本發明屬于多肽純化技術領域，具體地，本發明涉及一種成骨生長肽的純化方法。

背景技術：

成骨生長肽(Osteogenic Growth Peptide，OGP)是一種能促進骨細胞生長的14-氨基酸多肽，序列為Ala-Leu-Lys-Arg-Glu-Arg-Gly-Thr-Leu-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly，它通過作用于成骨細胞系的ROS、MC3T3、E1和NH3T3成纖維細胞，促進成骨細胞的活性，提高骨量，在骨質疏松癥和骨折的預防及治療方面有廣闊的應用前景。

OGP在大鼠骨質疏松模型的實驗研究結果表明，OGP的作用機理是通過成骨的增加來提高骨量峰值，減緩骨丟失，從而達到治療骨質疏松的效果。與目前臨床上使用的通過抑制破骨細胞活性來達到提高骨量的鮭魚降鈣素相比，其作用機制完全不同，具有顯著的優勢。

OGP作為治療骨質疏松癥的藥物時HPLC純度≥99％，然而通過合成得到的OGP粗品中含有很多雜質，需要進一步提純后才可以作為藥用。

技術實現要素：

本發明所要解決的技術問題在于克服現有成骨生長肽純化方法存在的缺點，提供一種成本低、純度高，適合產業化的成骨生長肽純化方法。

更具體來說，本發明通過如下技術方案實現的。

本發明提供了一種一種成骨生長肽的純化方法，包括：(1)粗純：將成骨生長肽粗品水溶液上樣至反相聚合物柱，用酸性流動相進行梯度洗脫，收集洗脫液并減壓濃縮得到濃縮液；(2)轉鹽：將步驟(1)得到的濃縮液上樣至弱陰離子交換柱，用醋酸洗脫，收集醋酸型成骨生長肽溶液，減壓濃縮與冷凍干燥得到成骨生長肽。

前述的純化方法，所述成骨生長肽粗品水溶液通過將成骨生長肽粗品溶解于水，超聲分散，用濾膜過濾并收集濾液來制備；優選地，成骨生長肽粗品與水的比率是(0.3g～5g):(5ml～100ml)。

前述的純化方法，所述反相聚合物柱是填料為F型SBC MCI GEI反相色譜填料的反相聚合物柱；優選地，所述F型SBC MCI GEI反相色譜填料的粒徑是30～50μm。

前述的純化方法，所述弱陰離子交換柱是填料為DEAE高流速瓊脂糖微球的弱陰離子交換柱；優選地，所述DEAE高流速瓊脂糖微球的粒徑是50～160μm。

前述的純化方法，所述酸性流動相由流動相A和流動相B組成；其中，流動相A是三氟乙酸-水溶液，流動相B是三氟乙酸-甲醇溶液；優選地，流動相A是0.1mol/L三氟乙酸-水溶液，流動相B是0.1mol/L三氟乙酸-甲醇溶液。

前述的純化方法，步驟(1)中，所述酸性流動相梯度選擇流動相A:流動相B由(90～85):(10～15)到(70～65):(30～35)。

前述的純化方法，步驟(1)中，所述酸性流動相梯度選擇0到15分鐘流動相A:流動相B由(90～95):(10～5)到(85～80):(15～20)，15到65分鐘流動相A:流動相B由(85～80):(15～20)到(70～65):(30～35)。

前述的純化方法，步驟(1)得到的濃縮液中成骨生長肽的含量是30～50mg/ml。

前述的純化方法，所述酸性流動相的流速是4ml/min，所述醋酸的流速是4ml/min。

前述的純化方法，上樣和洗脫時的柱溫為35-45℃，優選40℃。

采用本發明的技術方案，至少具有如下有益效果：

1.本發明方法打破了直接運用反相高效液相色譜法進行反復純化的傳統多肽純化方法，將反相聚合物柱與弱陰離子交換柱結合使用，先對成骨生長肽進行粗純，除去了大部分雜質，再用弱陰離子交換柱進行脫鹽，將三氟乙酸型成骨生長肽轉換成醋酸型成骨生長肽，并進一步純化了多肽，極大地提高了純化效率。

2.本發明方法節省了整個純化過程中流動相的成本，且純化工藝較為環保。本方法粗純過程中使用三氟乙酸-水溶液做流動相，用量少且價格低廉，對環境污染小。

3.本發明方法兩種柱子交替使用，有效地彌補了單一柱子難以完全分離粗肽中不同結構、不同化學性質的雜質，得到的成骨生長肽純度高(大于99％)，且收率高。

附圖說明

圖1是實施例1純化后的成骨生長肽的質譜圖。

圖2是實施例1純化后的成骨生長肽的色譜圖。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明并不限于這些實施例。除非另有說明，實施例中使用的原料和儀器均是商購獲得的，是本領域常規使用的儀器和原料，只要其能滿足實驗需要即可。

實施例1

溶樣：將0.3g固相合成的OGP粗品溶解于5ml水溶液中，超聲分散，待溶液完全溶解后用0.45μm濾膜過濾，收集濾液；

粗純：用反相聚合物柱對濾液進行粗純，填料是F型粒徑為30～50μm的SBC MCI GEI反相色譜填料(由成都科譜生物有限公司提供)的反相聚合物柱，柱子填裝體積為30mL，流動相A為0.1mol/L三氟乙酸-水溶液，流動相B為0.1mol/L的三氟乙酸-甲醇溶液，流速為4ml/min，柱溫為40℃，檢測波長為215nm，進樣前反相聚合物柱先用0.1mol/L三氟乙酸-水溶液平衡至電導率恒定不變，然后上樣，上樣量為0.3g，對樣品進行梯度洗脫純化，流動相梯度選擇0到15分鐘A:B由90:10到85:15，15到65分鐘A：B由85:15到70:30，收集粗純后的OGP溶液，將粗純后的OGP溶液在40℃減壓旋蒸濃縮，濃縮至OGP含量為30～50mg/mL后收集待用。

轉鹽：將粗純步驟得到的濃縮液用弱陰離子柱進行脫鹽，轉換成醋酸型的成骨生長肽，填料是50～160μm的DEAE高流速瓊脂糖微球(由西安交大保賽生物技術股份有限公司提供)柱子填裝體積為30mL，流動相為2％的醋酸，流速為4mL/min，柱溫為40℃，檢測波長為215nm，進樣前弱陰離子柱先用超純水平衡，平衡后上樣，上樣后用2％的醋酸洗脫。收集醋酸化的OGP溶液，將醋酸化的OGP溶液在40℃減壓旋蒸濃縮，冷凍干燥，得到純度大于99％的OGP，OGP的純化收率為72％。其質譜表征結果見圖1，色譜圖見圖2。

實施例2

溶樣：將1g固相合成的OGP粗品溶解于50ml水溶液中，超聲分散，待溶液完全溶解后用0.45μm濾膜過濾，收集濾液；

粗純：用反相聚合物柱對濾液進行粗純，填料是F型粒徑為30～50μm的SBC MCI GEI反相色譜填料(由成都科譜生物有限公司提供)的反相聚合物柱，柱子填裝體積為30mL，流動相A為0.1mol/L三氟乙酸-水溶液，流動相B為0.1mol/L的三氟乙酸-甲醇溶液，流速為4ml/min，柱溫為40℃，檢測波長為215nm，進樣前反相聚合物柱先用0.1mol/L三氟乙酸-水溶液平衡至電導率恒定不變，然后上樣，上樣量為1g，對樣品進行梯度洗脫純化，流動相梯度選擇0到15分鐘A:B由90:10到85:15，15到65分鐘A：B由85:15到70:30，收集粗純后的OGP溶液，將粗純后的OGP溶液在40℃減壓旋蒸濃縮，濃縮至OGP含量為30～50mg/mL后收集待用。

轉鹽：將粗純步驟得到的濃縮液用弱陰離子柱進行脫鹽，轉換成醋酸型的成骨生長肽，填料是50～160μm的DEAE高流速瓊脂糖微球(由西安交大保賽生物技術股份有限公司提供)柱子填裝體積為30mL，流動相為2％的醋酸，流速為4mL/min，柱溫為40℃，檢測波長為215nm，進樣前弱陰離子柱先用超純水平衡，平衡后上樣，上樣后用2％的醋酸洗脫。收集醋酸化的OGP溶液，將醋酸化的OGP溶液在40℃減壓旋蒸濃縮，冷凍干燥，得到純度大于99％的OGP，OGP的純化收率為69％。

實施例3

溶樣：將1g固相合成的OGP粗品溶解于50ml水溶液中，超聲分散，待溶液完全溶解后用0.45μm濾膜過濾，收集濾液；

粗純：用反相聚合物柱對濾液進行粗純，填料是F型粒徑為30～50μm的SBC MCI GEI反相色譜填料(由成都科譜生物有限公司提供)的反相聚合物柱，柱子填裝體積為30mL，流動相A為0.1mol/L三氟乙酸-水溶液，流動相B為0.1mol/L的三氟乙酸-甲醇溶液，流速為4ml/min，柱溫為40℃，檢測波長為215nm，進樣前反相聚合物柱先用0.1mol/L三氟乙酸-水溶液平衡至電導率恒定不變，然后上樣，上樣量為1g，對樣品進行梯度洗脫純化，流動相梯度選擇0到15分鐘A:B由95:5到80:20，15到65分鐘A：B由80:20到65:35，收集粗純后的OGP溶液，將粗純后的OGP溶液在40℃減壓旋蒸濃縮，濃縮至OGP含量為30～50mg/mL后收集待用。

轉鹽：將粗純步驟得到的濃縮液用弱陰離子柱進行脫鹽，轉換成醋酸型的成骨生長肽，填料是50～160μm的DEAE高流速瓊脂糖微球(由西安交大保賽生物技術股份有限公司提供)柱子填裝體積為30mL，流動相為2％的醋酸，流速為4mL/min，柱溫為40℃，檢測波長為215nm，進樣前弱陰離子柱先用超純水平衡，平衡后上樣，上樣后用2％的醋酸洗脫。收集醋酸化的OGP溶液，將醋酸化的OGP溶液在40℃減壓旋蒸濃縮，冷凍干燥，得到純度大于95％的OGP，OGP的純化收率為73％。

實施例4

溶樣：將5g固相合成的OGP粗品溶解于100ml水溶液中，超聲分散，待溶液完全溶解后用0.45um濾膜過濾，收集濾液；

粗純：用反相聚合物柱對濾液進行粗純，填料是F型粒徑為30～50μm的SBC MCI GEI反相色譜填料(由成都科譜生物有限公司提供)的反相聚合物柱，柱子填裝體積為300mL，流動相A為0.1mol/L三氟乙酸-水溶液，流動相B為0.1mol/L的三氟乙酸-甲醇溶液，流速為4ml/min，柱溫為40℃，檢測波長為215nm，進樣前反相聚合物柱先用0.1mol/L三氟乙酸-水溶液平衡至電導率恒定不變，然后上樣，上樣量為5g，對樣品進行梯度洗脫純化，流動相梯度選擇0到15分鐘A:B由90:10到85:15，15到65分鐘A：B由85:15到70:30，收集粗純后的OGP溶液，將粗純后的OGP溶液在40℃減壓旋蒸濃縮，濃縮至OGP含量為30～50mg/mL后收集待用。

轉鹽：將粗純步驟得到的濃縮液用弱陰離子柱進行脫鹽，轉換成醋酸型的成骨生長肽，填料是50～160μm的DEAE高流速瓊脂糖微球(由西安交大保賽生物技術股份有限公司提供)柱子填裝體積為300mL，流動相為2％的醋酸，流速為4mL/min，柱溫為40℃，檢測波長為215nm，進樣前弱陰離子柱先用超純水平衡，平衡后上樣，上樣后用2％的醋酸洗脫。收集醋酸化的OGP溶液，將醋酸化的OGP溶液在40℃減壓旋蒸濃縮，冷凍干燥，得到純度大于99％的OGP，OGP的純化收率為65％。

最后，需要注意的是：以上列舉的僅是本發明的具體實施例，當然本領域的技術人員可以對本發明進行改動和變型，倘若這些修改和變型屬于本發明權利要求及其等同技術的范圍之內，均應認為是本發明的保護范圍。