本發明屬于生物工程領域，特別涉及一株高產琥珀酸的基因工程菌及其構建方法與應用。

背景技術：

琥珀酸，又名丁二酸，是三羧酸循環(tca)的中間產物，同時也是許多厭氧微生物能量代謝的主要末端產物。作為一種優秀的c4平臺化合物，琥珀酸具有重要的應用價值，廣泛應用于食品、醫藥、染料、香料、油漆、塑料等行業，同時也可合成一些重要的化工產品如丁二醇、四氫呋喃、γ-丁內酯、2-吡咯烷酮等；另外，琥珀酸還可用來合成可降解的生物聚合物，如聚丁烯琥珀酸酯(pbs)和聚酰胺。

微生物法生產丁二酸具有高效率和環保性等特點，因而被廣泛研究。在琥珀酸生產菌株中，大腸桿菌由于其遺傳背景清楚，易操作易調控，培養基要求簡單等優點，近年來被廣泛用于研究以獲得高產琥珀酸生產菌株。目前，利用重組e.coli發酵產琥珀酸發酵模式主要包括有氧發酵、有氧-厭氧兩階段發酵以及一步厭氧發酵三種模式。與其他兩種相比，采用一步厭氧發酵時，琥珀酸的比生產強度及理論最大收率均高于其它兩種模式，并且可全過程固定co2。然而目前生產菌株的琥珀酸收率僅為80％左右，遠低于理論收率113％。這是由于在厭氧合成琥珀酸的代謝過程中，1mol葡萄糖經糖酵解至c3產生2mol的nadh，而從c3至形成2mol琥珀酸需要消耗4mol的nadh，還原力不足是厭氧條件下琥珀酸收率較低的主要原因。此外，生物法制備琥珀酸主要是以糖類作為碳源，但這些糖類物質的成本較高，限制了微生物法制備丁二酸的工業化。因此，若能以廉價的還原性底物為原料，不僅能有效提高還原力的供給，還能在一定程度上降低成本。

甲醇是煤化工產業中的重要產品，近年來，隨著甲醇生產工藝的發展，使得甲醇的價格持續走低，因而利用甲醇作為發酵原料成為生物轉化過程降低成本的重要突破口。此外，在甲醇利用的磷酸核酮糖循環途徑中每同化一分子甲醇即可產生一分子nadh，因而可以為琥珀酸的合成提供足夠的還原力，進而提高代謝速率，增加產物的濃度。因此，若能通過合成生物學手段，將甲醇代謝模塊引入大腸桿菌中，以葡萄糖和甲醇作為共同碳源，可在細胞水平上增強還原力的供給，驅動琥珀酸的高效合成。

技術方案

本發明要解決的技術問題是提供一種利用合成生物學方法構建可以利用甲醇作為碳源進行代謝的菌株，并利用該菌株厭氧發酵生產琥珀酸，解決了傳統發酵存在的琥珀酸收率低的技術問題。

為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：

一株高產琥珀酸的基因工程菌，它是在宿主菌中導入甲醇脫氫酶基因mdh2、3-己糖-6-磷酸合酶基因hps和3-己糖-6-磷酸異構酶基因phi；其中甲醇脫氫酶基因mdh2將甲醇氧化成甲醛，并產生nadh，甲醛和核酮糖-5磷酸在3-己糖-6-磷酸合酶基因hps的催化下轉化成己糖-6-磷酸，隨后己糖-6-磷酸在3-己糖-6-磷酸異構酶基因phi的催化下異構成果糖-6-磷酸，進而進入糖酵解途徑參與物質循環和能力代謝。

其中，所述的宿主菌為大腸桿菌e.colibl21或大腸桿菌cctccno:m2012351，優選大腸桿菌cctccno:m2012351。本發明中使用的大腸埃希氏菌(escherichiacoli)ber208的保藏日期為2012年09月14日，保藏單位全稱為中國典型培養物保藏中心，簡稱cctcc，地址為：中國.武漢.武漢大學，其保藏編號為cctccno:m2012351，其具體信息已經在申請號為201210392035.5的中國專利中詳細公開。

其中，所述甲醇脫氫酶基因mdh2來源于甲醇芽孢桿菌bacillusmethanolicus，其基因序列如seqidno:3所示。

其中，所述3-己糖-6-磷酸合酶基因hps來源于枯草芽孢桿菌bacillussubtilis168，其genbank登記號為cab12140.1。

其中，所述3-己糖-6-磷酸異構酶基因phi來源于枯草芽孢桿菌bacillussubtilis168，其genbank登記號為cab12139.1。

上述高產琥珀酸的基因工程菌的構建方法，包括如下步驟：

(1)將seqidno:3和seqidno:8所示的序列克隆至表達載體中，得到重組質粒；

(2)將步驟(1)得到的重組質粒轉化至宿主細胞中，得到高產琥珀酸的基因工程菌。

優選，所述表達載體為optptrc99a。

優選，所述宿主菌為大腸桿菌cctccno:m212315。

具體的構建方法如下：

(1s)以表達載體ptrc99a為模板，設計具有一系列同尾酶酶切位點的一對引物，將pcr產物自連，獲得符合biobrick標準的表達載體optptrc99a；

(2s)利用基因合成的方法合成甲醇芽孢桿菌bacillusmethanolicus來源的甲醇脫氫酶基因mdh2(seqidno:3)，并對其進行密碼子優化；設計引物，將其連接到表達載體optptrc99a中，構建質粒optptrc99a-mdh2；

(3s)以枯草芽孢桿菌bacillussubtilis168基因組為模板，設計引物擴增3-己糖-6-磷酸合酶基因hps和3-己糖-6-磷酸異構酶基因phi，將其連接到質粒optptrc99a，構建質粒optptrc99a-si；

(4s)對質粒optptrc99a-mdh2進行nhei、sali雙酶切，質粒optptrc99a-si進行avrii、sali雙酶切，將酶切后的片段做t4連接，轉化至e.colidh5α中，經質粒酶切和菌落pcr驗證，獲得optptrc99a-msi。

(5s)將質粒optptrc99a-msi和optptrc99a分別導入到實驗室自主優化的大腸桿菌ber208中，獲得重組大腸桿菌ber308和重組大腸桿菌ber408，以實現基因的同時表達，進而實現甲醇的代謝，以大腸桿菌ber308作為對照菌株進行發酵性能考察。

上述高產琥珀酸的基因工程菌在發酵產琥珀酸中的應用。

優選地，發酵產琥珀酸包括以下步驟：

(1a)種子培養：將高產琥珀酸的基因工程菌接種到種子培養基中，培養10～12h，獲得種子培養液；

(2a)發酵產琥珀酸：將種子培養液接種到發酵培養基中，培養至od550＝0.8～1.2，添加終濃度為0.1mm的誘導劑iptg和終濃度為200mm的甲醇，再厭氧發酵培養時間為48h。

優選地，所述種子培養基為nbs培養基，其配方如下：甜菜堿0.12g/l，三水磷酸氫二鉀6.54g/l，磷酸二氫鉀3.5g/l，磷酸氫二銨3.5g/l，七水硫酸鎂0.25g/l，二水氯化鈣15.0mg/l，維生素b10.5mg/l，六水氯化鐵1.6mg/l，六水氯化鈷0.2mg/l，二水氯化銅0.1mg/l，四水氯化鋅0.2mg/l，二水鉬酸鈉0.2mg/l，硼酸0.05mg/l，葡萄糖30g/l，溶劑為水。

優選地，所述發酵培養基的配方如下：磷酸二氫銨0.87g/l，磷酸氫二銨2.6g/l，氯化鉀0.15g/l，七水硫酸鎂0.37g/l，六水氯化鐵2.4mg/l，六水氯化鈷0.3mg/l，二水氯化銅0.15mg/l，四水氯化鋅0.5mg/l，二水鉬酸鈉0.5mg/l，硼酸0.075mg/l，四水氯化錳0.5mg/l，葡萄糖30g/l，溶劑為水。

具體的種子液培養過程如下：將重組大腸桿菌ber208/optptrc99a-msi按1～2％(v/v)接種量從凍存管接種到種子培養基中，100ml三角瓶裝液量20ml，35～37℃有氧培養10～12h，獲得種子培養液。

搖瓶發酵產琥珀酸具體過程如下：將種子培養液按10％(v/v)接種到發酵培養基中，37℃，200rpm培養至od550＝1.0，添加終濃度為0.1mm的誘導劑iptg和200mm的甲醇，充二氧化碳3～5min，發酵溫度37℃，發酵培養時間為48h。

發酵罐中發酵生產琥珀酸的具體過程如下：將種子培養液接種到裝有1.5l發酵培養基的3l發酵罐中，接種量10％(v/v)，初始葡萄糖100g/l，連續通入二氧化碳，發酵溫度37℃，至od550＝1.0時添加終濃度為0.1mm的iptg和200mm的甲醇，連續通入二氧化碳，發酵溫度37℃，發酵培養時間為106h。

有益效果：

通過本發明的方法可實現大腸桿菌以非食品級原料甲醇作為輔助碳源生產琥珀酸，并為琥珀酸的生物合成提供充足的還原力，不僅可提高琥珀酸的產量和收率，還在一定程度上降低了生產成本，具有重大的社會意義和經濟價值。

附圖說明：

圖1重組質粒optptrc99a-msi構建圖。

圖2原始菌和重組菌在3l發酵罐中原料消耗趨勢圖。

圖3原始菌和重組菌在3l發酵罐中產物合成趨勢圖。

圖4不同甲醇濃度下，重組菌株的生長和產酸情況。

具體實施方式

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。

ptrc99a載體：本實驗室自主保存。

大腸桿菌ber208保藏日期為2012年09月14日，保藏單位全稱為中國典型培養物保藏中心，簡稱cctcc，地址為：中國.武漢.武漢大學，其保藏編號為cctccno:m2012351，其具體信息已經在申請號為201210392035.5的中國專利中詳細公開。

實施例1：表達載體optptrc99a的獲得

為了能夠快速有效的實現多基因的表達，本實施方式根據biobrick標準設計一對引物p1(seqidno.1)、p2(seqidno.2)，以載體optptrc99apcr為模板，將擴增獲得的片段做t4連接，導入e.colidh5α后篩選獲得優化后的表達載體optptrc99a。實施例2：利用合成生物學方法構建重組大腸桿菌ber208-optptrc99a-msi。

1、甲醇脫氫酶mdh2來源于甲醇芽孢桿菌bacillusmethanolicus，并根據大腸桿菌密碼子偏好性對基因進行密碼子優化，其優化后的核苷酸序列如seqidno.3所示，送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行基因合成,。

2、根據人工合成獲得密碼子優化的甲醇脫氫酶基因，設計上游引物p3(seqidno.4)、下游引物p4(seqidno.5)，經pcr擴增后利用onestepcloningkit(vazyme,c112-02)連接到表達載體optptrc99a上，轉化至e.colidh5α中，經質粒酶切和菌落pcr驗證，獲得質粒optptrc99a-mdh2。

3、3-己糖-6-磷酸合酶(hps)和3-己糖-6-磷酸異構酶(phi)總是相輔相成的，兩者的表達與作用會相互影響，而且兩者的基因也緊鄰，因此本實施方式將二者作為一個整體來設計引物。根據ncbi上公布的基因序列，設計上游引物p5(seqidno.6)、下游引物p6(seqidno.7)，以枯草芽孢桿菌bacillussubtilis168基因組為模板，pcr擴增得到目的基因，其核苷酸序列如seqidno.8所示。利用onestepcloningkit(vazyme,c112-02)將pcr產物連接到表達載體optptrc99a上，轉化至e.colidh5α中，經質粒酶切和菌落pcr驗證，獲得質粒optptrc99a-si。

4、對質粒optptrc99a-mdh2進行nhei、sali雙酶切，質粒optptrc99a-si進行avrii、sali雙酶切，將酶切后的片段做t4連接，轉化至e.colidh5α中，經質粒酶切和菌落pcr驗證，獲得optptrc99a-msi。

5、將optptrc99a-msi導入大腸桿菌ber208中，經質粒酶切和菌落pcr驗證，獲得重組大腸桿菌ber208/optptrc99a-msi(大腸桿菌ber308)。

實施例3：重組菌株的發酵實驗。

1.種子培養：將重組大腸桿菌ber308按1～2％(v/v)接種量從凍存管接種到種子培養基中，100ml三角瓶裝液量20ml，35～37℃有氧培養10～12h，獲得種子培養液。

2.發酵產琥珀酸：將種子培養液按10％(v/v)接種到發酵培養基中，37℃，200rpm培養至od550＝1.0，添加終濃度為0.1mm的誘導劑iptg和200mm的甲醇，充二氧化碳3～5min，發酵溫度37℃，發酵培養時間為48h。

3.重組大腸桿菌ber308在3l發酵罐中生產琥珀酸：將種子培養液接種到裝有1.5l發酵培養基的3l發酵罐中，接種量10％(v/v)，初始葡萄糖100g/l，連續通入二氧化碳，發酵溫度37℃，至od550＝1.0時添加終濃度為0.1mm的iptg和200mm的甲醇，連續通入二氧化碳，發酵溫度37℃，發酵培養106h，發酵結果如圖2和圖3所示。結果表明，重組大腸桿菌ber308的甲醇消耗量、琥珀酸產量和收率為25mm、68.7g/l和0.976g/g，分別是對照菌株大腸桿菌ber208的1.92倍、1.12和1.08倍。

實施例4：重組菌株的甲醇耐受實驗。

1.種子培養：將大腸桿菌ber308、大腸桿菌ber208按1～2％(v/v)接種量從凍存管分別接種到種子培養基中，100ml三角瓶裝液量20ml，35～37℃有氧培養10～12h，獲得種子培養液。

2.發酵產琥珀酸：將種子培養液按10％(v/v)接種到發酵培養基中，37℃，200rpm培養至od550＝1.0，添加終濃度為0.1mm的誘導劑iptg和不同濃度的甲醇，充二氧化碳3～5min，發酵溫度37℃，發酵培養時間為48h。結果如圖4所示，在不同甲醇濃度條件下，表達甲醇代謝途徑的重組大腸桿菌ber308的最大細胞密度和琥珀酸產量都明顯高于對照菌株，并具有較好的甲醇耐受性，即使甲醇濃度達到600mm，菌體仍具有良好的生長性能。

sequencelisting

<110>南京工業大學

<120>一株高產琥珀酸的基因工程菌及其構建方法與應用

<130>sg20170607001

<160>8

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>110

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>p1

<400>1

cgggatcccatggtctgtttcctgtgtctagaaattgttatccgctcacaattccacaca60

ttatacgagccggatgattaattgtcaacctaggatttcagaatatttgc110

<210>2

<211>137

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>p2

<400>2

gaagatctggtaccactagtcaaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttc60

gttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaatgctagcgtcgacg120

atttgaacgttgcgaag137

<210>3

<211>1158

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>甲醇脫氫酶基因

<400>3

atgaccaatacccagagcgcctttttcatgccgagcgtgaacttattcggcgccggcagc60

gtgaacgaagttggtacccgtctggcagatctgggtgtgaaaaaagccctgctggtgaca120

gatgcaggcctgcatggcttaggcctgagcgaaaagatcagcagcatcattcgtgccgcc180

ggtgttgaagtgagcatctttccgaaggccgaacctaatcctaccgacaagaatgtggcc240

gagggcctggaagcatacaatgcagaaaactgcgatagtatcgtgaccctgggtggtggt300

agcagccacgatgccggtaaagcaatcgccctggtggcagccaacggtggcaagattcac360

gactatgagggcgtggatgtgagcaaagagccgatggttccgctgattgccattaacacc420

accgcaggcaccggtagtgaactgaccaagttcaccatcatcaccgacaccgagcgcaaa480

gtgaaaatggccatcgtggacaagcacgtgaccccgaccctgagcattaacgatcctgag540

ctgatggttggcatgccgccgagtctgaccgcagccaccggtttagatgcactgacccat600

gccatcgaagcctatgtgagcaccggcgcaaccccgatcaccgatgcactggcaattcag660

gccattaagattatcagtaaatatctgccgcgtgcagttgccaatggcaaagatatcgaa720

gcccgcgaacagatggcattcgcccagagtctggccggtatggccttcaataacgcaggc780

ctgggctatgttcatgcaatcgcacatcagctgggcggcttctataactttccgcacggc840

gtttgcaatgccgtgctgctgccgtacgtgtgccgttttaacctgatcagcaaagttgaa900

cgctatgccgaaatcgccgccttcctgggtgaaaacgtggatggcctgagcacctatgat960

gcagcagagaaagccatcaaggccattgagcgcatggccaaggacctgaatatccctaaa1020

ggcttcaaagagctgggcgccaaagaagaggacattgagacactggccaagaacgccatg1080

aaggatgcctgcgccctgacaaatccgcgcaaaccgaaactggaagaggttatccagatt1140

atcaaaaatgccatgtaa1158

<210>4

<211>43

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>p4

<400>4

gacacaggaaacagaccatggtgaccaatacccagagcgcctt43

<210>5

<211>48

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>p5

<400>5

ctttcgttttatttgactagtttacatggcatttttgataatctggat48

<210>6

<211>43

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>p6

<400>6

gacacaggaaacagaccatggaattacagcttgcattagacct43

<210>7

<211>43

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>p7

<400>7

ctttcgttttatttgactagtctattcaaggtttgcgtggtga43

<210>8

<211>1196

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>3-己糖-6-磷酸合酶j基因和3-己糖-6-磷酸異構酶基因序列

<400>8

atggaattacagcttgcattagacctcgtcaacatcccggaagccattgagcttgtcaaa60

gaggtagaacaatacatcgacgtagttgaaatcggaacaccggtcgtcatcaatgaaggc120

ctaagagccgttaaagaaataaaagaagcatttcctcaattgaaggttcttgcagacctg180

aaaatcatggatgccggaggctacgaaattatgaaagcgtcggaagcaggcgctgacatc240

atcaccgttttaggggctacagacgatgcaacgattaaaggcgcagtagaagaagccaaa300

aaacaaaagaagaaaatcttagtggacatgattaacgtgaaagatatcgaatcccgtgcg360

aaagaaattgacgcactcggtgttgactacatctgcgtccacactggctatgatcttcaa420

gcagagggcaaaaactctttcgaagaattaacgacaatcaaaaataccgtaaaaaacgca480

aaaaccgcaatcgcgggcggcatcaaacttgatacactgccagaagtgatccagcaaaag540

cctgaccttgtcattgtcgggggcggaattacaagcgcagctgataaggcggaaacagct600

tcaaaaatgaagcagctgattgtccaaggataactccgatgaaaacgactgaatacgtag660

cggaaattctcaatgagttacacaattcagcagcttatatttctaatgaagaagctgacc720

agcttgccgatcacattctttcatcccaccaaattttcaccgcgggtgcggggcggtctg780

gcctgatggcaaaatccttcgcgatgagactgatgcacatgggcttcaacgcccatatag840

taggtgagattctcactccgccgctcgccgaaggagatctagttattatcggctcaggat900

caggcgagacaaagagcttgattcataccgcagcaaaagcaaaaagcttacacggaattg960

ttgccgctttaaccatcaatccggaatcaagcatcggaaaacaagcggacctcatcatca1020

gaatgcctggttcccctaaagaccagtctaacggaagctataaaaccattcagccaatgg1080

gatcattatttgaacaaactttgctgctcttctatgatgcagtgattttaaaactcatgg1140

agaaaaaaggtctcgattctgaaactatgttcactcaccacgcaaaccttgaatag1196