本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)精深加工領(lǐng)域，具體涉及一種具有改善記憶功效的多肽及其分離制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

研究表明，記憶的下降或退化與大腦海馬區(qū)病變、神經(jīng)遞質(zhì)減少以及突觸病變等有關(guān)。此外，發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem，cns)的氧化應(yīng)激會(huì)隨著年齡的增加而增加，從而導(dǎo)致許多與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的產(chǎn)生，如阿爾茨海默病、帕金森病、癡呆、多發(fā)性硬化癥等疾病。預(yù)計(jì)，在2050年前患者數(shù)將增加到1.15億。

人類大腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)-乙酰膽堿的缺失是導(dǎo)致記憶損傷的重要因素之一。乙酰膽堿是人類神經(jīng)細(xì)胞中重要的神經(jīng)遞質(zhì)，它能夠在突觸間進(jìn)行神經(jīng)信號(hào)的傳遞。但乙酰膽堿會(huì)被膽堿酯酶(cholinesterase,che)降解，過度的乙酰膽堿降解會(huì)導(dǎo)致乙酰膽堿含量降低，從而造成神經(jīng)信號(hào)傳遞的失敗，導(dǎo)致記憶損傷。

目前，已經(jīng)有許多乙酰膽堿酯酶抑制劑被列為研究對(duì)象。但某些抑制劑中，毒扁豆堿(physostigmine)及塔克林(tacrine)因貨架期短及肝毒性等副作用，而逐漸從市場(chǎng)上消失。因而安全無副作用的乙酰膽堿酯酶抑制劑的研究吸引了人們的注意。對(duì)于天然、安全無副作用的乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選逐漸吸引了許多研究者的目光。

學(xué)者們對(duì)多種天然物質(zhì)的酰膽堿酯酶抑制活性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，其中包括天然產(chǎn)物提取物、卵磷脂、多不飽和脂肪酸以及肽類物質(zhì)等。天然產(chǎn)物提取物因成分復(fù)雜，可能存在試劑殘留等危害；卵磷脂、多不飽和脂肪酸因價(jià)格昂貴、提取工藝復(fù)雜而難以大范圍推廣。而肽類物質(zhì)，具有來源廣泛、制備工藝簡單、無副作用等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為研究熱點(diǎn)。

蛋白質(zhì)和肽類物質(zhì)具有維持腦細(xì)胞代謝，保持大腦的各種運(yùn)動(dòng)正常進(jìn)行的功能。其中天然存在于哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的內(nèi)源多肽約有200種，例如生長抑素(somatostatin，ss)、促皮質(zhì)激素釋放因子(corticotropinreleasingfactor，crf)、加壓素(vasopressin，vp)、催乳素(prolactin，prl)、腦啡肽(enkephalin)、內(nèi)啡肽(eindorphin)等已被證實(shí)對(duì)記憶具有調(diào)節(jié)作用。

目前也有很多學(xué)者采用生物酶解技術(shù)從植物或者動(dòng)物組織中制備得到具有改善記憶的多肽。腦活素則是由豬腦水解后得到的含有85％游離氨基酸和15％低分子多肽的復(fù)合酶解產(chǎn)物，研究表明其具有改善記憶、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用，可以改善腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)和相關(guān)酶的活性。

目前的研究多集中于混合物的記憶功效增強(qiáng)或者合成改善記憶肽序列的公開，評(píng)價(jià)手段多采用動(dòng)物行為學(xué)，改善記憶多肽純品制備困難，評(píng)價(jià)指標(biāo)過程繁瑣，且很少采用乙酰膽堿酯酶活性抑制能力來評(píng)價(jià)多肽。

鳳鱭(coiliamystus(1inaeus))，屬鯡形目，鯤科，鱭屬，稱為鳳尾魚、肉鱭等。鳳尾魚多用于制作罐頭產(chǎn)品。其魚肉中含15～20％的蛋白質(zhì)，氨基酸組成合理，脂肪含量低，但局限于罐頭產(chǎn)品等附加值低，鑒于其產(chǎn)量穩(wěn)定、價(jià)格低廉，適宜開發(fā)新方向，因此如何充分開發(fā)利用鳳尾魚蛋白質(zhì)資源，提高其附加值，是魚肉蛋白資源綜合利用的重要環(huán)節(jié)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有改善記憶多肽純品制備困難的問題，本發(fā)明的首要目的在于提供一種具有改善記憶功效的多肽，其氨基酸序列為tyr-asn-glu。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述多肽的分離制備方法。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述多肽的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種多肽，其氨基酸序列為tyr-asn-glu,分子量為424.41da。

上述多肽的分離制備方法，包括如下步驟：

(1)將鳳尾魚去頭去內(nèi)臟，絞成肉糜，加水混合，加入占肉糜質(zhì)量0.5～1.2％的混合酶，在45～60℃下酶解6～10h后，滅酶，冷卻至室溫后，離心，過濾收集濾液，得到鳳尾魚酶解液；

步驟(1)所述的加水混合，水與肉糜的質(zhì)量比為(1～3):1；

步驟(1)所述的混合酶，由木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶組成；其中木瓜蛋白酶占肉糜質(zhì)量的0.2～0.5％，堿性蛋白酶占肉糜質(zhì)量的0.3～0.7％；所述的堿性蛋白酶優(yōu)選alcalase2.4l；

步驟(1)所述的滅酶是將反應(yīng)物在95℃下加熱15min；

步驟(1)所述的離心優(yōu)選在3500r/min轉(zhuǎn)速下離心10min；

(2)將鳳尾魚酶解液添加至sephadexg-25凝膠柱，用去離子水以0.5～1.5ml/min的流速進(jìn)行洗脫，檢測(cè)波長為220nm，收集各洗脫峰并測(cè)定其乙酰膽堿酯酶抑制活性，選取乙酰膽堿酯酶抑制活性最高的組分進(jìn)行下一步分離；

(3)采用反相高效液相色譜對(duì)步驟(2)選取的目標(biāo)組分進(jìn)一步純化，收集各洗脫峰并測(cè)定其乙酰膽堿酯酶抑制活性，乙酰膽堿酯酶抑制活性最高的組分即為本發(fā)明的多肽tyr-asn-glu；

步驟(3)所述的反相高效液相色譜優(yōu)選以下參數(shù)：waterse2695hplc，2998pda檢測(cè)器，色譜柱為xbridge^tmprepbeh130c18柱(10×150mm,5μm,waters，usa)，流動(dòng)相為a相和b相；a相是質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％的三氟乙酸超純水溶液，b相為甲醇；

洗脫程序?yàn)椋?-1min內(nèi)采用的流動(dòng)相中a與b體積比為(95:5)-(90:10)；1-35min內(nèi)采用的流動(dòng)相中a與b體積比為(95:5)-(60:40)或(90:10)-(70:30)；35-36min內(nèi)采用的流動(dòng)相中a與b體積比為60:40；36-40min內(nèi)采用的流動(dòng)相中a與b體積比為(60:40)-(95:5)或(60:40)-(90:10)，流速為1ml/min，檢測(cè)波長為220nm。

步驟(2)和(3)中所述的乙酰膽堿酯酶抑制活性的測(cè)定方法如下：

將25μl含有7.5mm的硫代碘代乙酰膽堿溶液、50μlhepes溶液(0.75mm)、125μl含有0.5％牛血清蛋白的二硫代二硝基苯甲酸(3mm，ph7.4)和50μl樣品(即各洗脫峰對(duì)應(yīng)組分)混合，37℃下孵育15min；然后向混合物中加入25μl乙酰膽堿酯酶(0.11u)，412nm處用酶標(biāo)儀檢測(cè)(15min)各組吸光值。ache抑制率計(jì)算公式如下：

ache抑制率(％)＝[1-(a樣品-a樣品空白)/(a對(duì)照-a對(duì)照空白)]×100％

其中，對(duì)照組為不加樣品加ache組，對(duì)照空白組為不加樣品不加ache組。

本發(fā)明的多肽可用于制備具有改善記憶功效的藥品、保健品或食品。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

(1)本發(fā)明所用原料為鳳尾魚，來源廣泛，價(jià)格低廉，目前鳳尾魚多用于制作魚罐頭，現(xiàn)在將其作為蛋白原料，開發(fā)改善記憶肽，可顯著提高鳳尾魚原料的附加值。

(2)本發(fā)明采用生物酶解技術(shù)及色譜分離技術(shù)制備出一種具有明顯改善記憶作用的蛋白肽，制備方法簡單可行，制得的產(chǎn)品純度高。

(3)本發(fā)明提供的改善記憶肽活性優(yōu)良，具有良好的乙酰膽堿酯酶抑制能力，可以作為功能性成分，用于保健品中。

(4)本發(fā)明提供的改善記憶肽為三肽產(chǎn)品，其肽分子量小，可被人體直接吸收。

(5)本發(fā)明通過化學(xué)合成對(duì)應(yīng)的改善記憶肽，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證效果與分離純化得到的新肽效果接近。

附圖說明

圖1為鳳尾魚酶解產(chǎn)物的sephadexg-25凝膠色譜分離洗脫曲線。

圖2為鳳尾魚酶解產(chǎn)物sephadexg-25凝膠色譜洗脫組分的乙酰膽堿酯酶抑制活性測(cè)定結(jié)果。

圖3為凝膠色譜目標(biāo)收集組分的反相高效液相色譜分離洗脫曲線。

圖4反相高效液相色譜分離洗脫組分的乙酰膽堿酯酶抑制活性測(cè)定結(jié)果。

圖5為改善記憶肽的氨基酸序列質(zhì)譜分析圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例

本發(fā)明多肽的分離制備方法，包括如下步驟：

(1)鳳尾魚去頭去內(nèi)臟，清洗干凈后，放入攪拌機(jī)中制成肉糜；加入肉糜質(zhì)量2倍的水，按肉糜質(zhì)量的0.5％添加蛋白酶(以魚肉肉糜的質(zhì)量為計(jì)算基準(zhǔn)，木瓜蛋白酶的加入量占0.25％，alcalase2.4l的加入量占0.25％)，在45℃下保溫酶解6h，然后在95℃溫度下加熱15min滅酶，冷卻至室溫后，在3500r/min下離心10min，收集上清液，得到鳳尾魚蛋白酶解液；

(2)將鳳尾魚蛋白酶解液用sephadexg-25凝膠柱進(jìn)行分離純化，用去離子水以0.5ml/min的流速進(jìn)行洗脫，檢測(cè)波長為220nm，共收集到6個(gè)組分，洗脫曲線見圖1，測(cè)定各洗脫峰對(duì)應(yīng)組分的乙酰膽堿酯酶抑制活性，結(jié)果見圖2，組分fr.4活性最高，然后收集組分fr.4，采用反相高效液相色譜法對(duì)改組分進(jìn)一步純化(waterse2695hplc，2998pda檢測(cè)器)，色譜柱為xbridge^tmprepbeh130c18柱(10×150mm,5μm,waters,usa)，流動(dòng)相為a相(0.1％的三氟乙酸超純水溶液)和b相(乙腈)，洗脫程序?yàn)椋?-1min內(nèi)a:b為90:10(體積比,下同),1-35min內(nèi)a:b為90:10-70:30，35-36min內(nèi)a:b為70:30，36-40min內(nèi)a:b為70:30-90:10，流速為1ml/min，檢測(cè)波長為220nm，共收集到10個(gè)峰，洗脫曲線見圖3，測(cè)定各洗脫峰對(duì)應(yīng)組分的乙酰膽堿酯酶抑制活性，結(jié)果見圖4，其中組分5活性最高，收集組分5，得到改善記憶肽。

(3)最后采用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定步驟(2)中獲得的改善記憶肽的氨基酸序列。結(jié)果見圖5，改善記憶肽的氨基酸序列為tyr-asn-glu。

本發(fā)明制備的改善記憶肽與腦活素(cerebrolysin)的乙酰膽堿酯酶抑制活性檢測(cè)結(jié)果如表1，并采用腦活素(cerebrolysin)作為對(duì)照，樣品及腦活素濃度為10mg/ml，結(jié)果如表1。

表1改善記憶肽及腦活素的乙酰膽堿酯酶抑制能力

注：改善記憶肽和腦活素檢測(cè)濃度為10mg/ml。

已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，腦力記憶下降受損多與膽堿能系統(tǒng)的紊亂有關(guān)。由表1可知本發(fā)明制備的改善記憶肽具有優(yōu)秀的乙酰膽堿酯酶抑制活性，具有潛在改善大腦膽堿能系統(tǒng)中乙酰膽的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)的作用，表明本發(fā)明提供的改善記憶肽具有較強(qiáng)的記憶改善功能，可用于藥品、保健品和食品等行業(yè)中。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。