共培養，或按圖4和實施例6和7的說明進行培養傳代。本圖示的研究中所需要的飼養細胞按照實施例1進行傳代和保種。本圖示的研究中所需要的hl培養基按實施例2制備。本圖示的研究中所需要的飼養細胞按實施例3和4獲得。

圖9所示為來源于人、大鼠和小鼠上皮細胞的培養實例。左圖是來源于人的前列腺上皮細胞，按實施例5的方法分離制備原代上皮細胞，將獲得的細胞沉淀重懸于實施例8的hl條件培養基(即由hl培養基1與飼養細胞共培養，按圖示2方法得到)中培養。中圖和右圖分別是來源于大鼠的乳腺上皮細胞和小鼠的肺上皮細胞，按實施例5的方法分離制備原代上皮細胞，將獲得的細胞沉淀重懸于實施例2中的hl培養基1或hl培養基6，按圖4和實施例6和7的方法進行傳代培養。本圖示的研究中所需要的飼養細胞按照實施例1進行傳代和保種。本圖示的研究中所需要的hl培養基按實施例2制備。本圖示的研究中所需要的飼養細胞按實施例3和4制備。

圖10比較不同胎牛血清濃度對上皮細胞生長的影響。按實施例2配制hl培養基，加入胎牛血清使其終濃度分別為1％，2％，5％，10％。15％，20％。將5000個第二代的正常人支氣管上皮細胞(來自圖7研究中，實施例9的方法)分別懸浮于3毫升上述的含不同胎牛血清濃度的hl培養基中，然后置于6孔的細胞培養板中，再將500000個飼養細胞(按實施例3制備)置于transwell筐(corning公司產品)中，按照圖3的方法，在5％co2，37℃的培養箱中培養6天。棄去transwell筐以及其中盛裝的飼養細胞，棄去培養板中剩余的培養基，以無鈣鎂的磷酸緩沖液洗一次，加入1ml0.05％edta/胰酶消化液，37℃孵育約2－3分鐘，待細胞完全脫壁后，加入2ml含10％胎牛血清的dmem培養基，充分混勻細胞，取出50ul細胞懸液混合于50ul的4％的臺盼藍(trypanblue)中染色，按常規方法進行細胞計數。

圖11本發明的培養基所添加的rock抑制劑的化學結構。

圖12顯示rock抑制劑的濃度對上皮細胞生長的影響。按實施例2配制hl培養基6，加入不同的rock抑制劑使其終濃度分別為1um，5um，10um，20um，50um。將5000個第二代的正常支氣管上皮細胞(從圖7研究中，實施例9的方法)分別懸浮于3毫升上述的含不同濃度rock抑制劑的hl培養基6中，然后置于6孔的細胞培養板中，再將500000個飼養細胞(按實施例3制備)置于transwell筐(corning公司產品)中，按照圖3的方法，在5％co2，37℃的培養箱中培養8天。棄去transwell筐以及其中盛裝的飼養細胞，棄去培養孔中剩余的培養基，以無鈣鎂的磷酸緩沖液洗一次，加入1ml0.05％edta/胰酶消化液，37℃孵育約2－3分鐘，待細胞完全脫壁后，加入2ml含10％胎牛血清的dmem培養液，充分混勻細胞，取出50ul細胞懸液混合于50ul的4％的臺盼藍(trypanblue)中染色，按常規方法進行細胞計數。

發明的具體實施方式

本發明的培養基

本發明的第一方面涉及一種培養基(也稱作本發明的培養基，即hl培養基)，其包含血清、鈣成分和rock抑制劑。

本說明書中，培養基是指用于培養生物材料的基質。對于生物材料沒有特殊限制，可以是病毒、細胞(例如微生物細胞、動物細胞、植物細胞)、組織(例如動物組織、植物組織)等。本發明的培養基優選是用于細胞培養的培養基，即細胞培養基。本發明的培養基更優選是用于上皮細胞培養的培養基。本說明書中的上皮細胞可以為例如非角質上皮細胞，例如來源于腺體，包括乳腺、前列腺、肝和腸道上皮的非角質上皮細胞。非角質上皮細胞分化為具有吸收或分泌功能的活性細胞，非角質上皮細胞并不是高度角質化結構的鱗狀上皮細胞。可用本發明的培養基培養的非角質上皮細胞可以來源于任何種類的組織器官。可以培養的非角質上皮細胞包括但不限定為如下類型：口腔的、鼻粘膜的，氣管的、支氣管的、肺上皮的、食管上皮的、胃粘膜上皮的、大腸上皮的、小腸上皮的、肝細胞的、膽管上皮的、膽囊的、胰腺(包括胰島β細胞)、腎的、膀胱的、尿道上皮的、睪丸上皮的、卵巢上皮的、甲狀腺的、甲狀腺濾泡上皮細胞、腎上腺的、胸腺的、前列腺的、乳腺的、扁桃腺的，垂體的細胞、角膜上皮細胞、視網膜色素上皮細胞。此外，本發明的培養基可以是固體粉末狀培養基，也可以是液體培養基，優選是液體培養基。當本發明的培養基是固體粉末狀培養基時，優選在使用時將其調制成液體培養基來進行細胞培養，在調制過程中可以添加血清、鈣成分和rock抑制劑等各種成分，使其滿足本發明的要件。

本說明書中，當對象為細胞時，“培養”或“細胞培養”是指在體外進行人工維系，使細胞得以增殖。細胞培養通常在無菌條件下進行，可以是培養單個細胞或組織。

本發明的培養基中應該含有血清。作為血清，可以使用細胞培養中常用的血清，例如小牛血清或胎牛血清，優選胎牛血清。作為血清，還包括各種血清替代物，血清替代物包括但不限定于商品化購買的產品(例如invitrogen公司的knockout^tm血清替代物,pallcorporation公司的ultroser^tm)，還包括牛奶及牛奶成分(例如過濾的脫脂牛奶干粉)。對于培養基中的血清的量沒有特殊限制，可以與常規的細胞培養中添加至培養基中的血清的量相同，并且本領域技術人員可以根據需要進行適當調整。優選地，以體積比計(v/v％)，培養基中血清含量的下限可以是1.0％、更優選2.0％、更優選3.0％、更優選4.0％、更優選4.5％、更優選5.0％；培養基中血清含量的上限可以是35％、更優選30％、更優選25％、更優選20％、更優選17％、更優選15％、更優選13％、更優選11％、更優選10％。

本說明書中，rock是指rho激酶1(rock1)和/或rho激酶2(rock2)。抑制rock是指降低rock1或rock2中的至少一種酶的活性、表達或功能。與未經處理的細胞相比，rock活性、表達或功能可以被完全抑制即達到無活性、無表達或無功能，也可以是活性、表達或功能水平降低。本說明書中，rock抑制劑是指：具有抑制rock的作用的物質。對于rock抑制劑，沒有特殊限制，可以使用本領域公知的rock抑制劑，例如法舒地爾(fasudil),h-1152,y-27632,ha1100,ha1077和gsk429286等,這些都是商品化的常用試劑。此外，rock抑制劑還包括在pct申請(wo03/059913,wo03/064397,wo05/003101,wo04/112719,wo03/062225和wo03/062227)中公開的、或者在美國授權專利(7,217,722和7,199,147)和美國申請專利(2003/0220357,2006/0241127,2005/0182040和2005/0197328)中公開的小分子rock抑制劑。對于本發明的培養基中rock抑制劑的含量沒有特殊限制，只要是有效量即可。所述有效量是指能夠抑制rock的量，確定有效量的方法是本領域技術人員公知的，本領域技術人員可以根據所培養的細胞的種類、所使用的rock抑制劑的種類等條件適宜地確定有效量。例如，雖然可能因細胞的種類、rock抑制劑的種類、細胞培養條件等而異，但一般而言，rock抑制劑含量可以在0.1μm～1mm之間。

本發明的培養基中還可以包含飼養細胞。本說明書中，飼養細胞是指：與希望培養的細胞共同培養的細胞，其中，所述希望培養的細胞優選是非角質上皮細胞。飼養細胞一般是經過gamma射線照射和/或絲裂霉素處理的，其有絲分裂受到抑制，但仍可維持代謝活性。因此，飼養細胞是具有代謝能力但不能分裂的非增殖細胞。處理和阻斷細胞有絲分裂并維持細胞代謝活性的方法可以是細胞生物學的常規方法。飼養細胞可以來源于任何哺乳動物，但其來源要與希望培養的細胞(優選非角質上皮細胞)來源的種屬不同。飼養細胞可以是但不限定于以下來源，如小鼠、大鼠、狗、貓、牛、馬、豬、靈長類以及人類的飼養細胞。典型的飼養細胞類型包括脾細胞、巨噬胸腺細胞和/或成纖維細胞，它們經處理后成為非增殖細胞。另外，本發明中也可以利用j2作為飼養細胞，j2細胞是建系的鼠成纖維細胞swiss3t3細胞系的亞克隆，經gamma射線照射和/或絲裂霉素處理。對于本發明的培養基中所包含的飼養細胞的量沒有特殊限制，本領域技術人員可以根據需要適宜確定，通常飼養細胞與希望培養的上皮細胞的比例可以是1：9～9：1，優選2：8～8：2。

此外，本發明的培養基中可以包含條件培養基。本說明書中，條件培養基是指包含飼養細胞分泌物和/或提取物的培養基。典型的條件培養基是用培養基培養飼養細胞一段時間后，再除去飼養細胞而得到的培養基。此處，用于培養飼養細胞的培養基優選是包含血清、鈣成分和rock抑制劑的培養基，例如本發明的培養基。對于培養飼養細胞的時間，沒有特殊限制，本領域技術人員可以根據需要適宜確定，通?？梢允?～300小時，優選5～200小時，更優選10～150小時，更優選10～150小時，更優選20～100小時，更優選24～72小時，更優選35～60小時，更優選40～50小時。一般而言，制備條件培養基例如包括將細胞培養于一種培養基中(如f培養基)，幾天后收集這些培養基。條件培養基可以是，用新鮮培養基按一定比例稀釋后的條件培養基，也可以是不經稀釋的收集后的條件培養基。新鮮培養基：條件培養基的稀釋比例可以是1:99～99:1，依具體實驗條件而定。本發明中所述的“條件培養基”包括經任何比例稀釋或不稀釋的條件培養基。優選地，本發明的培養基可以是含有血清、鈣成分和rock抑制劑的未經稀釋的條件培養基。

本發明的培養基可以使用用于細胞培養的常規培養基來制備。常規培養基是指本技術領域公知的用于細胞培養(優選用于上皮細胞培養)的培養基，包括但不限于：dmem(dulbecco’smodifiedessentialmedium),ham’sf12培養基,ham’sf-10培養基,rpmi1640,eagle’sbasalmedium(ebm),eagle’sminimumessentialmedium(mem),hepes,medium199以及相關類型培養基。常規培養基也可以是兩種以上培養基的組合，例如dmem和f12的混合培養基。常規培養基的配方中一般不包含血清，因此，當使用常規培養基來制備本發明的培養基時，可以另行添加一定量的血清，使得培養基中的血清含量在上述限定的范圍內。增加或減少培養基中的血清的操作是本技術領域的常規操作。

本發明的培養基中應該含有鈣成分。此處所稱的“鈣成分”是指能夠為本發明的培養基提供鈣離子(ca²⁺)的成分，包括但不限于含鈣的化合物。通常，鈣成分來源于血清或血清替代物，或者來源于培養基中添加的含鈣的鹽類。所述鈣成分例如可以以鈣鹽(例如氯化鈣、硫酸鈣)的形式添加至培養基中。鈣成分的含量范圍(以鈣離子計)可以與用于細胞培養的常規培養基中的鈣成分含量相同，并且本領域技術人員可以根據需要進行適當調整。例如，以ca²⁺計，鈣成分含量的下限可以是0.1μm、優選10μm、更優選100μm、更優選200μm、更優選400μm、更優選500μm、更優選800μm、更優選1mm、更優選1.2mm、更優選1.3mm、更優選1.5mm；鈣成分含量的上限可以是30mm、更優選25mm、更優選20mm、更優選15mm、更優選12mm、更優選10mm、更優選8mm、更優選7mm、更優選6mm、更優選5mm、更優選4mm、更優選3mm、更優選2.8mm、更優選2.5mm。

當使用常規培養基來制備本發明的培養基時，優選進行調整使得鈣成分含量在上述限定的范圍內。如果常規培養基的經典配方中包含鈣且鈣成分含量在上述限定的范圍內，則就鈣成分含量而言，該常規培養基無需進行調整；如果常規培養基的經典配方中包含鈣但鈣成分含量不在上述限定的范圍內，則應該相應地增加或減少配方中的鈣，使得培養基的鈣成分含量在上述限定的范圍內；如果常規培養基的經典配方中不包含鈣，則應該在配方中增加鈣，使得培養基的鈣成分含量在上述限定的范圍內。增加或減少培養基中的鈣成分含量的操作是本技術領域的常規操作。

本發明的培養基中可以添加其它常規成分，包括但不限定于：氨基酸類、維生素類、無機鹽類、腺嘌呤、乙醇胺(ethanolamine)、d-葡萄糖、肝素(heparin)、n-[2-羥乙基(hydroxyethylpiperazine)-n'-[2-乙磺酸(ethanesulfonicacid)](hepes)、皮質醇(hydrocortisone)、insulin(胰島素)、表皮生長因子(egf)、腎上腺素(epinephrine)、硫辛酸(lipoicacid)、酚紅、磷酸乙醇胺(phosphoethanolamine)、腐胺(putrescine)、霍亂毒素(choleratoxin)、丙酮酸鈉(sodiumpyruvate)、三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine，t3)、胸腺嘧啶和運鐵蛋白(transferrin)。其中，肝素和運鐵蛋白可以用檸檬酸鐵(ferriccitrate)或螯合硫酸鐵(ferroussulfatechelates)替代。上述添加成分均可以商品化購買。

本發明的培養基中的氨基酸類包括但不限定于：l-丙氨酸、l-精氨酸、l-天冬酰胺(l-asparagine)、l-天冬氨酸、l-半胱氨酸、l-谷氨酸、l-谷氨酰胺、甘氨酸、l-組氨酸、l-異亮氨酸、l-亮氨酸、l-賴氨酸、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-絲氨酸、l-蘇氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸和l-纈氨酸。

本發明的培養基中的維生素類包括但不限定于：生物素、氯化膽堿(cholinechloride)、d-ca⁺²-泛酸(pantothenate)、葉酸(folicacid)、i-肌醇(i-inositol)、煙酰胺(niacinamide)、多醇(pyridoxine)、核黃素(riboflavin)、維生素b1(thiamine)和維生素b12。

無機鹽類成分包括但不限定于：鈣鹽(如cacl2)、cuso4、feso4、kcl、鎂鹽(如mgcl2)、錳鹽(如mncl2)、醋酸鈉、nacl、nahco3、na2hpo4、na2so4，以及痕量的其它元素如硒(selenium)、硅、鉬(molybdenum)、釩(vanadium)、鎳、錫、鋅，這些痕量元素可以以多種形式出現，但最好是鹽類的形式，如na2seo3,na2sio3,(nh4)6mo7o24,nh4vo3,niso4,sncl和znso4.

本發明的培養基的其它添加成分包括但不限定于：肝素、表皮生長因子(epidermalgrowthfactor，egf)、至少一種可以增加細胞內環腺苷一磷酸(cyclicadenosinemonophosphate，camp)水平的因子、至少一種成纖維細胞生長因子(fibroblastgrowthfactor，fgf)。上述添加成分可以直接加入到基礎培養基中，也可以用dpbs(dulbecco'sphosphatebufferedsaline)緩沖液配制成混合液，冷凍保存直至配制培養基時再行添加。本發明的培養基中的肝素可以商業化購買。肝素的主要作用是穩定生長因子的活性，如fgf。肝素在基礎培養基中的添加濃度為1-500u.s.p.units/l。egf也可以商業化購買，egf在基礎培養基中的添加濃度為0.00001-10mg/l。

本發明的培養基中可以包含多種種類的能增加細胞內camp水平的因子，可以是直接增加camp水平的[如二丁酰(dibutyryl)camp]，也可以是通過與細胞g蛋白相互作用導致細胞內camp水平升高[如霍亂毒素和毛喉素(forskolin)]，或者作為β-腎上腺素受體(β-adrenergicreceptors)的拮抗劑(如異丙腎上腺素)增加細胞內camp水平、或者通過抑制camp磷酸二酯酶的活性而使細胞內camp水平增加[如isobutylmethylxanthine(ibmx)和茶堿(theophylline)]。上述這些化合物都可以商業化購買。

本發明的試劑盒

本發明的第二方面涉及一種試劑盒(本發明的試劑盒)，其包含培養基、血清、鈣成分和rock抑制劑。

本發明的試劑盒優選用于培養細胞。所述細胞優選是上皮細胞，更優選是非角質上皮細胞。

所述培養基可以是任何用于培養細胞的培養基，例如上述的常規培養基，優選可以是上述的條件培養基。所述血清、鈣成分和rock抑制劑同上述。本發明的試劑盒可以用于配制上述本發明的培養基。本發明的試劑盒中，培養基、血清和rock抑制劑三者的比例優選滿足將三者混合后能夠形成上述本發明的培養基。

優選地，本發明的試劑盒還包含鈣成分，此時，培養基、血清、鈣成分和rock抑制劑四者的比例優選滿足將四者混合后能夠形成上述本發明的培養基。

優選地，本發明的試劑盒還包含飼養細胞。所述飼養細胞同上述。所述飼養細胞可以是常規貼壁的，常溫下可存活3-5天；所述飼養細胞也可以是低溫凍存的，低溫凍存是指在-80℃以下長期儲存，一般可以儲存幾天至幾年。所述飼養細胞還可以是低溫儲存的，低溫儲存是指在4℃下儲存，一般可以儲存1～7天。

優選地，本發明的試劑盒還包含用于在進行細胞培養時單獨盛放所述飼養細胞的容器，該容器具有可通透性膜結構。特別是，在本發明的試劑盒包含飼養細胞的情況下，優選其還包含所述容器。所述容器的作用是，在進行細胞培養時，將飼養細胞與需要培養的細胞隔離開來進行培養，并使得飼養細胞的分泌物通過上述可通透性膜結構進入到培養需要培養的細胞的培養基中。對于所述容器的形狀、材質、規格等均無特殊限制，本領域技術人員可以根據需要適宜選擇。例如，可以使用transwell筐(corning公司產品)。

優選地，本發明的試劑盒包含本發明的培養基和飼養細胞，更優選還包含所述容器。

本發明的試劑盒中還可以包含用于添加到培養基中的其它成分，包括但不限于在前述的“本發明的培養基”一節中描述的添加成分。

本發明的試劑盒中還可以包含用于細胞培養的其它成分或組件，例如指示劑、胰酶、培養瓶、培養皿、使用說明書等。

本發明的試劑盒中，優選所述各成分分開放置，更優選分別置于獨立的容器中。

本發明的培養方法

本發明的第三方面涉及一種培養上皮細胞的方法(也稱本發明的培養方法)，該方法包括

步驟a：使用上述本發明的培養基將上皮細胞與飼養細胞共培養；或

步驟b：使用上述的包含飼養細胞或條件培養基的本發明的培養基培養上皮細胞(見圖2)。

本發明的培養方法可以是上皮細胞傳代培養方法，也可以是原代上皮細胞增殖培養方法。

這里，所述上皮細胞和飼養細胞均同前述。

步驟a中可以將上皮細胞與飼養細胞直接共培養，也可以將上皮細胞與飼養細胞間接共培養。所述直接共培養是指將上皮細胞與飼養細胞置于同一培養器皿中，進行培養(見圖4)；所述間接共培養是指將飼養細胞單獨置于上述的具有可通透性膜結構的容器(例如transwell筐)中，然后，可以例如再將該裝有飼養細胞的容器置于培養上皮細胞的培養基中，進行培養(見圖3)。

本發明的培養方法中的其它步驟可以按照本技術領域的常規方法進行。

細胞的接種密度可以根據具體的實驗條件進行適當調整。常規的一次性塑料培養器皿中，一般接種細胞數為1x10⁴～10x10⁵細胞/cm²，即75cm²培養瓶接種細胞數例如為1x10⁶。每一次傳代都要根據具體實驗要求對細胞密度進行調整。

哺乳動物細胞通常培養于37℃、適當co2濃度(3～10％)、一定濕度的培養箱中，溫度、co2濃度和濕度可以根據具體實驗條件進行調整。培養基的ph的范圍可以根據需要調整，通常為ph7.1～7.6,優選為ph7.1～7.3

細胞培養基通常1-2天更換一次，也可根據具體培養的細胞類型進行調整。只要細胞在培養器皿中生長至滿豐度，就可以進行傳代了。本說明書中，細胞傳代是指將細胞分種一部分至新的培養器皿中。

實施例

以下，通過實施例對本發明進行更具體的說明，但本發明不受這些實施例的限制。此外，實施例中未經特別標注的試劑，均購自gibco公司。

實施例1swiss3t3細胞的培養傳代

swiss3t3細胞從harvarduniversity的howardgreen教授實驗室獲得。所需試劑：

完全的dmem培養基：dmem(gibco#11965-092),10％胎牛血清(fbs),100u/ml青霉素(penicillin)和100μg/ml鏈霉素(streptomycin)

胰酶消化液:0.05％胰酶/edta(gibco#25300-062)

無鈣鎂磷酸緩沖液：ca²⁺,mg²⁺freepbs

傳代培養操作步驟：

接種1x10⁵swiss3t3細胞于t75細胞培養皿，加入10ml上述的完全dmem培養基，置于co2培養箱在5％co2，37℃培養2－5天。當細胞單層豐度為80－90％時，移去培養皿中的培養基，以10ml無鈣鎂磷酸緩沖液洗滌細胞單層2次，加入2ml胰酶消化液，在37℃孵育1分鐘。輕拍培養皿以充分釋放貼壁的細胞，以10ml完全的dmem培養基中和消化反應。4℃離心5分鐘(1000轉/分鐘)沉淀細胞，移去上清，重懸細胞沉淀于10ml完全的dmem培養基中培養。根據需要可以1：10，1：20或1：50比例傳代于新的t75(10－15ml完全的dmem培養基)或t175(25-30ml完全的dmem培養基)的培養皿中，根據需要每周更換新鮮完全的dmem培養基2－3次。必要時可將1x10⁶細胞重懸于1－2ml的細胞凍存液(60％dmem,30％胎牛血清和10％dmso)中,儲存于液氮中備用。

實施例2hl培養基

hl培養基1為dmem(gibco#11965-092)與ham’sf-12nutrientmix(gibco#11765-054)的混合培養基，體積配比為3:1，同時添加5％的胎牛血清，以及0.4μg/ml皮質醇(hydrocortisone),5μg/ml胰島素(insulin),8.4ng/ml霍亂毒素(choleratoxin),10ng/ml表皮生長因子(epithelialgrowthfactor(egf)),24μg/ml腺嘌呤(adenine),100u/ml青霉素(penicillin)和100μg/ml鏈霉素(streptomycin)，0.25μg/ml兩性霉素b(fungizone,)30μm法舒地爾(fasudil)(或0.5μmh-1152或5μmy-27632,30μmha1100,10umgsk429286),上述培養基需經0.22μ孔徑濾膜過濾。

hl培養基2為在dmem(lowglucose，noglutamine，gibco#11054-020)中添加10％的胎牛血清，以及0.4μg/ml皮質醇(hydrocortisone),5μg/ml胰島素(insulin),8.4ng/ml霍亂毒素(choleratoxin),10ng/ml表皮生長因子(epithelialgrowthfactor(egf)),24μg/ml腺嘌呤(adenine),100u/ml青霉素(penicillin)和100μg/ml鏈霉素(streptomycin)，0.25μg/ml兩性霉素b(fungizone,)30μm法舒地爾(fasudil)(或0.5μmh-1152或5μmy-27632,30μmha1100,10μmgsk429286),上述培養基需經0.22μ孔徑濾膜過濾。

hl培養基3為rpmi培養基1640(gibco#22400-121)含5mmhepes,添加8％的胎牛血清，以及0.4μg/ml皮質醇(hydrocortisone),5μg/ml胰島素(insulin),8.4ng/ml霍亂毒素(choleratoxin),10ng/ml表皮生長因子(epithelialgrowthfactor(egf)),24μg/ml腺嘌呤(adenine),100u/ml青霉素(penicillin)和100μg/ml鏈霉素(streptomycin)，0.25μg/ml兩性霉素b(fungizone,)30μm法舒地爾(fasudil)(或0.5μmh-1152或5μmy-27632,30μmha1100,10μmgsk429286),上述培養基需經0.22μ孔徑濾膜過濾。

hl培養基4為在l-15(leibovitz)培養基(l-glutamine,nohepes,gibco#11415064)中添加5％的胎牛血清，以及0.4μg/ml皮質醇(hydrocortisone),5μg/ml胰島素(insulin),8.4ng/ml霍亂毒素(choleratoxin),10ng/ml表皮生長因子(epithelialgrowthfactor(egf)),24μg/ml腺嘌呤(adenine),100u/ml青霉素(penicillin)和100μg/ml鏈霉素(streptomycin)，0.25μg/ml兩性霉素b(fungizone,)30μm法舒地爾(fasudil)(或0.5μmh-1152或5μmy-27632,30μmha1100,10μmgsk429286),上述培養基需經0.22μ孔徑濾膜過濾。

hl培養基5為在培養基199(withearle'ssaltsbutnol-glutamine，nosodiumbicarbonate，gibco#11825015)中添加10％的胎牛血清，以及0.4μg/ml皮質醇(hydrocortisone),5μg/ml胰島素(insulin),8.4ng/ml霍亂毒素(choleratoxin),10ng/ml表皮生長因子(epithelialgrowthfactor(egf)),24μg/ml腺嘌呤(adenine),100u/ml青霉素(penicillin)和100μg/ml鏈霉素(streptomycin)，0.25μg/ml兩性霉素b(fungizone,)30μm法舒地爾(fasudil)(或0.5μmh-1152或5μmy-27632,30μmha1100,10μmgsk429286),上述培養基需經0.22μ孔徑濾膜過濾。

hl培養基6為dmem(gibco#11965-092)與無血清培養基sfm(gibco#10744-019的混合培養基，體積配比為1:3，同時添加5％的胎牛血清，以及0.4μg/ml皮質醇(hydrocortisone),5μg/ml胰島素(insulin),8.4ng/ml霍亂毒素(choleratoxin),10ng/ml表皮生長因子(epithelialgrowthfactor(egf)),24μg/ml腺嘌呤(adenine),100u/ml青霉素(penicillin)和100μg/ml鏈霉素(streptomycin)，0.25μg/ml兩性霉素b(fungizone,)30μm法舒地爾(fasudil)(或0.5μmh-1152或5μmy-27632,30μmha1100,10μmgsk429286),上述培養基需經0.22μ孔徑濾膜過濾。

實施例3飼養細胞(失去分裂能力的swiss3t3細胞)的制備(絲裂酶素c處理swiss3t3細胞)

1)作為飼養細胞的swiss3t3細胞，宜采用傳代培養早期的細胞。當swiss3t3細胞生長至滿豐度時,培養基中加入終濃度為10μg/ml的絲裂酶素c(溶于水,儲存液濃度為0.5mg/ml),37℃處理2小時；

2)再加入溫浴的1xpbs或無血清的培養基(dmem)洗3次，棄洗液；

3)加入0.05％胰酶/edta預消化細胞30-40秒后棄去，再次加入0.05％胰酶/edta消化30秒，輕拍培養皿使細胞分散，然后加入完全培養基(含10％胎牛血清的dmem)中和反應；

4)低速離心(1000rpm)去上清，獲得細胞沉淀；

5)沉淀下來的細胞可以直接用作飼養細胞，或者貯存備用；

a)直接用作飼養細胞的情況，操作步驟如下:

-加入溫浴的1xpbs洗細胞沉淀1次，再次離心

-將細胞懸于hl培養基中

-以適當的比例(如1：3)將飼養細胞與一定數量的上皮細胞混懸于hl培養基中，上皮細胞最適接種濃度為2.5x10⁵個/100mm的培養皿；

b)飼養細胞是第二天備用的情況，操作步驟如下:

-加入溫浴的1xpbs洗細胞沉淀1次，再次離心

-將細胞懸于完全dmem培養基(含10％胎牛血清的dmem)

-以1:3的比例接種于培養皿中，培養過夜

-第二天用溫浴的1xpbs洗細胞2次,換成hl培養基

-再將上皮細胞接種于含飼養細胞的培養皿中,上皮細胞最適接種濃度為2.5x10⁵個/100mm的培養皿；

c)飼養細胞是貯存備用的情況，操作步驟如下:

-加入溫浴的1xpbs洗細胞沉淀1次

-將飼養細胞重懸于6ml的凍存液(90％胎牛血清和10％dmso)中，分于3支凍存管中

-凍存于液氮或–150℃條件下

-臨用時取1支復蘇，加入完全dmem培養基(含10％胎牛血清的dmem)接種于100mm培養皿

備注：被用作飼養細胞的3t3細胞經絲裂酶素c處理后，需在3-5天內使用或者低溫凍存備用。

實施例4.飼養細胞(失去分裂能力的swiss3t3細胞)的制備(放射線處理swiss3t3細胞)

作為飼養細胞的swiss3t3細胞，宜采用傳代培養早期的細胞，這些細胞培養于dmem培養基中，生長至近滿豐度，用不含ca²⁺/mg²⁺的1xpbs洗細胞1次，加入1ml0.05％胰酶消化細胞20-40秒，然后加入9ml完全dmem培養基(含10％胎牛血清的dmem)中和消化反應，于4℃低速離心1000rmp收集細胞沉淀，加入10mldmem重懸細胞，放射線照射細胞懸液，即cesium-137射線儀(jlshepherdmark)處理3000rad(30grey)。這些經放射線處理的swiss3t3細胞，接種于hl培養基中直接用作飼養細胞；或者培養于完全dmem培養基或置于4℃儲存并于1-7天之內使用；或者長期凍存于-80℃或液氮中備用。

實施例5.新鮮組織中分離培養原代上皮細胞

在病人或病人監護人知情同意的情況下，收集人的正常或腫瘤組織樣品。

具體操作步驟如下:

1.消化液的配制：含膠原酶/透明質酸酶(終濃度為1x的混合液)的hl培養基(即dmem:f12體積比3：1的混合培養基)，添加5％fbs。根據新鮮組織的大小決定消化液的用量，通常需要10倍于樣品體積的消化液的用量，例如2-3個小鼠前列腺需2-5ml消化液；

2.用95-100％的乙醇洗分離的新鮮組織1次，再用pbs洗2次，然后將組織放入含預冷pbs的無菌培養皿中，在解剖顯微鏡下，用解剖鑷子和剪刀去除組織中殘留的脂肪。

3.將組織樣品放入含上述消化液的14ml或50ml離心管中，37℃消化1-3小時。

4.將消化后的組織低速離心(1000rpm)5分鐘，去除上清。

5.將細胞沉淀重懸于2-5ml的0.25％胰酶/edta中，置于冰上1小時或室溫10分鐘。

6.然后加入10ml含10％fbs的dmem培養基，低速1000rmp離心5分鐘。

7.盡量將上清去除干凈。

8.加入2ml溫浴的5mg/ml分散酶和200μl的1mg/mldnasei，用無菌的p1000一次性塑料槍頭反復吹打樣品1分鐘。

9.加入10ml含10％fbs的dmem，用40-70μm孔徑的過濾器過濾細胞懸液，收集過濾后的細胞懸液，低速1000rmp離心5分鐘，去除上清。

10.重懸細胞沉淀于hl培養基中，接種于t25或t75的培養瓶中按本發明的任一方案(見圖1－4)培養。

實施例6.飼養細胞/上皮細胞的直接共培養(見圖4和圖6)

上述絲裂酶素c處理或放射線照射的飼養細胞(失去分裂能力的swiss3t3細胞)作為飼養層與上皮細胞的共培養按以下三種方式進行：

1.直接飼養細胞/上皮細胞共培養。加入溫浴的1xpbs洗飼養細胞沉淀1次，再次離心,將細胞懸于hl培養基中,以1:3比例將飼養細胞與一定數量的上皮細胞混懸于hl培養基中，上皮細胞最適接種濃度為2.5x10⁵個/100mm的培養皿，將培養瓶置于37℃，5％co2條件下培養。

2.飼養細胞先行貼壁，再加入上皮細胞共培養。將上述絲裂酶素c處理或放射線照射的飼養細胞懸于完全dmem培養基(含10％胎牛血清的dmem)，以1:3的比例接種于培養皿中,37℃培養2－3小時或過夜,用溫浴的1xpbs洗細胞2次,換成hl培養基,再將上皮細胞接種于含飼養細胞的培養皿中,上皮細胞最適接種濃度為2.5x10⁵個/100mm的培養皿,貼壁的飼養細胞可于3-5天任何時間內使用。將培養瓶置于37℃，5％co2條件下培養。

3.飼養細胞在4℃或液氮貯存備用。將上述絲裂酶素c處理或放射線照射的飼養細胞懸于完全dmem培養基(含10％胎牛血清的dmem)存于4℃(1－7天)或長期儲存于液氮，復蘇后按上述方法2進行與上皮細胞的共培養(hl培養基中)。上皮細胞最適接種濃度為2.5x10⁵個/100mm的培養皿。將培養瓶置于37℃，5％co2條件下培養。

不論以上述哪種方式的共培養,第二天應更換新鮮的hl培養基。當多于50％的飼養細胞脫落時，應補充新鮮的上述絲裂酶素c處理或放射線照射的飼養細胞，直到上皮細胞生長至70－90％豐度需要傳代時。

實施例7.飼養細胞/上皮細胞的分離傳代

1.上皮細胞生長至70-90％豐度，吸出培養基，用溫浴的pbs洗1次，

2.吸出pbs，加入10-12ml溫浴的含0.02％edta(0.68mm)的pbs洗滌細胞，以去除飼養細胞swiss3t3；特別注意，洗滌細胞需盡量快速，先將edta溶液加到培養皿外周的細胞，旋轉搖動培養皿，然后再使edta溶液回旋至培養皿內周的細胞，重復回旋洗滌細胞10次。

3.吸出edta洗液，再次加入0.02％edta至培養皿內側的細胞，旋轉搖動培養皿，然后使edta溶液回旋至培養皿外側的細胞，重復回旋洗滌細胞30次。通常人的角質上皮細胞需要40次edta洗滌，其它細胞根據貼壁緊密程度不同，可適當調整洗滌次數。

4.吸出edta洗液，加入溫浴的pbs洗3次，始終保持培養皿傾斜。最后一次洗滌液吸出之前，在顯微鏡下觀察，確認所有飼養細胞swiss3t3已經被完全洗掉，否則，需再次增加edta洗滌次數。

5.采用常規胰酶方法消化上皮細胞，對于角質上皮細胞而言，胰酶常溫消化2分鐘，吸出消化液，再次于37℃胰酶消化5分鐘，輕拍培養皿使細胞分散，重懸細胞于hl培養基中。然后接種上皮細胞于絲裂霉素c或放射線處理過的飼養細胞上，最適細胞接種密度為2.5x10⁵個/100mm的培養皿；

7.必要時可將1x10⁶上皮細胞重懸于1－2ml的細胞凍存液(90％胎牛血清和10％dmso)中,儲存于液氮中備用。

實施例8.飼養細胞條件培養基的制備和上皮細胞的培養傳代(見圖2和圖6)

按照圖2,將上述絲裂酶素c處理或放射線照射的飼養細胞培養于hl培養基中(t75培養瓶：2x10⁶細胞，15mlhl培養基；t175:5x10⁶細胞，35mlhl培養基)在37℃、5％co2的培養箱中培養48小時。收集培養基，2000rpm離心15分鐘，經0.22μ濾膜過濾，按1：5比例(可按1：99－99：1優化)與新鮮配制的hl培養基混合即得到hl條件培養基。將分離制備的原代細胞懸液或者傳代細胞直接于hl條件培養基中進行培養，培養條件是37℃、5％co2。當細胞增殖至70－90％豐度時，1xpbs洗滌細胞兩次，0.05％胰酶/edta消化單層細胞2－5分鐘，10ml完全的dmem中和消化反應，1000rmp離心5分鐘，去上清，以一定比例(1:2,1:3,1:4,1:5均可，只要可以維持細胞貼壁和正常生長)重懸細胞沉淀于10mlhl條件培養基中接種培養。必要時可將1x10⁶上皮細胞重懸于1－2ml的細胞凍存液(90％胎牛血清和10％dmso)中,儲存于液氮中備用。

實施例9.上皮細胞/飼養細胞間接共培養(transwell培養系統)及傳代(見圖3和圖6)

按照圖3，將上述絲裂酶素c處理或放射線照射的飼養細胞置于transwell筐(transwellinsert，corning公司)中，分離制備的原代細胞懸液或者傳代細胞可直接于hl培養基中進行培養，培養條件是37℃、5％co2。當細胞增殖至70－90％豐度時，先移去transwell筐，1xpbs洗滌上皮細胞兩次，0.05％胰酶/edta消化單層細胞2－5分鐘，10ml完全的dmem中和消化反應，1000rpm離心5分鐘，去上清，以一定比例(1:2,1:3,1:4,1:5均可，只要可以維持細胞貼壁和正常生長)重懸細胞沉淀于10mlhl培養基中接種培養。必要時可將1x10⁶上皮細胞重懸于1－2ml的細胞凍存液(90％胎牛血清和10％dmso)中,儲存于液氮中備用。

實施例10.含血清培養基和無血清培養基用于上皮細胞的培養(見圖5)

完全的dmem培養基：dmem,10％胎牛血清(fbs),100u/ml青霉素(penicillin)和100μg/ml鏈霉素(streptomycin)

無血清培養基：無血清的上皮細胞培養基sfm(gibco#10744-019)，慶大霉素(10μg/ml)

胰酶消化液:0.05％胰酶/edta

無鈣鎂磷酸緩沖液：ca²⁺,mg²⁺freepbs

分離制備的原代細胞懸液或者傳代細胞直接于上述完全dmem培養基或無血清培養基中進行培養，培養條件是37℃、5％co2。當細胞增殖至70－90％豐度時，1xpbs洗滌細胞兩次，0.05％胰酶/edta消化單層細胞2－5分鐘，10ml完全的dmem培養基中和消化反應，1000rmp離心5分鐘，去上清，以一定比例(通常是1:2或1:3)重懸細胞沉淀于10ml完全dmem或無血清培養基中培養。必要時可將1x10⁶細胞重懸于1－2ml的細胞凍存液(90％胎牛血清和10％dmso)中,儲存于液氮中備用。

還需要說明的是，在可實施且不明顯違背本發明的主旨的前提下，在本說明書中作為某一技術方案的構成部分所描述的任一技術特征或技術特征的組合同樣也可以適用于其它技術方案；并且，在可實施且不明顯違背本發明的主旨的前提下，作為不同技術方案的構成部分所描述的技術特征之間也可以以任意方式進行組合，來構成其它技術方案。本發明也包含在上述情況下通過組合而得到的技術方案，并且這些技術方案相當于記載在本說明書中。

以上通過具體實施方式和實施例對本發明進行了說明，但本領域技術人員應該理解的是，這些并非意圖對本發明的范圍進行限定，本發明的范圍應由權利要求書確定。

工業實用性

本發明的培養基、細胞培養用試劑盒、上皮細胞培養方法以及通過該方法獲得的上皮細胞可以廣泛應用于基礎細胞生物學研究、腫瘤研究、衰老研究、新藥研發、基因治療、體外轉基因和基因敲除研究、組織再生、臨床再生醫學、臨床個性化治療、分子及遺傳流行病學研究等各個領域。