本發(fā)明屬于作物分子育種領(lǐng)域，具體涉及一種調(diào)控玉米單穗重主效qtl的分子標(biāo)記，本發(fā)明還涉及一種輔助選擇玉米單穗重的方法；本發(fā)明還涉及一種調(diào)控玉米單穗重主效qtl的分子標(biāo)記在玉米高產(chǎn)育種中的應(yīng)用方法。

技術(shù)背景

玉米不僅是全球第一大糧食作物，同時也是重要的飼料、工業(yè)原料和能源作物，并在保障全球糧食安全生產(chǎn)中扮演著重要角色。張世煌等(2008)估計到2020年，中國玉米產(chǎn)量必須在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上提高31％時才能滿足人民的需求，因此玉米高產(chǎn)育種一直是學(xué)者和育種家追求的首要育種目標(biāo)。另外，干旱是限制玉米生產(chǎn)安全最為重要的非生物逆境脅迫之一，一般可使玉米減產(chǎn)20～30％，嚴(yán)重時可達50％以上，選育強抗旱性玉米新品種已成為玉米生產(chǎn)中亟待解決的難題。玉米單穗重是由穗長、百粒重、行粒數(shù)、穗粗等構(gòu)成，其不僅是衡量玉米產(chǎn)量最直觀和最重要的農(nóng)藝性狀，也是重要的抗旱性鑒定性狀。因此，干旱環(huán)境下深入剖析玉米單穗重的遺傳機制對玉米高產(chǎn)、抗旱育種具有重大意義。

單穗重是由多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，且易受環(huán)境影響，研究較為困難。因此，借助分子標(biāo)記技術(shù)深入剖析單穗重的遺傳機制，對玉米產(chǎn)量的遺傳改良及育種應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。自helentjaris等(1986)繪制首張玉米遺傳連鎖圖譜以來，國內(nèi)外學(xué)者對玉米產(chǎn)量相關(guān)性狀qtl定位已有大量報道。目前，在玉米基因組數(shù)據(jù)庫(maizegdb)中已收錄1000多個產(chǎn)量相關(guān)性狀qtl，其在玉米10個連鎖群中呈非均勻分布，但由于受定位群體親本種質(zhì)類型、定位群體類型(f2:3、bc、ril)、所用遺傳連鎖圖譜精度(一般>200個標(biāo)記)及定位群體檢測環(huán)境等方面的限制，對玉米單穗重qtl檢測結(jié)果并無一致結(jié)果。因此，挖掘不同遺傳背景下，在多環(huán)境都穩(wěn)定表達的主效單穗重qtl位點對分子標(biāo)記輔助選擇(mas)育種具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種調(diào)控玉米單穗重主效qtl的分子標(biāo)記；本發(fā)明還提供一種輔助選擇玉米單穗重的方法；本發(fā)明還提供一種調(diào)控玉米單穗重主效qtl的分子標(biāo)記在玉米高產(chǎn)育種中的應(yīng)用方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種調(diào)控玉米單穗重主效qtl的分子標(biāo)記；由umc1120和umc2134兩對標(biāo)記組成，所述分子標(biāo)記umc1120的序列為：

forward:5’-gcacagctttgtccctcgaa-3’；

reverse:5’-gaccctcgagcttctctcatcttt-3’；

所述分子標(biāo)記umc2134的序列為：

forward:5’-tagtctagcgtcgacgaaaaatgc-3’；

reverse:5’-caggcgacgaagatgaattgaa-3’。

一種輔助選擇玉米單穗重的方法，包括如下步驟：提取待測玉米的基因組dna，用本發(fā)明提供的引物umc1120和umc2134進行pcr擴增，當(dāng)?shù)玫介L度為338bp和234bp的擴增產(chǎn)物，則待測玉米為候選大穗型玉米。

一種調(diào)控玉米單穗重主效qtl的分子標(biāo)記在玉米高產(chǎn)育種中的應(yīng)用方法，其特征在于：用本發(fā)明提供的輔助選擇玉米單穗重的方法選擇出候選大穗型玉米，將候選大穗型玉米應(yīng)用于玉米高產(chǎn)育種中。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明通過在多個水分環(huán)境下對兩套f2:3群體單穗重qtl分析，發(fā)現(xiàn)在玉米第九染色體bin9.04-9.05處存在一個調(diào)控玉米單穗重的主效qtl，累積貢獻率為57.51％。分析表明該標(biāo)記的有無不僅直接關(guān)系到玉米單穗重的大小，而且能夠用于玉米種質(zhì)材料單穗重大小的預(yù)測。

通過本發(fā)明公布的分子標(biāo)記進行分子標(biāo)記輔助選擇，只需檢測分子標(biāo)記的特征擴增條帶，即可預(yù)測玉米單穗重的大小，此鑒定方法簡單可行、選擇效率高。可在玉米生育早期鑒定出大穗型的玉米單株，淘汰其它單株，選擇目標(biāo)明確，且不受環(huán)境影響，有針對性地組配高產(chǎn)玉米雜交組合。

附圖說明

圖1所示為親本(廊黃、昌7-2、ts141)果穗的形態(tài)特征；

圖2所示為不同水分處理下親本(廊黃、昌7-2、ts141)及f2:3群體(pop1、pop2)的單穗重；

圖3是不同水分處理下pop1單穗重的頻率分布圖；

圖4是不同水分處理下pop2單穗重的頻率分布圖；

圖5是不同水分處理下pop1單穗重主效qtl定位示意圖；

圖6是不同水分處理下pop2單穗重主效qtl定位示意圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，下述實施例中試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)試驗方法，下述實施例中所述的實驗試劑及耗材如無特殊說明，均來自常規(guī)生化試劑公司。

本實施例中，獲得調(diào)控玉米單穗重主效qtl的分子標(biāo)記的詳細(xì)步驟如下：

1.玉米f2:3群體構(gòu)建及單穗重的測定

以本課題組前期篩選獲得的小穗型自交系廊黃、昌7-2為母本，以大穗型自交系ts141為共同父本(圖1)，2011年4月中旬于平?jīng)?35.43°n，106.93°e；1204m)組配2個f1雜交組合分別為廊黃×ts141和昌7-2×ts141，次年4月中旬在同地種植2個f1代，讓其自交獲得相應(yīng)的f2分離群體。來年分別種植f2所有單株自交獲得f2:3群體，其中廊黃與ts141構(gòu)建的f2:3群體以下簡稱pop1，包含202個株系；昌7-2與ts141構(gòu)建的f2:3群體以下簡稱pop2，包含218個株系。2014年4月中旬于武威(37.97°n，102.63°e；1508m)和張掖(38.83°n，106.93°e；1536m)種植pop1及相應(yīng)親本。2015年4月中旬于古浪(36.67°n，102.85°e；1785m)和景泰(37.18°n，104.03°e；1640m)種植pop2及相應(yīng)親本。兩套f2:3群體在四個試驗點都分別進行干旱脅迫和正常供水處理，采用平膜滴灌技術(shù)，按完全隨機區(qū)組設(shè)計，三次重復(fù)，雙行區(qū)，行長6.0m，株距0.5m，行距0.6m。干旱脅迫處理在大喇叭口期前到花期結(jié)束進行不灌水，其它時期每隔20d灌水一次。正常供水處理在玉米生長過程中缺水時及時灌水。9月底玉米成熟后收獲，等果穗風(fēng)干后每一株系中選擇均勻10穗進行室內(nèi)考種，涉及的穗部性狀包括單穗重(ew)、穗長(el)、百粒重(kw)、穗軸重(cw)等，其中單穗重的分布圖見圖2。根據(jù)公式：

計算廣義遺傳力h²，式中：為基因型方差，為基因型與環(huán)境互作方差，σ²為誤差，n(n＝2)為環(huán)境個數(shù)，r(r＝10)為重復(fù)數(shù)。

由圖2可知：在不同水分處理下廊黃、昌7-2、ts141、pop1及pop2的單穗重平均分別為77.58g、56.88g、105.90g、149.73g及106.88g，且彼此間差異顯著；由圖3和圖4可知：不同水分處理下，構(gòu)建的兩套f2:3群體的單穗重呈典型的正態(tài)分布，且單穗重的廣義遺傳力較大，表明單穗重是受多基因控制的數(shù)量性狀。

2.ssr標(biāo)記設(shè)計及其多態(tài)性篩選

在玉米基因組數(shù)據(jù)庫maizegdb網(wǎng)站(http://www.maizegdb.org/)選擇均勻分布于玉米10條染色體的ssr標(biāo)記872對，上海sangon合成。采用ctab法提取親本廊黃、昌7-2、ts141基因組dna，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測dna質(zhì)量，用德國implen微量分光光度儀檢測dna濃度。pcr反應(yīng)體系見表1，pcr擴增反應(yīng)程序見表2，擴增產(chǎn)物用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染。

經(jīng)分析，在親本廊黃與ts141間篩選出213對條帶清晰、多態(tài)性好的ssr標(biāo)記，在親本昌7-2與ts141間篩選出217對條帶清晰、多態(tài)性好的ssr標(biāo)記。這些多態(tài)性ssr標(biāo)記將用于兩套f2分離群體基因型分析，并構(gòu)建相應(yīng)的遺傳連鎖圖譜。

表1pcr反應(yīng)體系

3.遺傳連鎖圖譜構(gòu)建

利用上述構(gòu)建的兩套f2分離群體及上述篩選出的相應(yīng)的多態(tài)性ssr標(biāo)記，對兩套相應(yīng)的f2分離群體進行基因型分析，并采用joinmap4.0軟件(http://www.kyazma.nl/index.php/mc.joinmap/sc.evaluate/)構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，利用kosambi函數(shù)計算遺傳距離(cm)。

表2pcr擴增反應(yīng)程序

經(jīng)分析，構(gòu)建的兩套遺傳連鎖圖譜分別各包含199和205對ssr標(biāo)記，覆蓋了玉米的10個連鎖群，總遺傳距離為1542.5和1648.8cm，分子標(biāo)記間平均遺傳距離為7.8和8.0cm。兩套遺傳圖譜與ibm22008neighborsframe6(http://www.maizegdb.org/data_center/map)相比，標(biāo)記在參考圖譜上的相對順序高度一致。

4.單穗重主效qtl定位

根據(jù)兩套f2:3群體在不同水分處理下的單穗重，采用windowsqtlcartographerversion2.5軟件(http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/wqtlcart.htm)中的cim法檢測相應(yīng)的f2:3群體的單穗重qtl。就cim而言，采用zmapqtl程序模塊model6,窗口大小為10.0cm，每隔0.5cm對葉夾角進行基因型掃描，通過1000次抽樣確定lod閾值(lod>3.0)。根據(jù)顯性效應(yīng)(d)與加性效應(yīng)(a)之比的絕對值來估計qtl作用方式(stuberetal.1987)：|d/a|＝0.00～0.20為加性(a)，|d/a|＝0.21～0.80為部分顯性(pd)，|d/a|＝0.81～1.20為顯性(d)，|d/a|>1.20為超顯性(od)。qtl命名參照mccouchetal.(1997)的命名方法，即q+性狀名稱縮寫+染色體名稱+qtl在染色體上序號。pop1和pop2單穗重主效qtl檢測結(jié)果見表3。

經(jīng)cim分析表明，由表3、圖5和圖6可知，在兩套f2:3群體的多個水分處理下都檢測到了一個單穗重qtl為命名為qew-ch.9-1，位于第九染色體bin9.04-9.05處，介于標(biāo)記umc1120與umc2134之間，基因的作用方式都為超顯性(od)效應(yīng)，增大單穗重的等位基因均來源于大穗型自交系ts141。在pop1中該qtl的累積表型貢獻率為24.79％，遺傳距離為9.5cm。在pop2中該qtl的累積表型貢獻率為32.74％，遺傳距離為7.6cm。表明qew-ch.9-1為調(diào)控玉米單穗重的主效qtl，且與抗旱性密切相關(guān)，該qtl增大單穗重的等位基因來源于ts141，因此可用于對玉米單穗重大小進行預(yù)測，但由于該qtl的基因作用方式為超顯性，因此在組配雜交種時要特別注意雜種優(yōu)勢對果穗大小的影響。目標(biāo)主效qtl區(qū)間的兩對ssr標(biāo)記(見表3)由patentinversion3.5軟件生成相應(yīng)的引物序列表，該序列表見說明書核苷酸和氨基酸序列表。

表3兩套f2:3群體單穗重主效qtl檢測

上述調(diào)控玉米單穗重主效qtl的分子標(biāo)記，由umc1120和umc2134兩對ssr標(biāo)記組成，其中分子標(biāo)記umc1120的序列為：

forward:5’-gcacagctttgtccctcgaa-3’；

reverse:5’-gaccctcgagcttctctcatcttt-3’；

所述分子標(biāo)記umc2134的序列為：

forward:5’-tagtctagcgtcgacgaaaaatgc-3’；

reverse:5’-caggcgacgaagatgaattgaa-3’。

利用上述調(diào)控玉米單穗重主效qtl的分子標(biāo)記輔助選擇單穗重大小的玉米方法包括：提取待測玉米基因組dna，用分子標(biāo)記lumc1120和umc2134進行pcr擴增，當(dāng)?shù)玫介L度為308bp和234bp的擴增產(chǎn)物，則待測玉米為候選大穗型玉米單株，淘汰其它單株，選擇目標(biāo)明確，且不受環(huán)境影響，有針對性地組配高產(chǎn)玉米雜交組合，進而提高育種進步及效率。

序列表

sequencelisting

<110>甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>調(diào)控玉米單穗重主效qtl的分子標(biāo)記及其應(yīng)用

<130>2017

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>玉米屬玉米（zeamaysl.)

<400>1

gcacagctttgtccctcgaa20

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>玉米屬玉米（zeamaysl.）

<400>2

gaccctcgagcttctctcatcttt24

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>玉米屬玉米（zeamaysl.）

<400>3

tagtctagcgtcgacgaaaaatgc24

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>玉米屬玉米（zeamaysl.）

<400>4

caggcgacgaagatgaattgaa22

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