技術領域：

本發明涉及生物技術領域，具體涉及涉及用于檢測意大利蜜蜂mrjp2基因表達的特異性引物，一種熒光定量pcr技術檢測意大利蜜蜂王漿主蛋白mrjp2基因表達的方法。

背景技術：
：

蜂王漿是由蜂群中青年工蜂頭部的咽下腺和上顎腺分泌而來，呈現為一種黏稠的乳漿狀物質，蜂王漿富含多種對機體有益的物質，其中蛋白質約占干質量的50％，包括水溶性蛋白質和水不溶性蛋白質。水溶性蛋白質占蜂王漿中總蛋白質含量的46％～89％，為蜂王漿蛋白質的主要部分，稱為蜂王漿主蛋白(majorroyaljellyproteins，mrjps)。

王漿主蛋白成分為一個蛋白質家族，迄今為止，研究人員已經發現10個成員(mrjp1～mrjp9和mrjpψ)，分子量在49-87kda，其中5種蛋白質，即mrjp1–mrjp5，占蜂王漿總蛋白的82％-90％。

mrjps作為蜂王漿中的主要活性成分，不僅具有促進細胞增殖、抑菌、抗氧化、抗疲勞等功效，還具有多種生物學功能，如參與決定蜂群中雌性蜂的級型分化，為幼蟲的發育提供必要的可利用氮元素，以及可能在蜜蜂行為調控中起作用等。但是mrjps中各個成員之間的功能不同，所以針對mrjps中單一組分的研究很有必要。

mrjps家族中，mrjp1和mrjp2是被研究比較全面的成員，二者含量約占蜂王漿總蛋白的47％。mrjp2是蛋白質家族的第2個成員，其在蜂王漿主蛋白中含量中等，為16％左右。mrjp2的分子量為49-52.7kda，等電點為6.2～7.9，屬于一種弱堿性糖蛋白。simúth等研究發現mrjp2可以刺激小鼠巨噬細胞釋放腫瘤壞死因子(tnf-α)，提出其抗癌應用的潛在生理價值。bíliková等研究發現mrjp2能夠抑制芽孢桿菌屬(paenibacialuslarvea)的生長，提示蜂王漿中功能蛋白組分mrjp2在藥物研究方面的應用前景。

我國是養蜂大國，蜂群數量和蜂產品產量、出口量均居世界第一，目前，中國蜂蜜年產量40多萬噸，占世界蜂蜜總產量1/4以上。近年來其質量安全問題多次曝光，已經受到政府部門和社會各界的高度重視和普遍關注。蜂產品質量安全隱患主要包括抗生素殘留、重金屬污染以及濫用添加劑等方面。其中，蜂產品中抗生素殘留問題較為嚴重。蜂產品抗生素殘留主要是蜂病防治過程中用藥不科學造成的，在意大利蜜蜂養殖過程中，蜜蜂常受白堊病的困擾，蜜蜂白堊病是由于蜂球菌危害引起的，給養蜂業造成很大威脅。蜂農常用苯菌靈藥物來防治蜜蜂白堊病。

苯菌靈別名為1-正丁胺基甲酰-苯并咪唑-2-氨基甲酸甲酯，是一種高效、低毒的廣譜殺菌物質，多應用于農業生產中病蟲害的防治工作，在使用和分析處理過程中，容易轉化為多菌靈，多菌靈屬于新型苯胺類苯并咪衍生物，化學性質穩定，降解半衰期較長，能持久地殘留在使用部位，易致累積效應對生態環境和人類健康造成威脅，若使用不當，可對生育能力、危害胎兒、損害遺傳基因，三項人體健康造成影響。

苯菌靈是防治蜂群白堊病的常用藥物，施藥期間對于蜂群所產蜂王漿的品質是否有影響，是關系蜂產品安全生產的大問題。通過觀測蜜蜂體內mrjps的表達水平，可以從一定的程度上反應蜂群所產蜂王漿的質量。本專利檢測的mrjp2在蜂王漿mrjps占有較大的比例，熒光定量pcr檢測飼喂苯菌靈前后蜂群體內mrjp2的相對表達水平，對于苯菌靈的藥物使用量，蜂產品的安全生產都具有重要的意義。

實時熒光rt-pcr技術是在常規pcr技術的基礎上發展起來的核酸定量技術。實時熒光rt-pcr不僅實現了常規pcr從定性到定量的飛躍，而且與常規pcr相比，實時熒光pcr技術由自動化儀器收集熒光信號，避免了肉眼判斷的主觀性，可進一步提高靈敏度；實時熒光rt-pcr技術全封閉反應，無須pcr后處理，避免污染，保證了結果的可靠性和重復性。目前，已廣泛應用于分子生物學和醫學研究等領域。隨著實時熒光rt-pcr試劑盒的進一步開發，近年來，實時熒光rt-pcr技術在動物生態防治中也得到了廣泛的應用。

技術實現要素：
：

本發明中意大利蜜蜂mrjp2實時熒光rt-pcr檢測方法的建立，為快速檢測蜂王漿品質建立了一個參考指標。研究飼喂抗生素對意大利蜜蜂體內mrjp2基因表達量的影響，研究結果不僅為探究意大利蜜蜂疾病的治療策略提供理論基礎，也為研究抗生素苯菌靈對蜂王漿的品質影響提供一定的參考，這對于意大利蜜蜂的疾病防治和蜂產品的安全都具有重要意義。

本發明的目的是公開一種熒光rt-pcr技術檢測意大利蜜蜂王漿主蛋白mrjp2基因表達的方法：

設計一種采用熒光定量pcr技術檢測意大利蜜蜂mrjp2基因表達的特異性引物，其特征在于包括符合熒光pcr反應特點的特異上下游引物：

mrjp2-f：5'-tcgcttctcacggtttgtatt-3'

mrjp2-r：5'-agtgattgatgctcgttccag-3'

本發明所述特異性引物快速檢測意大利蜜蜂mrjp2基因表達的方法，其特征在于按如下步驟進行：

(1)使用下述引物進行該基因的檢測：

符合熒光pcr反應特點的該序列特異上下游引物：

mrjp2-f：5'-tcgcttctcacggtttgtatt-3'

mrjp2-r：5'-agtgattgatgctcgttccag-3'

(2)總rna的提取：采用各種通用的rna提取方法，從意大利蜜蜂成體中提取總rna；

(3)cdna合成：以意大利蜜蜂總rna為模板合成cdna，反應體系為20μl；

(4)實時熒光pcr：以上述合成的cdna為模板，上述(1)中mrjp2-f和mrjp2-r、β-actin-f和β-actin-r為特異性引物，進行實時熒光pcr擴增反應，每個樣品設3個平行管，擴增后所得3個平行管的ct值取平均數。

(5)苯菌靈處理前后意大利蜜蜂mrjp2的相對表達量計算：

實時熒光pcr后，當目的基因與內參基因的擴增效率相近時，采用2^－δδct法計算苯菌靈處理前后mrjp2基因的相對表達量差異。

本發明所述的檢測方法，其中每條引物分別配制成濃度為100μm的貯存液，工作濃度為2μm。

本發明進一步公開了采用熒光rt-pcr技術檢測抗生素苯菌靈處理前后意大利蜜蜂mrjp2基因的相對表達量，旨在制備檢測抗菌肽mrjp2在意大利蜜蜂免疫系統調控中的作用。實驗結果表明：圖5為抗生素苯菌靈處理前后意大利蜜蜂mrjp2基因的相對表達量。從圖中看出，在苯菌靈脅迫的情況下，意大利蜜蜂體內的mrjp2的相對表達量呈下降的趨勢，這說明藥物苯菌靈對于蜂王漿內的mrjp2表達確實有影響。

本發明提供的特異性引物快速檢測意大利蜜蜂mrjp2基因表達的方法，與現有技術相比的有益效果是：

(1)本發明采用的實時熒光rt-pcr技術與常規pcr相比，實時熒光pcr技術由自動化儀器收集熒光信號，避免了肉眼判斷的主觀性，可進一步提高靈敏度；實時熒光pcr技術全封閉反應，無須pcr后處理，避免污染，保證了結果的可靠性和重復性。實時熒光rt-pcr技術也免除了常規pcr中的電泳、定量掃描等后續繁瑣步驟，大大縮短了實驗時間。

(2)在通過qrt-pcr的方法研究抗生素苯菌靈處理前后mrjp2基因表達的變化，結果顯示苯菌靈脅迫下意大利蜜蜂體內的mrjp2基因的表達水平下調，說明苯菌靈確實對蜜蜂體內mrjp2基因表達有影響。

(3)因此本發明研究結果可為探究意大利蜜蜂白堊病的治療策略提供理論基礎，這對于意大利蜜蜂的疾病防治具有重要意義。

說明書附圖：

圖1為內參基因β-actin擴增曲線；

圖2為內參基因β-actin溶解曲線；

圖3為mrjp2的擴增曲線；

圖4為mrjp2的溶解曲線；

圖5為抗生素苯菌靈處理前后意大利蜜蜂mrjp2基因的相對表達量。

具體實施方式：

為了使本發明實現的技術手段、創作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。

這里所述實施例的方案，不限制本發明，本領域的專業人員參照本發明的精神，可以對其進行改進和變化，所述的這些改進和變化都應視為在本發明的范圍內，本發明的范圍和實質由權利要求來限定；其中所用試劑均有市售。本發明中所述的意大利蜜蜂總rna的提取、cdna的合成、實時熒光rt-pcr等方法都是本領域成熟的技術，試劑盒等實驗藥品和試劑都可以從生產商家購買。

實施例1：

獲得意大利蜜蜂mrjp2基因序列

打開beebase(http://hymenopteragenome.org/beebase/)數據庫，在搜索欄輸入關鍵詞mrjp2，搜索到mrjp2一個結果。點擊mrjp2得到其beebase數據庫基因號為gb55212。點擊進入基因描述頁面，選中ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫的鏈接，進入ncbi，得到其基因編號為loc406091，ref-seq的mrna編號為nm_001011580.1，protein編號為np_001011580.1，即得到mrjp2的cds以及氨基酸序列。

實施例2：

意大利蜜蜂總rna的提取

選取2組(每組3個平行樣)健康的意大利蜜蜂進行抗生素對mrjp2表達量影響的探究實驗。實驗組三個蜂群依照苯菌靈藥物使用說明，飼喂一周。實驗組三個蜂群飼喂同量的糖水，飼喂一周。處理后選取適量的意蜂工蜂，并保存于-20℃冷凍。

(1)取10頭意蜂工蜂置于無菌研缽內，倒入液氮并迅速用研磨棒充分研磨，研磨后將粉末轉入1.5ml中，再加1000μlrnaisoplus溶液入離心管，靜置5min。

(2)將200μl氯仿加入離心管，劇烈振蕩5-10min，靜置5min。

(3)4℃下12000rpm離心10min，將上層無色水相轉入新無菌離心管中，加入500μl異丙醇，輕柔顛倒混勻，放置10min，12000rpm離心10min。

(4)小心倒掉管中液體，保留沉淀，加入1000μl75％乙醇洗滌沉淀。4℃下7500rpm離心5min，再重復一次乙醇洗滌沉淀操作。

(5)小心棄去上清液，室溫干燥2min。將rna沉淀溶于50μldepc水中。

(6)所得沉淀即為意蜂總rna，產物立即使用或冷凍保存于-80℃。

實施例3：

cdna的合成

以實施例2所述意大利蜜蜂總rna作為模板。取一消毒的0.2ml離心管，加入以下反應體系(20μl體系)：

(1)在冰浴的nuclease-freepcr管中加入以下試劑：rna按照800ng反轉。

(2)輕輕混勻后離心3～5s，反應混合物在65℃溫浴5min后，冰浴2min，然后離心3～5s。

(3)將試管冰浴，再加入下列試劑：

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thermoscientificribolockrnaseinhibitor(20u)0.5ul

revertaidpremiumreversetranscriptase(200u)31.0ul

(4)輕輕混勻后離心3～5s

(5)在pcr儀上按照下列條件進行反轉錄反應

①25℃孵育10min

②cdna合成50℃30min

③終止反應85℃5min，處理后，置于冰上放置。

(6)將上述溶液-20℃保存。

實施例4：

熒光定量pcr反應體系和條件

(1)引物設計：

根據所述意大利蜜蜂mrjp2-1基因的全長序列，使用primer5軟件設計適用于實時熒光rt-pcr檢測的特異性引物，引物序列如下：

mrjp2-f：5'-tcgcttctcacggtttgtatt-3'

mrjp2-r：5'-agtgattgatgctcgttccag-3'

pcr產物預計長度為199bp

同時，根據轉錄組數據庫里提供的意大利蜜蜂β-actin基因的cds序列設計用于實時熒光rt-pcr內對照的引物，引物序列如下：

β-actin-f：atgccaacactgtcctttctgg

β-actin-r：gacccaccaatccatacgga

pcr產物預計長度為135bp。

(2)實時熒光pcr：運用sybrgreen嵌合熒光法進行rt-pcr分析。使用cf96xpcr儀(bio-rad)進行pcr反應。以上述實施例3中合成的cdna為模板，使用mrjp2-f和mrjp2-r、β-actin-f和β-actin-r為特異性引物，進行實時熒光pcr擴增反應，每個樣品設3個平行管，擴增后所得3個平行管的ct值(即每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的反應循環數)取平均數。

實時熒光pcr擴增體系設置如下：

實驗樣本：將cdna樣品稀釋8倍作為模板上機檢測。

實時熒光pcr擴增參數設置如下：

儀器的操作

完成上述步驟后，把加好樣品的96孔板放在abisteponeplus型熒光定量pcr儀中進行反應。

抗生素苯菌靈處理前后意大利蜜蜂mrjp2基因的相對表達量的計算：當目的基因與內參基因的擴增效率相近時，采用2^－δδct法計算苯菌靈處理前后mrjp2基因的表達差異。

以上顯示和描述了本發明的基本原理和主要特征和本發明的優點。本行業的技術人員應該了解，本發明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發明的原理，在不脫離本發明精神和范圍的前提下，本發明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發明范圍內。本發明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物界定。

序列表

<110>安徽省農業科學院蠶桑研究所

<120>一種熒光定量pcr技術檢測意大利蜜蜂王漿主蛋白mrjp2基因表達的方法

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1359

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<213>意大利蜜蜂

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